關(guān)于溶菌酶含量測定方法的教學研究*

司鑫鑫，馬燕燕，馬衛(wèi)興

(江蘇海洋大學藥學院，江蘇 連云港 222005)

溶菌酶(lysozyme)是一種生物酶，屬于生物藥物，它是作用于微生物細胞壁的小分子堿性蛋白酶[1]，在生物體內(nèi)廣泛分布，具有抗細菌、病毒、真菌及腫瘤、促進組織修復(fù)、增強免疫力等多種生物活性作用，對組織無刺激性、無毒無害， 是一種性質(zhì)優(yōu)良的藥用酶，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域，已制成多種溶菌酶制劑，如溶菌酶腸溶片、溶菌酶含片、溶菌酶口腔藥膜、溶菌酶滴眼液，可用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔潰瘍、水痘、帶狀皰疹和扁平疣等的治療。溶菌酶含量測定是溶菌酶制劑質(zhì)量標準中重要的檢測項目，因此有必要從溶菌酶的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)討論溶菌酶的含量測定方法來源，為創(chuàng)新溶菌酶含量測定新方法提供創(chuàng)意。

1 吸光特性

溶菌酶是一種由多種氨基酸提供肽鏈結(jié)合的生物酶，其中含有芳香氨基酸，如苯丙氨酸、色氨酸等，芳香氨基酸具有紫外吸光特性，導致溶菌酶產(chǎn)生紫外光譜，利用這一吸光特性可建立紫外分光光度法測定溶菌酶含量的方法，如果在220～400 nm范圍內(nèi)進行紫外光譜掃描，會發(fā)現(xiàn)溶菌酶最大吸收波長在290 nm處，這樣根據(jù)溶菌酶在290 nm處的吸光度與其濃度制備標準曲線，溶菌酶濃度在50～250 mg/L范圍內(nèi)與其吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，用于溶菌酶制劑含量測定，方法簡單、結(jié)果更穩(wěn)定，無需復(fù)雜儀器，檢測費用較低，可操作性強[2]。

不同有機物具有不同的色譜行為，利用這一特性將含溶菌酶的樣品處理后建立經(jīng)過高效液相色譜分離-紫外檢測或熒光檢測測定溶菌酶的分析方法，所用色譜柱是反相苯基柱，以體積比為50:0.2:49.8的乙腈-三氟乙酸-水組成流動相A，以體積比為1:0.2:98.8的乙腈:三氟乙酸:水組成流動相B，進行進行梯度洗脫，通過保留時間定性、外標法定量，溶菌酶在5～60 mg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，用于分離檢測葡萄酒中溶菌酶含量，定量限為50 mg/L[3]。

2 配位特性

溶菌酶是一種由多種氨基酸通過肽鍵結(jié)合的生物酶，肽鍵具有配位特性，能與銅離子形成紫色配合物，這就是典型的雙縮脲反應(yīng)，雙縮脲反應(yīng)產(chǎn)生的紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，最大吸收波長位于540 nm，因此可利用溶菌酶的配位特性建立硫酸銅雙縮脲反應(yīng)可見分光光度測定溶菌酶的分析方法，用于溶菌酶的含量測定[4]。

3 還原特性

溶菌酶是一種有多種氨基酸通過肽鏈結(jié)合的生物酶，本質(zhì)上也是一種蛋白質(zhì)，其中包括有硫原子的半胱氨酸和胱氨酸，硫原子具有還原特性，因此溶菌酶具有還原特性。利用溶菌酶中含硫氨基酸的還原性，在堿性條件下將Cu2+還原成Cu+，Cu+與2分子的2,2-聯(lián)奎琳-4,4-二甲酸二鈉螯合生成在562 nm處具有最大吸收波長的紫色絡(luò)合物，吸光度和溶菌酶濃度在廣泛范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，這就是著名的BCA法測溶菌酶原理，以標準牛血清白蛋白作為溶菌酶的標準，其濃度在0～2000 mg/L范圍內(nèi)與其吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，可用于溶菌酶制劑含量測定[5]。

4 離子特性

溶菌酶是一種蛋白質(zhì)，是由許多氨基酸靠肽鍵組成的生物高分子，其氨基酸殘基具有特定等電點，溶菌酶在較高pH下羧基解離成為溶菌酶陰離子，溶菌酶在較低pH下氨基質(zhì)子化形成質(zhì)子化的溶菌酶陽離子，依據(jù)這一離子性質(zhì)可建立電泳技術(shù)定量檢測溶菌酶的方法，即利用溶菌酶的離子特性借助電泳過程將溶菌酶在電泳凝膠上與其它蛋白分離開來，用紅棕色的染料考馬斯亮藍G-250溶液在酸性條件中對溶菌酶所在位置進行離子締合顯色反應(yīng)形成藍色締合物，用凝膠成像儀獲取圖像，在一定范圍內(nèi)藍色隨溶菌酶含量升高而加深，對應(yīng)灰度值越大，用定量軟件分析圖像中溶菌酶條帶灰度值，根據(jù)標準曲線的回歸方程即可計算出溶菌酶含量，溶菌酶質(zhì)量在0～3.5 μg范圍內(nèi)與電泳條帶灰度之間呈現(xiàn)線性關(guān)系，適合于包含溶菌酶的多種蛋白質(zhì)成分復(fù)雜體系樣品分析[6]。

茜素紫是一種陰離子蒽醌類染料，能與質(zhì)子化的溶菌酶陽離子形成離子締合物引起強烈的共振光散射現(xiàn)象，在300～800 nm茜素紫或溶菌酶均無明顯吸收峰，兩者形成離子締合物導致在420 nm處產(chǎn)生強烈的共振光散射信號，其強度隨溶菌酶濃度的增加而增強，依此建立茜素紫共振光散射光譜測定溶菌酶含量的方法，溶菌酶標在2.0～30.0 mg/L范圍內(nèi)線性良好，用于測定人唾液中的溶菌酶含量，檢出限為0.43 mg/L[7]。

pH 5.0時Cd-Te量子點的熒光發(fā)射波長是530 nm，而羅丹明B的熒光發(fā)射波長是550 nm，兩者熒光光譜嚴重重疊，容易發(fā)生能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，因此在445 nm可見光激發(fā)下，當Cd-Te量子點與羅丹明B共存時Cd-Te量子點在530 nm處熒光強度下降而羅丹明B在550 nm處熒光強度上升，這是因為發(fā)生能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。當在此能量轉(zhuǎn)移體系中再加入溶菌酶時，由于羅丹明B陽離子與溶菌酶陰離子發(fā)生了離子締合導致羅丹明B在550 nm處熒光強度下降而Cd-Te量子點在530 nm處熒光強度上升，即溶菌酶的加入抑制了能量轉(zhuǎn)移，依此建立Cd-Te量子點羅丹明B熒光共振能量轉(zhuǎn)移測定溶菌酶含量的方法，溶菌酶的濃度與共振能量轉(zhuǎn)移效率降低值在2×10-7～8×10-6mol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢出限為2×10-8mol/L[8]。

5 吸附特性

溶菌酶具有可吸附性，可被多種材料吸附，如功能化碳納米管、Fe3O4/殼聚糖納米粒子等?；谌芫傅目晌叫?，可借助原子力顯微鏡，其微懸臂可吸附溶菌酶，利用AFM激光束檢測溶菌酶吸附前后的微懸臂形變程度，建立定量檢測溶菌酶的方法，溶菌酶濃度在0.01～100 μg/L范圍內(nèi)其濃度的對數(shù)值與微懸臂偏轉(zhuǎn)值呈良好的線性關(guān)系，檢出限5.0 μg/L[9]。

6 免疫特性

將溶菌酶視作抗原，應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本其含量，大致流程是，首先用溶菌酶抗體包被微孔板，向包被單抗的微孔中依次加入溶菌酶，再與堿性磷酸酶標記的溶菌酶抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后加底物對硝基苯磷酸鈉二乙醇胺顯色，顏色深淺和樣品中的溶菌酶含量呈正相關(guān)，依據(jù)這一免疫特性可開發(fā)出溶菌酶ELISA檢測試劑盒[10]。

7 酶活特性

溶菌酶是一種可破壞β-1,4糖苷鍵、水解細菌細胞壁中黏多糖的堿性酶，利用這種酶活特性建立溶菌酶的含量測定方法。如陽離子鋁酞菁是一種熒光染料，在610 nm光激發(fā)下產(chǎn)生發(fā)射波長位于683 nm，與陰離子黏多糖(肝素)發(fā)生聚集產(chǎn)生熒光猝滅現(xiàn)象，當溶菌酶存在并作為底物時，溶菌酶水解粘多糖，由于粘多糖減少導致體系熒光恢復(fù)，本質(zhì)上是釋放出了強熒光物質(zhì)鋁酞菁，這樣開發(fā)出鋁酞菁-黏多糖締合物熒光探針測定溶菌酶含量的方法，該反應(yīng)體系在683 nm處的熒光強度恢復(fù)值和溶菌酶濃度在0.2～2 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，檢出限為0.015 mg/L[11]。

8 裂解細菌特性

根據(jù)溶菌酶具有水解細菌細胞壁而使之裂解的特性，可設(shè)計多種基于酶活的含量測定法，一類是通過裂解細菌產(chǎn)生抑菌作用，包擴平板擴散法、瓊脂糖火箭電泳法、比濁法等；另一類是通過裂解細菌從而釋放出相關(guān)物質(zhì)，如染料或熒光物質(zhì)，包括比色測定法、熒光標記測定法等。

8.1 比濁法

以溶壁微球菌為底物，溶菌酶裂解底物導致細菌懸濁液變清，也就是濁度下降，實際測定中以吸光度代表濁度，建立比濁法測定溶菌酶含量，溶菌酶濃度0～50 mg/L內(nèi)與490 nm處的吸光度降低值呈現(xiàn)線性關(guān)系，用于測定血清、尿液里的溶菌酶，靈敏度達到0.5 mg/L以下[12]。

8.2 平板擴散法

制備混有底物細菌的瓊脂平板，加入溶菌酶，溶菌酶水解底物細菌可產(chǎn)生透明抑菌圈，測量抑菌圈直徑，繪制抑菌圈對酶濃度的標準曲線，便可測定樣品中溶菌酶的含量，該方法靈敏度為1.55 μg/mL[13]。

8.3 瓊脂糖火箭電泳法

在平板擴散法基礎(chǔ)上，結(jié)合電泳技術(shù)，使溶菌酶在電場中泳動，通過含有底物細菌的凝膠時，裂解細菌，形成透明火箭狀溶菌峰，溶菌酶濃度5.0～100.0 mg/L范圍內(nèi)與溶菌峰的高度呈現(xiàn)線性關(guān)系，用于測定唾液樣品中溶菌酶的含量，檢出限為1.25 mg/L[14]。

8.4 比色測定法

將溶菌酶和染色小球菌共孵育，溶菌酶水解細胞壁而使之裂解釋放出有色染料，用分光光度法比色測定所釋放的有色染料，其顏色深淺與溶菌酶濃度呈正比關(guān)系，用于測定樣品中溶菌酶含量[15]。

8.5 熒光標記測定法

以標記熒光素的溶壁微球菌細胞壁作為底物，溶菌酶水解溶壁微球菌，釋放出具有熒光的熒光素，其熒光強度與溶菌酶活性呈正相關(guān)關(guān)系，可用于測定樣品中的溶菌酶含量[16]。

9 結(jié) 語

溶菌酶具有多種特性，具有吸光特性、配位特性、還原特性、離子特性、吸附特性、免疫特性、酶活特性、裂解細菌特性等，通過對這些特性而建立溶菌酶分析方法的教學討論，為未來設(shè)計溶菌酶分析新方法提供創(chuàng)意思路。