微型DNA條形碼在水產(chǎn)類物種摻假檢測中的應(yīng)用

黃曼虹，熊 雄，袁方穎，操 敏，陸利霞,2，熊曉輝,2

(1.南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 211800；2.江蘇省食品安全快速檢測公共技術(shù)服務(wù)中心，江蘇 南京 211800)

隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活、文化水平的不斷提高，以低脂肪、高蛋白為主要特征的水產(chǎn)品已經(jīng)成為我國居民動(dòng)物蛋白攝入的主要來源之一，水產(chǎn)品消費(fèi)量不斷增大[1]。在水產(chǎn)品消費(fèi)量增長的同時(shí)，人們對水產(chǎn)品的質(zhì)量安全也提出了更高的要求，其中一個(gè)重要的方面就是對水產(chǎn)食品原料的生物種屬進(jìn)行準(zhǔn)確的標(biāo)識(shí)和鑒定。

水產(chǎn)類物種繁多，各種過敏原和含有天然毒素的有毒物種會(huì)給特定消費(fèi)群體的健康帶來嚴(yán)重威脅[2-3]。不同物種的營養(yǎng)價(jià)值、口感和價(jià)格等方面也存在巨大差異[4-5]，由此而產(chǎn)生的商業(yè)欺詐問題已經(jīng)受到人們的廣泛關(guān)注[6]。然而，由于不少商販缺乏專業(yè)的水產(chǎn)類物種分類知識(shí)以及市場缺乏對一些水產(chǎn)類物種命名的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，我國水產(chǎn)品市場上物種錯(cuò)標(biāo)現(xiàn)象不斷被曝光，如“真假鱈魚”事件[7]和“真假三文魚”事件[4]。此外，水產(chǎn)品物種摻假的問題并非我國獨(dú)有，在世界各國均被廣泛報(bào)道(表1)。

為了防止水產(chǎn)品物種摻假，建立一種快速高效的水產(chǎn)品物種鑒定技術(shù)迫在眉睫。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)法主要依賴于鑒定者的經(jīng)驗(yàn)，對于親緣關(guān)系近的物種鑒別難度較大[8]，而且被加工成魚片、魚丸和罐頭等產(chǎn)品后，水產(chǎn)類物種特有的形態(tài)學(xué)特征遭到破壞，無法對物種做出準(zhǔn)確鑒定。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基于DNA的PCR技術(shù)在水產(chǎn)類物種鑒定中得到運(yùn)用，已經(jīng)成為水產(chǎn)類物種摻假檢測的主要技術(shù)(表1)，其中最常見的一種就是標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼技術(shù)[5]。在食品加工中的高溫、高壓、反復(fù)凍融和酸堿變化等因素均會(huì)使DNA發(fā)生降解，與標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼(FDB，650 bp)相比，微型DNA條形碼(MDB，<350 bp)在深加工水產(chǎn)品物種檢測中具有更大的優(yōu)勢[9]。本文中，筆者綜述MDB的原理、操作及最新研究進(jìn)展，分析MDB在水產(chǎn)類物種摻假檢測中的應(yīng)用及規(guī)則，并對MDB的關(guān)鍵問題進(jìn)行初步探討。

表1 世界各國水產(chǎn)品摻假現(xiàn)狀

1 FDB檢測水產(chǎn)類物種摻假

FDB是由加拿大科學(xué)家Hebert等[34]在2003年首次提出的，其基本原理是利用一段較短的DNA標(biāo)準(zhǔn)序列的多態(tài)性來實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的物種鑒定。對動(dòng)物而言，一般為線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞單位Ⅰ基因(COⅠ)5’端的一段長約650 bp的片段。目前，F(xiàn)DB技術(shù)在水產(chǎn)類物種摻假檢測中得到了廣泛應(yīng)用(表1)。美國食品藥品監(jiān)督管理局將DNA條形碼納入魚類監(jiān)管百科全書(RFE)來進(jìn)行市場上魚類替代品的檢測[35]，巴西聯(lián)邦政府也將FDB作為全國范圍內(nèi)對加工水產(chǎn)品進(jìn)行常規(guī)和系統(tǒng)管理的標(biāo)準(zhǔn)鑒定方法[31]。

然而，隨著FDB研究的深入，研究者們發(fā)現(xiàn)其在實(shí)際應(yīng)用中也存在一些問題。如Xiong等[27]利用FDB對市售干制鱈魚樣品進(jìn)行物種鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)部分樣品無法成功擴(kuò)增出650 bp的FDB片段。除了干制品，Guardone等[36]發(fā)現(xiàn)魚類罐裝制品也無法擴(kuò)增出FDB片段。此外，Günther等[37]在魚糜、魚籽醬以及煙熏水產(chǎn)制品中均發(fā)現(xiàn)FDB擴(kuò)增失敗的現(xiàn)象。最新報(bào)道表明，烤鱈魚制品也無法成功擴(kuò)增出FDB片段，其失敗率可達(dá)24.2%[7]。

食品加工過程中的高溫、高壓、反復(fù)凍融和酸堿變化等因素導(dǎo)致的DNA降解被認(rèn)為是FDB擴(kuò)增失敗的主要因素[38]。Gryson等[39]認(rèn)為pH變化可導(dǎo)致DNA的降解。黃婭琳[40]研究發(fā)現(xiàn)高溫對DNA的降解和后續(xù)PCR擴(kuò)增有一定影響，特別是當(dāng)加熱溫度大于140 ℃、加熱時(shí)間超過80 min時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶明顯減弱。因此，篩選較短的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段(即MDB)并探討其對深加工食品進(jìn)行物種鑒定的可行性引起了人們的廣泛關(guān)注。如Günther等[37]設(shè)計(jì)新的通用引物以擴(kuò)增更短的線粒體COⅠ基因片段(約326 bp)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，16份FDB擴(kuò)增失敗的樣品均成功擴(kuò)增出326 bp的目標(biāo)基因片段，并且測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)該片段可成功鑒定相應(yīng)的物種。此外，Xiong等[7]利用一個(gè)更短的COⅠ基因片段(約192 bp)實(shí)現(xiàn)了對7份FDB技術(shù)擴(kuò)增失敗的市售烤鱈魚樣品的物種準(zhǔn)確鑒定。由此可見，MDB概念的提出給深加工魚肉制品中魚肉物種鑒定提供了新思路。

2 MDB檢測水產(chǎn)類物種摻假

2.1 MDB簡介

MDB是由加拿大Guelph大學(xué)Hajibabaei等[9]首次提出，該團(tuán)隊(duì)采用序列分析的方法從理論上證實(shí)了被分割的短片段序列與原DNA序列具有同等的物種鑒別能力。同時(shí)，該團(tuán)隊(duì)從已經(jīng)發(fā)生DNA降解的館藏標(biāo)本中成功擴(kuò)增出134 bp的目的基因片段，驗(yàn)證了該片段在哥斯達(dá)黎加地區(qū)寄生蜂物種鑒定中的可行性。在此基礎(chǔ)之上，其他學(xué)者對MDB的適宜長度進(jìn)行了深入研究，并提出條形碼長度大于100 bp就可以解決90%以上的物種鑒定問題，即100 bp序列長度就已包含可以進(jìn)行分類鑒定所需的DNA信息。根據(jù)這一結(jié)果，該研究團(tuán)隊(duì)基于COⅠ基因設(shè)計(jì)出能擴(kuò)增130 bp微型條形碼片段的通用引物，并對該引物的擴(kuò)增能力進(jìn)行檢驗(yàn)，得出該引物擴(kuò)增MDB的成功率比通常所用的擴(kuò)增FDB的成功率高。

MDB的應(yīng)用主要包括以下幾個(gè)流程(圖1)：①樣品的采集與處理；②DNA的提取和冷凍保藏；③設(shè)計(jì)引物對目的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選擇電泳條帶清晰單一產(chǎn)物；④PCR產(chǎn)物的純化與測序；⑤使用BioEdit軟件進(jìn)行序列修剪和比對；⑥將測序所得序列提交至NCBI或BOLD數(shù)據(jù)庫，獲取與目標(biāo)序列相似度>98%[15]的物種，以此確定樣品的物種。

圖1 MDB技術(shù)應(yīng)用流程Fig.1 Process of MDB application

就目前文獻(xiàn)來看，國內(nèi)外多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)就魚類MDB鑒定技術(shù)展開了相關(guān)研究(表1、2)。如Armani等[41]利用MDB對太湖銀魚、沙丁魚和鳳尾魚等魚類進(jìn)行物種鑒定。陳文炳等[42]利用MDB對美洲鰻、歐洲鰻和日本鰻進(jìn)行物種鑒定。此外，甲殼類動(dòng)物也可利用MDB技術(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定[43]。

盡管如此，關(guān)于FDB和MDB物種鑒定能力的比較仍在討論當(dāng)中。有部分學(xué)者認(rèn)為FDB的物種鑒定能力優(yōu)于MDB。如Guardone等[36]對意大利市場上277份水產(chǎn)品樣品調(diào)研發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DB可對55.1%的樣品進(jìn)行鑒定，顯著高于MDB(14.6%)。此外，Armani等[44]指出，降低片段長度會(huì)對條形碼的物種鑒定能力有負(fù)面影響。然而，Armani等[10]對壽司中魚類產(chǎn)品的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DB和MDB的物種鑒定能力相同。Shokralla等[45]基于COⅠ基因，篩選出了6個(gè)MDB片段(127～314 bp)，并利用96份魚類樣品對這些MDB片段的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，93.2%的魚類樣品可以在種或?qū)偎竭M(jìn)行鑒定，MDB可對88.6%的樣品進(jìn)行鑒定，遠(yuǎn)高于FDB(20.5%)。Labrador等[46]對菲律賓的39份沙丁魚樣品進(jìn)行抽查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FDB無法擴(kuò)增出序列片段，而MDB則可對64%的樣品進(jìn)行鑒定。由此可見：與FDB相比，MDB具有較高的物種鑒定能力。

MDB彌補(bǔ)了FDB由于DNA降解而導(dǎo)致鑒定失敗的缺點(diǎn)，有望成為替代FDB的水產(chǎn)類物種鑒定技術(shù)。然而，越來越多的研究證實(shí)，MDB的片段長度選擇以及目的基因篩選是影響其物種鑒定能力的重要因素。因此，進(jìn)行水產(chǎn)品鑒定時(shí)，MDB目標(biāo)片段的適宜長度以及目的基因的選取仍需進(jìn)一步研究。

2.2 MDB目標(biāo)片段的長度選擇

目標(biāo)片段的長度對MDB的物種鑒定能力具有重要的影響。一般而言，隨著目標(biāo)片段長度的縮短，其物種鑒定能力逐漸減弱。Meusnier等[47]對現(xiàn)有DNA條形碼數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行模擬計(jì)算，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)COⅠ基因片段長度大于100 bp時(shí)即可鑒定90%的物種，當(dāng)COⅠ基因片段長度大于250 bp時(shí)即可鑒定95%的物種。Pollack等[48]對基于COⅠ基因的兩對MDB片段進(jìn)行比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，長為226 bp的MDB片段(92%～94%)，其物種鑒定能力優(yōu)于長為208 bp的MDB片段(67%～90%)。Sultana等[49]提出，當(dāng)MDB的目標(biāo)片段長度≤150 bp時(shí)，目標(biāo)片段無法利用普通一代測序技術(shù)進(jìn)行成功測序；為此，該團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了長約295 bp的魚類通用MDB片段，并證實(shí)了該MDB片段可成功鑒定33種魚類。

然而，在水產(chǎn)品品種鑒定中，不同科研團(tuán)隊(duì)并未就MDB片段長度達(dá)成一致[32,41-45,47,49-55](表2)。

表2 用于水產(chǎn)類物種摻假檢測中的MDB片段

如Armani等[54]基于16S rRNA基因篩選了長為118 bp的MDB片段，并證明了該MDB片段可以準(zhǔn)確鑒定鯡科和鯖科的魚類品種。潘艷儀等[50]基于COⅠ基因篩選了長為136 bp的MDB片段，并利用克隆測序法獲得高質(zhì)量的測序結(jié)果，以此可對魚、蝦等11個(gè)肉類物種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。程鵬等[56]對三段長度分別為100、150和200 bp的魚類COⅠ序列進(jìn)行物種鑒定能力的比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)序列長度為100 bp時(shí)，其物種鑒定能力明顯減弱；基于此，該團(tuán)隊(duì)提出200 bp的MDB片段在魚類樣品鑒定中具有很高的準(zhǔn)確性。Shokralla等[45]基于COⅠ基因，篩選出了長為127、129、208、226、227和314 bp的6個(gè)MDB片段，研究發(fā)現(xiàn)其中長為226 bp的片段可對88.6%的魚類樣品進(jìn)行物種鑒定，遠(yuǎn)優(yōu)于其他的MDB片段。Günther等[37]利用基于COⅠ基因長為313 bp的MDB片段可對魚類、蝦類進(jìn)行物種鑒定。最新研究表明，基于16S rRNA長約313 bp的MDB片段也可對太湖銀魚、沙丁魚等魚類[41]以及十足目甲殼類[43]進(jìn)行物種鑒定。

2.3 MDB目的基因的篩選

一般而言，線粒體基因組和核基因組均可以作為MDB的目的基因。線粒體基因組具有結(jié)構(gòu)簡單、序列和組成比較保守、母系遺傳、無重組以及單拷貝等特點(diǎn)[57]。同時(shí)由于線粒體基因組的分子量比較小、進(jìn)化速度快，所以在物種鑒定的研究中經(jīng)常被選取為目的基因[58]。

目前，常用于水產(chǎn)類物種鑒定中的目的基因有COⅠ基因、16S rRNA基因和細(xì)胞色素b基因(Cytb)(圖2)。Mitchell等[32]基于COⅠ基因開發(fā)了一種微型DNA條形碼方法，可用于區(qū)分金槍魚罐頭中常見的物種。Spielmann等[43]分別選取16S rRNA和COⅠ基因?yàn)槟康幕?，對甲殼類?dòng)物進(jìn)行物種鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基于16S rRNA的條形碼測得序列質(zhì)量較低，鑒定甲殼類動(dòng)物最合適的目的基因是COⅠ基因。而Armani等[41]基于16S rRNA基因設(shè)計(jì)的FOR16spc和REV16spc引物對鱈魚、銀魚等的物種鑒定能力較強(qiáng)。之后，該團(tuán)隊(duì)繼續(xù)以16S rRNA為目的基因設(shè)計(jì)MDB，可對市售97%(207份)的鯡科等魚類物種樣品進(jìn)行成功鑒定[54]。同時(shí)，Sevilla等[55]設(shè)計(jì)的基于Cytb基因的MDB，可對硬骨魚綱200多種海洋魚類進(jìn)行物種鑒定。Fernandes等[51]基于Cytb基因設(shè)計(jì)的MDB可對99.3%的4種常見鱈魚進(jìn)行物種水平上的準(zhǔn)確鑒定。

圖2 微型DNA條形碼在目的基因中的位置Fig.2 Location of the mini DNA barcoding in the target genes

除此之外，基于核基因組的MDB也可對水產(chǎn)類物種進(jìn)行鑒定。Ma等[59]研究發(fā)現(xiàn)，以磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)為代表的核基因組，可成功應(yīng)用于對蝦總科的系統(tǒng)發(fā)育研究，為這些物種的分類提供了有力的工具。Tsang等[60]選取PEPCK基因?yàn)槟康幕驅(qū)讱ゎ悇?dòng)物進(jìn)行DNA擴(kuò)增，驗(yàn)證了PEPCK基因?qū)讱ゎ悇?dòng)物DNA樣品的高效性。

3 結(jié)論

目前，MDB彌補(bǔ)了FDB由于DNA降解而導(dǎo)致鑒定失敗的缺點(diǎn)，有望成為替代FDB的水產(chǎn)類物種摻假檢測技術(shù)。目標(biāo)片段的長度和目的基因的篩選對MDB技術(shù)的物種鑒定能力具有重要的影響。隨著目標(biāo)片段長度的縮短，MDB的物種鑒定能力逐漸減弱。此外，線粒體基因組和核基因組均可以作為MDB的目的基因。

然而，隨著對MDB研究的深入，研究者們逐漸發(fā)現(xiàn)了MDB的缺陷：第一，抑制劑或其他某些物質(zhì)的存在可能會(huì)導(dǎo)致DNA無法進(jìn)行擴(kuò)增從而使樣品鑒定失敗，而正常的魚糜加工物質(zhì)并不是失敗的原因；第二，數(shù)據(jù)庫中的序列不全，或者序列錯(cuò)誤導(dǎo)致了鑒定結(jié)果的錯(cuò)誤。由于BOLD和GenBank數(shù)據(jù)庫均為開放平臺(tái)，所有研究者均可提交序列，且數(shù)據(jù)庫自身并不會(huì)核對提交物種序列。MDB對于水產(chǎn)品的鑒定結(jié)果依賴于GenBank和BOLD數(shù)據(jù)庫的準(zhǔn)確性、規(guī)范性和完整性。因此，在利用FDB和MDB進(jìn)行物種鑒定時(shí)，可通過多次下載序列來對數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行核查。