微生物制備L-蘋果酸的研究進(jìn)展

袁 愷，周衛(wèi)強(qiáng)，唐 堂，孫浩軒，楊 碩，彭 超，陳 博，盧宗梅，周 勇，李 義,3,周 哲,3，徐 晴，佟 毅,3

(1.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司 營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 老年?duì)I養(yǎng)食品研究北京市工程實(shí)驗(yàn)室，北京 102209；2.中糧生物科技股份有限公司，安徽 蚌埠 233010；3.玉米深加工國家工程研究中心，吉林 長春 130033；4.南京師范大學(xué) 食品與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210046)

L-蘋果酸(L-malic acid，L-羥基丁二酸)是細(xì)胞代謝途徑的必需中間物，也是一種重要的四碳二元羧酸，因其具有較好的酸度和口感，被廣泛用作食品、飲料行業(yè)的酸化劑和增味劑，更被認(rèn)為是傳統(tǒng)酸化劑檸檬酸的替代品。2004年，美國能源部將L-蘋果酸列為十二大基礎(chǔ)化學(xué)品之一。作為潛在的C4平臺化合物，L-蘋果酸又可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為多種用于紡織業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)領(lǐng)域的化學(xué)品[1]。L-蘋果酸全球市場需求量已經(jīng)達(dá)到6萬t，并且保持4%的年增長率，而L-蘋果酸的年產(chǎn)量僅為4萬t[2]。

目前工業(yè)上主要以苯為原料，通過化學(xué)合成法生產(chǎn)DL-蘋果酸，然后經(jīng)分離純化獲得L-蘋果酸。隨著公眾對全球變暖、環(huán)境污染和原油短缺的關(guān)注日益增加，通過微生物發(fā)酵法轉(zhuǎn)化可再生資源生產(chǎn)各類有機(jī)物已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化，而微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-蘋果酸仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。本文中，筆者從菌株種類和合成代謝途徑分析了微生物發(fā)酵產(chǎn)L-蘋果酸的優(yōu)勢，并分別從可再生資源菌株的獲得、外部環(huán)境脅迫條件、合成代謝途徑改造和轉(zhuǎn)運(yùn)能力提高4個(gè)方面詳細(xì)介紹了L-蘋果酸的優(yōu)化工藝，希望這些研究方法和改進(jìn)措施能夠?yàn)槲⑸锇l(fā)酵法合成L-蘋果酸的工業(yè)化提供理論指導(dǎo)。

1 微生物法產(chǎn)L-蘋果酸研究現(xiàn)狀

1.1 L-蘋果酸生產(chǎn)方式

L-蘋果酸的獲得方法主要有4種：直接提取法[3-4]、化學(xué)合成法[5]、酶轉(zhuǎn)化法[6]和直接利用微生物轉(zhuǎn)化糖質(zhì)或非糖質(zhì)原料的微生物發(fā)酵法[7]。由于這4種生產(chǎn)方式之間的優(yōu)劣差異(表1)，目前工業(yè)上主要以化學(xué)合成法和酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-蘋果酸。微生物發(fā)酵法成本低廉，依賴可再生資源，可以減少對石油儲備的依賴和CO2的排放，鑒于這些優(yōu)勢，國內(nèi)已有生物制造企業(yè)開始進(jìn)行嘗試，如安徽豐原年產(chǎn)3萬t L-蘋果酸的微生物發(fā)酵生產(chǎn)線正在建設(shè)中。

表1 L-蘋果酸不同生產(chǎn)方式的優(yōu)缺點(diǎn)

1.2 L-蘋果酸生產(chǎn)菌株

選擇合適的菌株是實(shí)現(xiàn)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-蘋果酸的基礎(chǔ)。細(xì)菌、酵母和絲狀真菌都可以用作微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-蘋果酸的開發(fā)平臺[8-9]。Zhang等[10]通過基因敲除將產(chǎn)琥珀酸的大腸桿菌KJ060改造成產(chǎn)L-蘋果酸大腸桿菌XZ658，發(fā)酵3 d后L-蘋果酸產(chǎn)量達(dá)到33.9 g/L。2008年，Zelle等[11]以釀酒酵母為平臺，過表達(dá)自身的丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶和異源表達(dá)裂殖酵母的蘋果酸通透酶將L-蘋果酸產(chǎn)量從出發(fā)菌株的12 g/L提高到59 g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)換率達(dá)到42%。

絲狀真菌作為“微生物工廠”，因其天然優(yōu)勢常被用于大規(guī)模生產(chǎn)工業(yè)酶、有機(jī)酸和抗生素等物質(zhì)。20世紀(jì)60年代，黃曲霉被發(fā)現(xiàn)可以用于合成L-蘋果酸，并且產(chǎn)量達(dá)到58.4 g/L[7]。Battat等[12]將L-蘋果酸發(fā)酵產(chǎn)量提高到113 g/L，產(chǎn)率約為0.59 g/(L·h)。盡管黃曲霉在生產(chǎn)L-蘋果酸上有巨大產(chǎn)量優(yōu)勢，但是因?yàn)槠渥陨頃铣芍掳┪镔|(zhì)黃曲霉毒素，所以無法滿足食品行業(yè)的要求[13-14]。于是被認(rèn)為是安全生產(chǎn)菌株[15]的黑曲霉和米曲霉受到關(guān)注。Knuf等[16]發(fā)現(xiàn)，野生型米曲霉NRRL 3485和NRRL 3488在正常情況下的L-蘋果酸合成產(chǎn)量分別能夠達(dá)到23.1和38.8 g/L，野生型米曲霉DSM1863的L-蘋果酸合成產(chǎn)量能夠達(dá)到43.47 g/L[17]。黑曲霉ATCC 9029、ATCC 9142和ATCC 10577同樣具有L-蘋果酸合成能力[18]。除了曲霉屬外，青霉屬的草酸青霉[19]、葡萄青霉[20-21]和菌核青霉[22]等也被發(fā)現(xiàn)可以用于L-蘋果酸生產(chǎn)。

與其他種類的微生物相比，曲霉屬微生物在 L-蘋果酸合成能力方面優(yōu)勢更大，而且曲霉屬微生物的基因序列注釋完整，轉(zhuǎn)化和基因敲除方法、誘變方法、高通量篩選方法成熟，有較好的底物適應(yīng)性和pH適應(yīng)性[23-24]。同時(shí)，它自身能夠表達(dá)水解生物質(zhì)的酶，實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素等廉價(jià)生物質(zhì)資源的高值化轉(zhuǎn)化[25]。此外，工業(yè)上已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了使用曲霉類微生物生產(chǎn)檸檬酸、α-淀粉酶的工藝開發(fā)，這為開發(fā)微生物產(chǎn)L-蘋果酸工藝奠定了基礎(chǔ)。

1.3 L-蘋果酸合成代謝途徑

分析L-蘋果酸的合成代謝途徑，為微生物發(fā)酵菌種的選擇和合成代謝途徑的改造提供了理論指導(dǎo)。L-蘋果酸合成代謝途徑主要有4條(圖1)。途徑1：草酰乙酸還原途徑。真菌中丙酮酸在丙酮酸羧化酶作用下轉(zhuǎn)化為草酰乙酸。細(xì)菌中磷酸烯醇式丙酮酸在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶作用下轉(zhuǎn)化為草酰乙酸，隨后草酰乙酸經(jīng)蘋果酸脫氫酶作用還原為L-蘋果酸。該途徑中生成草酰乙酸時(shí)會固定CO2[26]，所以每消耗1 mol葡萄糖生成L-蘋果酸的最大理論產(chǎn)量是2 mol。同時(shí)這條途徑還實(shí)現(xiàn)了能量ATP的守恒。途徑2：三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))途徑。草酰乙酸與乙酰CoA縮合生成檸檬酸后進(jìn)入TCA循環(huán)氧化生成L-蘋果酸。由于在該途徑中會有CO2釋放，所以通過這條途徑每消耗1 mol葡萄糖生成L-蘋果酸的最大理論產(chǎn)量為1 mol。途徑3：乙醛酸環(huán)形途徑。異檸檬酸在異檸檬酸裂解酶作用下生成乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和乙酰CoA在蘋果酸合酶作用下生成L-蘋果酸。由于需要丙酮酸氧化脫羧生成乙酰CoA，所以這條途徑每消耗1 mol葡萄糖生成L-蘋果酸的最大理論產(chǎn)量為1 mol。途徑4：涉及乙醛酸環(huán)形途徑酶的非環(huán)形途徑，此途徑需通過丙酮酸的轉(zhuǎn)化來補(bǔ)充草酰乙酸，所以每消耗1 mol葡萄糖生成L-蘋果酸最大理論產(chǎn)量為1.33 mol。

Glu—葡萄糖；G-6-P—6-磷酸葡萄糖；PEP—磷酸烯醇式丙酮酸；PA—丙酮酸；OAA—草酰乙酸；MA—L-蘋果酸；Acetyl-CoA—乙酰CoA；CA—檸檬酸；ISA—異檸檬酸；SA—琥珀酸；FA—富馬酸；GA—乙醛酸；PEPC—磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；PYC—丙酮酸羧化酶；MDH—蘋果酸脫氫酶；CS—檸檬酸合酶；ICL—異檸檬酸裂解酶；MS—蘋果酸合酶；FUM—富馬酸酶；C4T318—L-蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶；MAE1—L-蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶圖1 L-蘋果酸生物合成代謝途徑Fig.1 Biosynthesis pathways of L-malic acid

從理論產(chǎn)量和能量守恒方面考慮，途徑1最適用于L-蘋果酸的積累。在真菌、細(xì)菌中草酰乙酸的不同轉(zhuǎn)化途徑為后期L-蘋果酸合成代謝改造提供了理論指導(dǎo)；在途徑2中，L-蘋果酸的高濃度積累會造成琥珀酸、富馬酸等雜酸富集，不利于下游L-蘋果酸的分離純化；對于途徑3和途徑4，它們僅僅是微生物胞內(nèi)L-蘋果酸合成代謝的補(bǔ)充途徑。

2 微生物發(fā)酵法產(chǎn)L-蘋果酸研究策略

2.1 利用可再生資源生產(chǎn)L-蘋果酸

從依賴化石燃料轉(zhuǎn)向利用可再生資源，尤其是一些工業(yè)副產(chǎn)物，是實(shí)現(xiàn)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-蘋果酸的首要任務(wù)。例如，生物柴油行業(yè)主要副產(chǎn)物粗甘油在2020年達(dá)到450億L，其中甘油占比高達(dá)67%[27]。同樣，國內(nèi)生物燃料乙醇產(chǎn)能在2018年已經(jīng)達(dá)到320萬t，其生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物稀釜餾物中甘油成分占比達(dá)到17%。將粗甘油轉(zhuǎn)化為L-蘋果酸，不但有利于新能源的生產(chǎn)、減少化石燃料的使用，而且還可提高副產(chǎn)物的附屬價(jià)值[28-31]。Iyyappan等[32-33]通過適應(yīng)性進(jìn)化獲得的黑曲霉MTCC 281 mutant，在25 ℃條件下以未經(jīng)處理的粗甘油為底物發(fā)酵192 h，L-蘋果酸產(chǎn)量從出發(fā)菌株的70.32 g/L提高到92.64 g/L。West[18]則發(fā)現(xiàn)，黑曲霉ATCC 9142和10577可以直接利用稀釜餾物中的甘油成分生產(chǎn)L-蘋果酸，利用率超過95%。這表明來自工業(yè)的副產(chǎn)物粗甘油可以直接用于L-蘋果酸的微生物發(fā)酵生產(chǎn)，這必將大大降低L-蘋果酸的生產(chǎn)成本。

玉米是我國第一大糧食作物，年產(chǎn)量超過2.5億t，其中玉米粒已被完全開發(fā)為淀粉、纖維飼料、蛋白飼料及玉米胚芽油等商品，但是玉米秸稈、玉米芯等木質(zhì)纖維素資源豐富、利用度卻很低[34]，是微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-蘋果酸的理想原料。Deng等[35]直接利用粉碎的玉米秸稈作為發(fā)酵原料，通過嗜熱單胞菌發(fā)酵5 d后，L-蘋果酸產(chǎn)量達(dá)到21.47 g/L。玉米芯可以通過酸或酶水解成微生物可以利用的五碳糖或六碳糖，為了削弱玉米芯水解期間生成的糠醛、甲酸和乙酸等副產(chǎn)物對微生物的生長毒害作用，Zou等[36]采用適應(yīng)性進(jìn)化的方式提高了出芽短梗霉對玉米芯水解副產(chǎn)物的耐受性，經(jīng)過9批次發(fā)酵后，L-蘋果酸的產(chǎn)量和產(chǎn)率分別達(dá)到38.6 g/L和0.40 g/(L·h)，高于第一批的27.6 g/L和0.29 g/(L·h)。

通過菌株篩選或馴化獲得可以利用粗甘油、木質(zhì)纖維素等可再生資源的菌株，是實(shí)現(xiàn)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-蘋果酸工業(yè)化生產(chǎn)的第一步。在此基礎(chǔ)上，通過對發(fā)酵過程的優(yōu)化和對合成代謝途徑的改造，能夠再次提高L-蘋果酸的發(fā)酵產(chǎn)量。

2.2 利用外部環(huán)境脅迫積累L-蘋果酸

外部環(huán)境脅迫是所有微生物積累有機(jī)酸的常見方式，而控制氮源種類可以直接影響微生物碳通量流向。對出芽短梗霉而言，酵母粉有利于生物量的積累，(NH4)2SO4有利于L-蘋果酸積累[36]；而在嗜熱單孢菌中，酵母粉和(NH4)2SO4的效果恰恰相反[37]。Knuf等[16]發(fā)現(xiàn)在米曲霉NRRL 3488的基因序列中存在類似于酵母轉(zhuǎn)錄因子Msn2/4的結(jié)合位點(diǎn)，在不同氮源脅迫下，基因出現(xiàn)不同程度的表達(dá)，從而決定是否將碳通量導(dǎo)向L-蘋果酸的合成。這表明合適的氮源有利于L-蘋果酸的積累。

2.3 改造合成代謝途徑增強(qiáng)L-蘋果酸的積累

增強(qiáng)微生物體內(nèi)原有的L-蘋果酸合成代謝途徑是提高微生物生產(chǎn)能力的直接方法。Peleg等[41]通過13C示蹤法發(fā)現(xiàn)，曲霉主要通過草酰乙酸還原途徑積累L-蘋果酸，其中關(guān)鍵步驟是丙酮酸的羧化和草酰乙酸的還原[42]。在米曲霉NRRL 3488中，Brown等[43]和Liu等[44]過量表達(dá)丙酮酸羧化酶和蘋果酸脫氫酶，將兩者表達(dá)量分別提升了4.8倍和2.1倍，L-蘋果酸產(chǎn)量達(dá)到154 g/L，比出發(fā)菌株產(chǎn)量提高了26.23%，其中L-蘋果酸產(chǎn)率達(dá)到0.94 g/(L·h)，葡萄糖對L-蘋果酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大理論值的69%。

除了增強(qiáng)L-蘋果酸合成代謝途徑外，構(gòu)建新的合成代謝途徑同樣可以促進(jìn)L-蘋果酸積累。在途徑1中，真菌和細(xì)菌的草酰乙酸來源不同。嗜熱單孢菌muC缺少丙酮酸羧化酶，由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶負(fù)責(zé)將磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸，于是Deng等[35,45]將谷氨酸棒桿菌ATCC 13032中的pyc基因引入嗜熱單孢菌muC中，獲得可以同時(shí)表達(dá)丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的工程菌株嗜熱單孢菌muC-16，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過改造后的菌株L-蘋果酸產(chǎn)量達(dá)到62.76 g/L。與嗜熱單孢菌muC相反，米曲霉依靠丙酮酸羧化酶催化生成草酰乙酸[46]，于是Liu等[44]將細(xì)菌中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶引入到米曲霉NRRL 3488中，構(gòu)建了將磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸同時(shí)轉(zhuǎn)化為草酰乙酸的聯(lián)合途徑，解決了米曲霉NRRL 3488胞內(nèi)草酰乙酸濃度低的問題，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，L-蘋果酸產(chǎn)量提高至58.5 g/L，比出發(fā)菌株提高了38.3%。

在正常情況下，蘋果酸酶只具有催化L-蘋果轉(zhuǎn)化為丙酮酸的正向催化能力，而Dong等[47]發(fā)現(xiàn)來自擬南芥的蘋果酸酶具有微弱的催化丙酮酸生成L-蘋果酸的反向催化能力，并且L-蘋果酸的最大理論產(chǎn)量同樣為2 mol(式(1))。

(1)

Dong等[47]對來自擬南芥的蘋果酸酶進(jìn)行了定點(diǎn)突變，并在大腸桿菌中構(gòu)建了直接催化丙酮酸生成L-蘋果酸的新途徑，L-蘋果酸的終產(chǎn)量約為3.62 g/L，比出發(fā)菌株產(chǎn)量提高了83.7%。經(jīng)過分子手段[48]削弱胞內(nèi)L-蘋果酸向富馬酸的轉(zhuǎn)化和提高胞內(nèi)NADPH的供應(yīng)后，L-蘋果酸產(chǎn)量最終達(dá)到21.65 g/L。盡管經(jīng)過改造后L-蘋果酸產(chǎn)量依然無法和曲霉類微生物相比，但是這種對酶的改造工藝和在微生物體內(nèi)重新構(gòu)建新的合成代謝途徑的思路為菌株改造提供了新的改造方向(表2)。

表2 菌株合成代謝途徑改造

2.4 通過改善細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)能力提高L-蘋果酸的產(chǎn)量

在微生物發(fā)酵過程中，代謝物的積累往往會引起產(chǎn)物反饋抑制。在導(dǎo)致代謝產(chǎn)物無法大量積累的同時(shí)還會抑制細(xì)胞生長，甚至最終導(dǎo)致細(xì)胞破碎死亡[49]。細(xì)胞內(nèi)L-蘋果酸的積累會抑制TCA循環(huán)、糖酵解途徑和ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[17,44]，阻礙L-蘋果酸合成代謝的正向進(jìn)行和高濃度積累。

除簡單擴(kuò)散外[50]，酵母內(nèi)還存在負(fù)責(zé)L-蘋果酸分泌的二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MAE1[51-52]。Yang等[53]以炭曲霉ITEM 5010菌株為出發(fā)菌株考察二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對炭曲霉合成L-蘋果酸能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)炭曲霉ITEM 5010胞內(nèi)二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)量提高33倍時(shí)，L-蘋果酸的產(chǎn)量也從出發(fā)菌株的0.4 g/L提高到32 g/L。Liu等[44]同時(shí)在米曲霉NRRL 3488菌株中過量表達(dá)了自身和來自酵母的編碼二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因c4t318、mae1，在兩種二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白共同作用下，L-蘋果酸產(chǎn)量提高至89.5 g/L，比出發(fā)菌株產(chǎn)量提高了52.5%。這些結(jié)果都表明，可以通過提高生產(chǎn)菌株中二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)量，增加胞內(nèi)L-蘋果酸的胞外轉(zhuǎn)運(yùn)，碳通量持續(xù)流向L-蘋果酸合成，最終實(shí)現(xiàn)L-蘋果酸的高濃度積累。

除了提高ABC型蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)能力外，還可以通過提高細(xì)胞膜通透性促進(jìn)胞內(nèi)L-蘋果酸的胞外分泌來達(dá)到積累L-蘋果酸的目的。在其他微生物發(fā)酵中提高細(xì)胞膜通透性主要有兩個(gè)方法：一個(gè)是通過EDTA結(jié)合細(xì)胞外膜上彼此連接脂多糖的Ca2+和Mg2+，使脂多糖無法穩(wěn)定細(xì)胞外膜，從而提高細(xì)胞膜通透性[54]；第二個(gè)是通過在發(fā)酵液中添加Tween-80、Triton X-100等表面活性劑來抑制磷脂合成，造成細(xì)胞膜磷脂不足，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加[55]。

利用微生物生產(chǎn)聚L-蘋果酸，再水解成L-蘋果酸單體是這兩年新興的研究方向。首先，聚L-蘋果酸不會對細(xì)胞的代謝和生長產(chǎn)生負(fù)面影響，能夠?qū)崿F(xiàn)胞內(nèi)高濃度積累。其次，水解后的L-蘋果酸純度可以達(dá)到100%，減少了雜酸分離純化的工藝操作和成本支出[56-59]。例如，F(xiàn)eng等[57]利用細(xì)胞固定化后的出芽短梗霉CCTCC M2012223進(jìn)行發(fā)酵，聚L-蘋果酸產(chǎn)量約為123.7 g/L，水解后L-蘋果酸產(chǎn)量達(dá)到144.2 g/L，產(chǎn)率達(dá)到0.74 g/(L·h)。由此可見，采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)聚L-蘋果酸再水解成為L-蘋果酸單體為工業(yè)上獲得高產(chǎn)量、高純度的L-蘋果酸提供了可能性。

3 結(jié)論與展望

隨著環(huán)境污染加重、化石燃料消耗，化學(xué)合成法和酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-蘋果酸將逐漸被微生物發(fā)酵法替代。但是目前利用微生物發(fā)酵法產(chǎn)L-蘋果酸依然存在諸多障礙。例如：曲霉類微生物的人工載體穩(wěn)定性差、轉(zhuǎn)化率低、拷貝數(shù)低、表達(dá)水平低；發(fā)酵副產(chǎn)物中延胡索酸、富馬酸等雜酸多等。在實(shí)驗(yàn)室條件下，通過篩選或適應(yīng)性進(jìn)化獲得利用可再生資源的菌株、改造菌株原有的合成代謝途徑等方式提高L-蘋果酸發(fā)酵產(chǎn)量取得了一定成效，為加快實(shí)現(xiàn)微生物發(fā)酵法工業(yè)生產(chǎn)L-蘋果酸提供了參考。