辛芩顆粒聯(lián)合艾灸對(duì)過(guò)敏性鼻炎模型大鼠水通道蛋白的研究

黃振河 張克輝 游龍貴 王富華 王心濤

【摘要】 目的：探究辛芩顆粒聯(lián)合艾灸對(duì)過(guò)敏性鼻炎（AR）模型大鼠水通道蛋白表達(dá)的影響，為臨床治療AR提供更佳的方案。方法：選取SD大鼠60只，雌雄各半，適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后隨機(jī)分為對(duì)照組、AR組、西藥治療組、艾灸治療組，辛芩顆粒治療組，辛芩顆粒聯(lián)合艾灸治療組，每組10只，雌雄各半。對(duì)照組以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，AR組在造模成功后以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，西藥治療組采用西替利嗪滴劑灌胃處理，艾灸治療組采用艾灸治療，辛芩顆粒治療組采用辛芩顆粒灌胃處理，辛芩顆粒聯(lián)合艾灸治療組采用辛芩顆粒灌胃+艾灸治療。觀察各組小鼠的行為學(xué)指標(biāo)，比較各組小鼠鼻黏膜AQP1、AQP2及AQP5 mRNA表達(dá)水平及血清IL-4、IL-10和IgE水平。結(jié)果：造模成功時(shí)，AR組、西藥治療組、艾灸治療組、辛芩顆粒治療組、辛芩顆粒聯(lián)合艾灸治療組的行為學(xué)評(píng)分較造模前均顯著升高（P<0.05）;治療2周，西藥治療組、艾灸治療組、辛芩顆粒治療組、辛芩顆粒聯(lián)合艾灸治療組的行為學(xué)評(píng)分較造模成功時(shí)均顯著降低，且辛芩顆粒聯(lián)合艾灸治療組低于西藥治療組、艾灸治療組、辛芩顆粒治療組（P<0.05）。治療2周，艾灸治療組、辛芩顆粒治療組、辛芩顆粒聯(lián)合艾灸治療組的AQP1、AQP2、AQP5 mRNA表達(dá)水平均低于造模成功時(shí)（P<0.05）;治療2周，艾灸聯(lián)合辛芩顆粒治療組的AQP1、AQP2、AQP5 mRNA表達(dá)水平均低于其他治療組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。西藥治療組、艾灸治療組、辛芩顆粒治療組、辛芩顆粒聯(lián)合艾灸治療組血清IL-4、IL-10和IgE水平均較AR組改善（P<0.05）。結(jié)論：AR大鼠的鼻黏膜AQP1、AQP2及AQP5 mRNA表達(dá)水平高，通過(guò)辛芩顆粒聯(lián)合艾灸可有效控制AQP1、AQP2及AQP5 mRNA表達(dá)，降低IL-4、IgE水平，升高IL-10水平。

【關(guān)鍵詞】 辛芩顆粒 艾灸 AR 水通道蛋白

Study on Xinqin Granules Combined with Moxibustion on Aquaporin in Rats with Allergic Rhinitis/HUANG Zhenhe， ZHANG Kehui， YOU Longgui， WANG Fuhua， WANG Xintao. //Medical Innovation of China， 2021， 18（14）： 00-009

[Abstract] Objective： To explore the influence of Xinqin Granules combined with moxibustion on the expression of aquaporin in AR model rats， so as to provide a better treatment scheme for clinical treatment of AR. Method： A total of 60 SD rats， half male and half female， were selected and randomly divided into control group， AR group， western medicine treatment group， moxibustion treatment group， Xinqin Granules treatment group， and Xinqin Granules combined with moxibustion treatment group after adaptive feeding for 2 weeks， 10 rats in each group， half male， half female. Control group in a standard grain feed， AR after the success of the group in the building in a standard grain feed， western medicine treatment group treated with Cetirizine drops lavage treatment， moxibustion treatment group treated with moxibustion， Xinqin Granules treatment group used Xinqin Granules lavage treatment， Xinqin Granules combined moxibustion treatment group adopted Xinqin Granules lavage and moxibustion therapy. The behavioral indexes of mice in each group were observed， and the mRNA expression levels of AQP1， AQP2 and AQP5 in nasal mucosa and the serum levels of IL-4， IL-10 and IgE were compared. Result： When modeling was successful， the behavioral scores of AR group， western medicine treatment group， moxibustion treatment group， Xinqin Granules treatment group and Xinqin Granules combined with moxibustion treatment group were significantly higher than those before modeling （P<0.05）. 2 weeks of treatment， the behavioral scores of the western medicine treatment group， the moxibustion treatment group， the Xinqin Granule treatment group and the Xinqin Granule combined with moxibustion treatment group were significantly decreased compared with the successful modeling， and the Xinqin Granule combined with moxibustion treatment group was lower than the western medicine treatment group， the moxibustion treatment group and the Xinqin Granule treatment group （P<0.05）. 2 weeks of treatment， the mRNA expression levels of AQP1， AQP2 and AQP5 in moxibustion treatment group， Xinqin Granules treatment group and Xinqin Granules combined with moxibustion treatment group were all lower than those in the successful membrane formation （P<0.05）. 2 weeks of treatment， the mRNA expression levels of AQP1， AQP2 and AQP5 in the moxibustion combined with Xinqin Granules treatment group were lower than those in the other treatment groups， the differences were statistically significant （P<0.05）. Serum IL-4， IL-10 and IgE levels in western medicine treatment group， moxibustion treatment group， Xinqin Granules treatment group and Xinqin Granules combined with moxibustion treatment group were all improved compared with AR group （P<0.05）. Conclusion： The mRNA expression levels of AQP1， AQP2 and AQP5 in nasal mucosa of AR rats are high. Xinqin Granules combined with moxibustion can effectively control the mRNA expressions of AQP1， AQP2 and AQP5， reduce the levels of IL-4 and IgE， and increase the level of IL-10.

[Key words] Xinqin Granules Moxibustion AR Aquaporin

First-authors address： Ganzhou Peoples Hospital， Ganzhou 341000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.14.002

過(guò)敏性鼻炎（allergic rhinitis， AR）是一種由免疫球蛋白E（immunity globulin-E， IgE）介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)性疾病，當(dāng)患者接觸到過(guò)敏原時(shí)會(huì)出現(xiàn)鼻子瘙癢、紅腫、打噴嚏及流清鼻涕等癥狀[1-4]。近年來(lái)AR發(fā)病率不斷升高，尤其以青壯年為主，嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量[5-6]。目前，AR的治療未取得理想效果，這主要與其發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明有著很大的關(guān)系。中醫(yī)認(rèn)為AR的發(fā)生主要與肺脾腎陽(yáng)氣虧虛，體質(zhì)特異，衛(wèi)外不固有關(guān)，而中醫(yī)理論認(rèn)為“肺開(kāi)竅于鼻，肺主通調(diào)水道”[7]，故筆者推測(cè)AR患者可能存在水液代謝障礙。水通道蛋白是一種可控制水進(jìn)出細(xì)胞的內(nèi)在膜蛋白，因此本研究探究辛芩顆粒聯(lián)合艾灸療法對(duì)AR的作用機(jī)制是否與影響其鼻黏膜水通道蛋白AQP1、AQP2及AQP5 mRNA的表達(dá)水平有關(guān)，為臨床治療AR提供療效更佳的方案。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 本實(shí)驗(yàn)起止時(shí)間為2018年10月-2020年10月，選取SD大鼠60只，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重（200±50）g，雌雄各半，以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料在屏障系統(tǒng)中適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，然后隨機(jī)分為對(duì)照組、AR組、西藥治療組、艾灸治療組，辛芩顆粒治療組，辛芩顆粒聯(lián)合艾灸治療組，每組10只，雌雄各半。

1.2 藥品和儀器 辛芩顆粒（生產(chǎn)廠家：上海中醫(yī)大藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z31020014，規(guī)格：5 g/袋）、鹽酸西替利嗪滴劑（生產(chǎn)廠家：香港澳美制藥廠，批準(zhǔn)文號(hào)：HC20150029，規(guī)則：10 mL︰0.1 g）、艾灸（武漢國(guó)灸科技開(kāi)發(fā)有限公司）、熒光定量PCR儀（美國(guó)賽默飛世爾Thermo公司）、紫外分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）。

1.3 過(guò)敏性鼻炎模型大鼠制備 用乙醚麻醉除對(duì)照組之外的所有大鼠，將抗原佐劑混懸液，抗原佐劑混懸液由卵白蛋白1 mg，氫氧化鋁凝膠（生產(chǎn)廠家：甘肅扶正藥業(yè)科技股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H62020818，規(guī)格：100 mL︰4 g）50 mL組成。分別注射于左右前肢（0.1 mL）和后肢跖部分（0.2 mL）進(jìn)行致敏。在初次致敏5 d后將0.5 mg卵白蛋白溶解于1 mL生理鹽水注入大鼠背部強(qiáng)化致敏，第7天開(kāi)始用1 mg/mL卵白蛋白滴鼻，10 μL/次，1次/d。大鼠出現(xiàn)鼻塞、流涕、噴嚏、抓鼻等癥狀即為造模成功。

1.4 方法

1.4.1 治療方法 （1）對(duì)照組以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng);（2）AR組造模成功后以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng);（3）西藥治療組在初次致敏第15天開(kāi)始以西替利嗪滴劑按0.9 mg/kg的量灌胃處理，1次/d;（4）艾灸治療組在初次致敏第15天開(kāi)始用艾針灸置于大鼠已脫毛的迎香穴上進(jìn)行艾灸治療，2枚/次，1次/d，每次持續(xù)8 h;（5）辛芩顆粒治療組按0.5 g/kg的量給予辛芩顆粒灌胃治療，3次/d;（6）辛芩顆粒聯(lián)合艾灸治療組結(jié)合（4）、（5）的方法進(jìn)行治療。以上治療時(shí)間均為2周。

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction， real-time qPCR） 取鼻呼吸區(qū)黏膜置于-180 ℃液氮罐中保存，取組織研磨后用Trizol抽提組織總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)，瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA的純度和完整性。照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（takara，Code No.RR036A）和SYBRPremix Ex TaqTM試劑盒說(shuō)明書分別合成cDNA及建立反應(yīng)體系：總體積20 μL，2 μL cDNA為模板擴(kuò)增，肌動(dòng)蛋白β-actin為內(nèi)參。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃，10 min;變性95 ℃，30 s;58 ℃，31 s;延伸72 ℃，30 s;40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，ABI7300 SDS Software自動(dòng)分析熒光信號(hào)并將其轉(zhuǎn)換CT值，以2-△△CT法計(jì)算目的基因與內(nèi)參基因熒光的比值。

1.5 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn) （1）行為學(xué)評(píng)分：①鼻癢：搔鼻1～5次為1分，6～10次為2分，11次及以上為3分;②噴嚏：1～5個(gè)為1分，6～10個(gè)為2分，11個(gè)及以上為3分;清涕：溢至鼻孔為1分，超出前鼻孔為2分，涕流滿面為3分，5分及以上即為造模成功。（2）血清IL-4、IL-10和IgE水平：腹主動(dòng)脈采血并分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay， Elisa）檢測(cè)血清IL-4、IL-10和IgE水平，試劑盒購(gòu)自亞諾法生技股份有限公司。（3）比較鼻黏膜AQP1、AQP2及AQP5 mRNA表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 24.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，兩組數(shù)據(jù)組間比較采用t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)組間比較采用單因素方差分析;計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)評(píng)分評(píng)定 造模前，各組行為學(xué)評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;造模成功時(shí)，對(duì)照組行為學(xué)評(píng)分與造模前比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;造模成功時(shí)，AR組、西藥治療組、艾灸治療組、辛芩顆粒治療組、辛芩顆粒聯(lián)合艾灸治療組的行為學(xué)評(píng)分較造模前均顯著升高（P<0.05）;治療2周，西藥治療組、艾灸治療組、辛芩顆粒治療組、辛芩顆粒聯(lián)合艾灸治療組的行為學(xué)評(píng)分較造模成功時(shí)均顯著降低，且辛芩顆粒聯(lián)合艾灸治療組低于西藥治療組、艾灸治療組、辛芩顆粒治療組（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 各組qPCR檢測(cè)水通道蛋白mRNA表達(dá)水平比較 造模成功時(shí)，AR組、西藥治療組、艾灸治療組、辛芩顆粒治療組、辛芩顆粒聯(lián)合艾灸治療組的AQP1、AQP2、AQP5 mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;治療2周，艾灸治療組、辛芩顆粒治療組、辛芩顆粒聯(lián)合艾灸治療組的AQP1、AQP2、AQP5 mRNA表達(dá)水平均低于造模成功時(shí)（P<0.05）;治療2周，艾灸聯(lián)合辛芩顆粒治療組的AQP1、AQP2、AQP5 mRNA表達(dá)水平均低于其他治療組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 各組治療2周血清IL-4、IL-10和IgE水平比較 治療2周，西藥治療組、艾灸治療組、辛芩顆粒治療組、辛芩顆粒聯(lián)合艾灸治療組血清IL-4、IL-10和IgE水平均較AR組改善（P<0.05），見(jiàn)表3。

3 討論

AR的發(fā)生主要與細(xì)胞因子、細(xì)胞間黏附分子-1及部分神經(jīng)肽的相互作用密切相關(guān)，變應(yīng)原刺激機(jī)體產(chǎn)生的特異性IgE抗體結(jié)合在鼻黏膜使其致敏，當(dāng)變應(yīng)原再次侵入時(shí)會(huì)導(dǎo)致一系列生化反應(yīng)[8-10]。臨床常采用血清IgE作為AR的診斷依據(jù)，本研究中各治療組IgE水平較AR組均顯著降低，且辛芩顆粒聯(lián)合艾灸治療組降低最多，接近對(duì)照組水平。變應(yīng)性鼻炎是Th2型細(xì)胞優(yōu)勢(shì)分化和Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5等過(guò)度表達(dá)引起的疾病，其發(fā)生與Th1和Th2型細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)間的平衡異常有關(guān)。很多既往文獻(xiàn)報(bào)道，變應(yīng)性鼻炎發(fā)生過(guò)程中，IL-4水平會(huì)顯著升高。本研究對(duì)AR大鼠進(jìn)行西藥、艾灸、辛芩顆粒及辛芩顆粒聯(lián)合艾灸進(jìn)行治療，經(jīng)治療后各組AR大鼠IL-4水平均降低。經(jīng)治療后，各治療組AR大鼠IL-10水平升高，IL-10是抑制體內(nèi)炎癥反應(yīng)的保護(hù)性因子，能調(diào)節(jié)免疫功能，是變應(yīng)性鼻炎發(fā)病中的一種抗炎因子，能夠緩解炎性癥狀，起到較好的治療作用。

生物體主要由水溶液組成，水溶液在細(xì)胞膜通道的進(jìn)出與細(xì)胞的多種功能有關(guān)。20世紀(jì)50年代中期，水通道被發(fā)現(xiàn)，并在80年代中期確認(rèn)具有吸收水分子功能的水通道蛋白就是水通道[11-15]。水通道蛋白維持機(jī)體液體轉(zhuǎn)運(yùn)平衡，其與多種疾病的發(fā)生有關(guān)，變應(yīng)性鼻炎的高分泌性可能就與其表達(dá)有關(guān)，因而研究水通道蛋白有助于臨床治療相關(guān)疾病[16]。

AQP5是一種存在于鼻黏膜中的水通道蛋白，有研究表明其與變應(yīng)性鼻炎時(shí)腺體過(guò)度分泌的病理過(guò)程有關(guān)，在AR個(gè)體內(nèi)有大量AQP5表達(dá)[17-19]。AQP1在鼻咽上皮下毛細(xì)血管表達(dá)豐富，可能會(huì)誘導(dǎo)內(nèi)淋巴生成增多而導(dǎo)致AR。AQP2在腎臟組織表達(dá)較多，參與水液代謝，與多種疾病的發(fā)生有著一定的關(guān)系[20]。本研究針對(duì)AQP1、AQP2、AQP5在AR大鼠中的表達(dá)情況進(jìn)行研究，治療2周，各治療組水通道蛋白表達(dá)水平較模型組均顯著降低，且艾灸聯(lián)合辛芩顆粒治療組更低，提示水通道蛋白在AR大鼠中高表達(dá)，參與了AR的病理過(guò)程，可通過(guò)艾灸聯(lián)合辛芩顆粒進(jìn)行治療。行為學(xué)評(píng)分顯示治療2周，辛芩顆粒聯(lián)合艾灸治療組評(píng)分降低最多，進(jìn)一步驗(yàn)證了辛芩顆粒聯(lián)合艾灸治療AR的效果。

綜上，水通道蛋白的表達(dá)水平與AR有一定的關(guān)系，可通過(guò)辛芩顆粒聯(lián)合艾灸進(jìn)行有效治療。

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（收稿日期：2021-03-15） （本文編輯：姬思雨）