一種基于苝酰亞胺雙離子型可視化熒光探針的合成及性質

張 曼,許曉娟,孫凌志

(1.南京工業(yè)大學 藥學院,江蘇 南京 211800;2.鹽城師范學院 藥學院,江蘇 鹽城 224007)

苝四羧酸二酰亞胺衍生物(PDIs)是一類重要的熒光材料[9],具有優(yōu)異的光穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性,發(fā)光效率高,光電性能優(yōu)異。在光子材料、光電器件和分子開關等領域都得到了廣泛的應用[10]。同時,因為它具有優(yōu)異的接受電子和高熒光量子產率的能力[11]，因此被廣泛用于傳感器設計,PDIs是能檢測各種化學物種(金屬離子、有機分子和生物大分子)的熒光傳感系統(tǒng)。由于其具有響應時間短、簡單操作而備受關注[12-13]。

在過去幾年中,越來越多被用于生理條件下重要的生物離子和分子熒光傳感化合物被開發(fā)出來[14]。Georgiev等[15]合成了一種新型的水溶性苝四羧酸二酰亞胺作為熒光pH探針,但是其pKa值為6.35±0.02,只能在生理范圍內進行pH測定,不能用于極酸性(pH<4)或極堿性(pH>10)環(huán)境下的雙功能熒光探針。而筆者選擇苝酰亞胺發(fā)色團作為新型探針中的熒光信號部分,在其酰亞胺位引入質子的識別基團吡啶,同時在其灣位引入苯氧基,降低電子躍遷能級,使該化合物的熒光發(fā)射范圍接近近紅外,以期使之有望成為裸眼可視化的pH探針。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苝-3,4,9,10-四羧酸二酐、2-(2氨基乙基)吡啶,純度98%,上海阿拉丁試劑有限公司;苯酚、氯磺酸,純度均為98%,其余試劑和溶劑均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。LDRX400 MHz核磁共振光譜儀,SolariX-70FT-MS型超高分辨質譜儀,美國Bruker公司;TripleTOF 5600+型高分辨質譜儀,加拿大AB SCIEX公司;UV-1800型紫外分光光度計,日本島津公司;Cary 20 Eclipse型熒光光譜儀,美國Varian公司;SQP型電子天平,德國賽多利斯科學儀器有限公司。

1.2 合成

1.2.1 5,6,12,13-四氯代苝四酸酐(化合物1)的合成

將苝-3,4,9,10-四羧酸二酐(5.05 g,12.76 mmol),I2(0.91 g,3.45 mmol)加入三口燒瓶,量取35 mL(0.50 mol)的氯磺酸緩慢滴加至三口瓶中,65 ℃加熱攪拌20 h。冷卻至室溫,將反應液緩慢倒入冰水中,大量橙紅色固體析出,過濾固體,并水洗至中性,干燥后得橙紅色粉末，即化合物16.41 g,產率95.2%。1H-NMR (400 MHz,Chloroform-d)δ8.75 (s,4H)。該固體無須純化可投入下一步反應。

1.2.2 5,6,12,13-四氯-2,9-雙(2-(2-吡啶基)乙基)苝二酰亞胺(化合物2)的合成

將化合物11.02 g,1.90 mmol),2-(2-氨基乙基)吡啶(0.50 g,4.20 mmol)在10 mLN,N-二甲基乙酰胺(DMA)和10 mL 二惡烷混合溶劑中120 ℃回流8 h。之后將反應液冷卻至室溫,加水析出深紅色固體,過濾固體并干燥,之后用硅膠柱層析法(二氯甲烷與甲醇體積比為20∶1)純化產物,得鮮紅色固體，即化合物21.08 g,產率77.9%。電噴霧質譜法ESI-MSm/z:得到C38H20Cl4N4O4質荷比理論值為736.023 9,實驗值為369.904 5，推測為[M+2H]2+。氫核磁共振1H-NMR (400 MHz,Chloroform-d)測得δ8.66 (s,4H),8.54 (d,J=4.8 Hz,2H),7.72-7.66 (m,2H),7.33 (d,J=7.7 Hz,2H),7.23-7.19 (m,2H),4.64 (t,J=7.4 Hz,4H),3.30 (t,J=7.3 Hz,4H)。

1.2.3 探針PDI-1的合成

公共藝術的主要特征是“公共性”。這種“公共性”主要體現在對空間的運用上和對空間所有者“受眾”的關注上?？臻g作為公共藝術表現的特殊“場”，是公共藝術存在的“物質”基礎，如何有效的研究空間、利用空間、充實空間、創(chuàng)造空間，是公共藝術實踐的重要手段。而作為空間所有者的“受眾”的審美需求與文化訴求，是公共藝術創(chuàng)作“精神”依托，如何更好地體現關注大眾、服務于大眾，是公共藝術實踐的終極目標。

將化合物2(0.20 g,0.27 mmol)、苯酚(0.21 g,2.16 mmol)、無水K2CO3(0.30 g,2.16 mmol)溶于N-甲基吡咯烷酮(NMP,20 mL)中,并在N2保護下90 ℃反應過夜,之后將反應液冷卻至室溫,加入至甲醇和質量分數5%檸檬酸水溶液(體積比為1∶1)的溶劑混合物中,以產生棕黑色沉淀。過濾固體并洗至中性,真空干燥,粗產物用硅膠柱層析法(二氯甲烷和甲醇的體積比為20∶1)純化,得深棕紅色固體0.15 g,產率58.4%。C62H40N4O8質荷比理論值為968.284 6,實驗值為494.151 15,推測為[M+H2O+2H]2+。1H-NMR (400 MHz,Chloroform-d):δ8.50 (d,J=5.0 Hz,2H),8.18 (s,4H),7.57 (td,J=7.7,1.9 Hz,2H),7.29～7.23 (m,8H),7.20 (td,J=7.8,1.1 Hz,2H),7.15～7.10 (m,4H),7.08 (m,2H),6.98～6.89 (m,8H),4.51 (t,J=7.5 Hz,4H),3.15 (t,J=7.5 Hz,4H)。核磁共振(13C-NMR) (Chloroform-d,100 MHz)得到δ163.12,158.70,155.83,155.32,149.39,136.42,132.84,129.98,124.60,123.25,122.58,121.53,120.55,120.09,119.96,119.62,40.38,36.39，具體合成步驟見圖1。

圖1 合成路線Fig.1 Synthetic route

1.3 光譜測定

在DMA中制備探針PDI-1母液(2.0×10-4mol/L),并逐級稀釋為終濃度為4.0 μmol/L的探針儲備液。同時用HCl和NaOH配備pH為1.0、2.0、3.0、4.0、10.0、11.0、12.0、13.0和14.0的溶液,并且通過改變兩種溶液的體積比來實現pH的梯度。將4.0 μmol/L的探針儲備液1.0 mL加入1.0 cm×1.0 cm×4.0 cm石英比色皿中，并用不同pH梯度的溶液稀釋至2.0 mL,得到不同pH條件下的樣品溶液(2.0 mol/L)。對于選擇性和干擾性實驗中所用到的陽離子(Cr3+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Li+、Ca2+、Al3+、Mn2+、K+、Mg2+、Co2+、Ba2+、Sn2+、Cd2+及Na+)和陰離子(Br-、Cl-、I-、F-、BH4-、ClO-、CH3O-、NO3-、NO2-、CH3COO-、S2O32-、HCO3-、CO32-、HPO42-、S2-及HSO3-)儲備液均由相應的鹽酸鹽或鈉鹽用超純水制備,濃度為1.0×10-2mol/L。將4.0 μmol/L的探針儲備液1.0 mL、離子儲備液2.0 μL加入石英比色皿中,用pH 2.0和13.0的溶液稀釋至2.0 mL,用熒光分光光度計獲得熒光發(fā)射光譜。紫外光譜中運用20 μmol/L的探針儲備液1.0 mL,加入1.0 mL不同pH的溶液,用紫外分光光度計測定。

2 結果與討論

2.1 合成結果

苝四酸酐在I2的催化下與氯磺酸發(fā)生氯化,定量生成化合物1,無須純化可直接進行下一步反應[16]。端位酸酐與氨基加熱縮合引入乙基吡啶,得到化合物2[17]。堿性條件下,與苯酚發(fā)生親核取代灣位的四氯反應得到PDI-1[18]。

2.2 PDI-1紫外可見吸收光譜

將PDI-1溶于DMA/H2O(體積比為1∶1)的混合溶劑中(濃度為20 μmol/L),分別測試酸性環(huán)境,中性環(huán)境和堿性環(huán)境的紫外吸收光譜,結果見圖2。由圖2可知:PDI-1類型分子紫外吸收一般有3個吸收峰,分別在435、520和560 nm(中性環(huán)境)。

圖2 PDI-1(20 μmol/L)在不同pH溶液中的紫外-可見吸收光譜Fig.2 UV-visible absorption spectrum of PDI-1 (20 μmol/L) in different pH solutions

PDI-1在酸性和在堿性環(huán)境中,吸收峰呈現出不同程度的移動。以A0-0為例,隨著酸性的增加,探針的紫外吸收從560 nm(中性純溶劑)紅移至570 nm(pH為1.0);另一方面,隨著pH的上升,探針該處的吸收逐步藍移至466 nm(pH為14.0),紫外吸收前后發(fā)生了94 nm的變化。端位吡啶上的氮原子由于孤對電子的存在,對酸性環(huán)境下的質子敏感,當氮原子質子化后,與酰亞胺的?；踉赢a生氫鍵作用,具有吸電子作用,端位鏈接的4個苯氧基通過n-π共軛改變了苝母核的電子云密度,表現為紫外吸收紅移。同時,隨著溶液中氫離子濃度的變化,探針分子與氫離子結合的分子形態(tài)也在變化,導致探針聚集狀態(tài)發(fā)生改變,所以也引起溶液的摩爾吸光系數的變化,導致pH 2.0和3.0時的吸收峰下降。而在堿性環(huán)境下,有可能是由于OH-與端位酰亞胺結合或其他反應,影響原有的共軛體系,造成了苝母核的紫外吸收藍移。

2.3 PDI-1的熒光發(fā)射光譜

基于探針分子設計,可預測分子對H+的響應。在激發(fā)波長490 nm,狹縫 5 nm下,對PDI-1(2.0 μmol/L,DMA與H2O體積比為1∶1)的溶液中進行H+離子熒光滴定,結果見圖3。如圖3(a)所示：隨著H+濃度的增加,在605 nm處熒光強度逐漸增強,溶液顏色從淡紫色變?yōu)榉奂t色,紫外下呈現紅色熒光,熒光強度的最大相差倍數超過10倍。在pH 2.2～3.2范圍內呈現良好的線性關系,線性方程為Y=2 118.1-634.49x,R2=0.993 9。根據Henderson-Hasselbach type方程[19]計算出探針PDI-1的pKa值為2.726。實驗結果表明:探針PDI-1可用熒光法對pH 2.2～3.2溶液中的H+定量檢測。

在加入NaOH溶液調節(jié)探針pH時,605 nm處的發(fā)射峰并沒有如預想地回到初始水平形成分子開關,而是發(fā)射峰藍移,在515 nm處形成了新的發(fā)射峰,并且隨堿性溶液的增多,發(fā)射峰強度也在增強,因此猜想該探針可能對OH-敏感。在激發(fā)波長440 nm,狹縫 3 nm下,對PDI-1(2 μmol/L,DMA和H2O的體積比為1∶1)的溶液中進行OH-離子熒光滴定，如圖3(c)所示。由圖3(c)可知：隨著OH-濃度的增加,515 nm處發(fā)射峰熒光強度逐漸增強,并且溶液顏色從淡紫色變?yōu)辄S色,紫外下發(fā)出強烈的黃色熒光,熒光強度的最大相差倍數超過30倍。在pH 11.4～13.2范圍內呈現良好的線性關系,線性方程為Y=55.941x-115.91,R2=0.992 5,根據上述公式計算改探針的pKb值為12.29。因此,探針PDI-1可作為H+和OH-離子的可視化定量型復合熒光探針。

圖3 PDI-1在不同pH溶液中的熒光發(fā)射光譜Fig.3 Fluorescence emission spectra of PDI-1 in different pH solutions

2.4 穩(wěn)定性實驗

為了進一步檢驗探針PDI-1對H+和OH-識別的穩(wěn)定性,分別進行了PDI-1識別H+及OH-離子的時間依賴性實驗。結果發(fā)現:探針在中性條件下的熒光光譜基本保持不變,表明PDI-1在實驗條件下具有良好的穩(wěn)定性。PDI-1在酸性環(huán)境中時,其在605 nm熒光強度迅速增強,并保持穩(wěn)定。PDI-1在堿性環(huán)境中時,其在515 nm處的熒光強度迅速升高,并不斷增強,在50 min內趨于穩(wěn)定并維持此發(fā)射強度，結果見圖4。

圖4 PDI-1對H+和OH-識別的穩(wěn)定性實驗Fig.4 Stability experiments of PDI-1 for recognition of hydrogen and hydroxide ions

2.5 選擇性實驗

為了評價PDI-1在復雜條件下作為pH復合探針的可行性,對PDI探針的專一性和抗干擾能力進行測試,結果見圖5。如圖5(a)所示：在探針溶液中,加入濃度為500倍(相對于探針濃度)的各種金屬陽離子的去離子水溶液后,只有在pH 2.0時，探針在605 nm處有熒光增強效果,表明探針對 H+有優(yōu)異的選擇性響應。得pH 2.0的2 μmol/L探針溶液中加入不同金屬陽離子(1 mmol/L)后,發(fā)現除Zn2+和Sn2+能夠引起微小的熒光增強以外，其他金屬陽離子幾乎不影響探針的熒光強度,表明該探針對 H+識別幾乎不受其他陽離子的干擾,表現出強抗干擾能力,可用于復雜環(huán)境的檢測。對于OH-的識別和抗干擾能力的檢測與H+相同,結果見圖5(c)。由圖5(c)可知:探針只有在pH 13.0時，在515 nm處有熒光增強效果,并且不受其他陰離子的影響,表明該探針也能夠專一性識別OH-并表現出強干擾能力。選擇性實驗結果表明：PDI-1能夠在復雜環(huán)境中專一性識別H+和OH-,為復合強酸強堿pH探針的開發(fā)奠定了實驗基礎。

圖5 PDI-1選擇性和抗干擾性實驗Fig.5 Effect of other cations or anions on PDI-1 recognition H+and OH-

2.6 識別機制

常見的苝酰亞胺的熒光發(fā)光機制是通過阻斷光誘導電子轉移(PET)機制[20]。端位基團對苝母核熒光團產生PET作用,探針熒光被淬滅,與陽離子(包括H+)結合后,PET過程被禁阻,熒光探針發(fā)射熒光，結果見圖6。最初推測是PET機制,即探針PDI-1端位上的吡啶中氮原子的孤對電子對H+的專屬識別,阻斷PET過程而發(fā)射熒光。但是存在問題:若PET機制是正確的,那么當PET過程被禁阻時,苝母核的紫外前后吸收變化不大,而在識別H+時,探針PDI-1紫外吸收變化明顯。因此,認為探針PDI-1不只是PET型熒光探針,也同時存在分子內電荷轉移(ICT)機制。

圖6 苝酰亞胺PET型熒光發(fā)光機制Fig.6 The mechanism of PET fluorescence of perylene imide

推測由于端位吡啶的存在,探針PDI-1對溶液中的質子具有較強的結合能力,結合后形成的質子化吡啶,吸電子能力增強,與酰亞胺的?；纬煞肿觾葰滏I,吸引灣位苯氧基取代基的電子,導致苝母核的電子云密度改變,基態(tài)與激發(fā)態(tài)能級差改變,紫外吸收峰發(fā)生位移,ICT增強,熒光發(fā)射波長紅移(圖7)。當溶液pH進一步降低時,化合物的質子化形態(tài)的濃度較大,溶液中會存在較多的質子,與分子間氫鍵競爭吸引灣位苯氧基取代基的電子,競爭性抑制了苝母核的電子云密度,導致紅移反而減少。

圖7 PDI-1對H+的識別機制Fig.7 The recognition mechanism of PDI-1 to H+

圖8 化合物3的熒光機制Fig.8 Fluorescence mechanism of compound 3

在探索PDI-1對溶液中的OH-的識別機制的同時,對模型化合物3-苝酰亞胺(化合物3)在堿性條件下發(fā)射熒光的機制做對照研究,結果見圖8。從圖8看出:化合物3是無灣位取代無端位取代的苝酰亞胺,在DMA/H2O(體積比為1∶ 1)的溶液中,幾乎不發(fā)熒光,加入堿性溶液后,發(fā)出很強的黃色熒光。由此推斷,OH-會奪走酰亞胺上的質子,形成酰亞胺負離子(化合物4和其共振結構化合物5),苝母核給電子能力減弱,原來的ICT也減弱而發(fā)出熒光。

從探針PDI-1的結構看出,PDI-1無酰亞胺質子,在堿性條件下不會發(fā)生類似的去質子化反應,而是OH-與酰亞胺結合可能得到化合物6或類似物,或反應生成含羧基和酰胺的物質(如化合物7),結果見圖9。由圖9可知:化合物6和7部分禁阻或完全禁阻ICT過程,導致苝母核基態(tài)和激發(fā)態(tài)能級變大,紫外吸收藍移,最大發(fā)射波長(515 nm)藍移[21-23]。

圖9 化合物6和化合物7Fig.9 Compounds 6 and 7

3 結論

本文成功地合成出吡啶乙基端位修飾的苯氧基，同時在基灣位修飾的苝酰亞胺探針分子PDI-1，通過對其光譜性質研究，發(fā)現化合物在不同pH下的吸收峰呈現不同程度的位移，并且能分別在極酸條件和極堿條件下高效識別H+和OH-，在實驗條件下具有良好的穩(wěn)定性和專一性，且對識別機制做出了初步探討。因此，該化合物有望成為復合強酸強堿的pH探針，筆者將對其機制和有關應用還在進一步研究中。