羅布麻葉配方顆粒與傳統(tǒng)湯劑HPLC指紋圖譜的相關性

黃楊敏,沈治平,朱阿金,李 超

(濟川藥業(yè)集團有限公司,江蘇 泰興 225441)

羅布麻葉為夾竹桃科植物羅布麻ApocynumvenetumL.的干燥葉,具有平肝安神,清熱利水的功能,可用于肝陽眩暈,心悸失眠,浮腫尿少等癥[1]。現(xiàn)代研究表明[2-6]:羅布麻葉具有降血壓、降血脂、保肝及抗抑郁等明顯功效。其主要化學成分為黃酮類、鞣質類和有機酸類等[7]。本研究使用的羅布麻葉飲片來源于新疆地區(qū),而新疆是羅布麻葉的主產區(qū)[8]。

中藥配方顆粒是由單味中藥飲片經過水提、濃縮、干燥及制粒而成,經過中醫(yī)臨床配方后,供患者即沖即服的顆粒,這在很大程度上解決了傳統(tǒng)中藥煎煮復雜、不便攜帶且質量無保證的問題[9],但是我國對于中藥配方顆粒的生產仍處于試驗研究階段,無統(tǒng)一的質量標準,因而無法確定產品的質量優(yōu)劣。根據參考文獻[10]要求,中藥配方顆粒的原料、中間體和成品三者藥效物質的指紋或特征圖譜應保持一致性,并具有相關性。

但目前關于羅布麻葉的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜研究較多的是其藥材或提取物的指紋圖譜,而關于羅布麻葉配方顆粒的指紋圖譜較少,且目前還沒有對于羅布麻傳統(tǒng)湯劑與配方顆粒HPLC指紋圖譜相關性的研究報道。因此本研究利用HPLC法建立了羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑和配方顆粒的指紋圖譜,并對其相關性進行了評價,以期為羅布麻葉配方顆粒生產過程質量控制提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20AD型高效液相譜儀,色譜系統(tǒng)由DGU-20A5R型脫氣機、SPD-20A型紫外可見檢測器、S/L-20AHT UFLC型進樣裝置組成,日本島津制作社;XSE205DU型電子分析天平,上海梅特勒-托利多國際貿易有限公司;SY8200T型超聲儀,上海聲源超聲波儀器設備有限公司。

1.2 材料

1.2.1 對照品

金絲桃苷(批號:110753-201415,純度94.9%),槲皮苷(批號:100081-201610,純度90.6%),中國食品藥品檢定研究院。

1.2.2 樣品

羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑,批號:190414、190415和190416;羅布麻葉配方顆粒,批號:1907013、1908013和1908023,濟川藥業(yè)集團有限公司自制。

1.2.3 試劑

乙腈為色譜純,H2O為超純水,其余試劑均為分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件

Kromasil 100-5-C18,250 mm×4.6 mm，5 μm色譜柱;2 g/L 的H3PO4-乙腈溶液作為流動相,梯度洗脫程序見表1,其檢測波長為360 nm,柱溫為40 ℃,流速為1.0 mL/min,進樣體積為10 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.3.2 供試品溶液的制備

精密量取羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑5 mL或精密稱取配方顆粒0.5 g,置于具塞錐形瓶中,加體積分數50%乙醇溶液50 mL,稱質量,超聲處理60 min(功率200 W,頻率58 kHz),放冷,稱質量,用體積分數50%的乙醇溶液補足減損質量,搖勻,用0.45 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。

1.3.3 對照品溶液的制備

1)金絲桃苷對照品溶液的制備

精密稱取金絲桃苷對照品適量,用甲醇制備成1 mL含金絲桃苷36 μg的對照品溶液,即得。

2)槲皮苷對照品溶液的制備

精密稱取槲皮苷對照品適量,用甲醇制備成1 mL含槲皮苷1 mg的對照品溶液,即得。

1.3.4 方法學考察

1)耐用性試驗

取同一批次羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑,按1.3.2節(jié)中的方法制備供試品溶液,分別進行色譜柱、柱溫以及流速耐用性試驗。色譜柱包括:Kromasil 100-5-C18,250 mm×4.6 mm，5 μm;Agilent ZORBAX SB-Phenyl,250 mm×4.6 mm,5 μm;Phenomenex Luna C18100A,250 mm×4.6 mm,5 μm;Waters Xselect HSS T3,250×4.6 mm,5 μm;柱溫包括35、40及45 ℃;流速包括0.8、1.0及1.2 mL/min;其余色譜條件同1.3.1節(jié),測定HPLC色譜圖,計算相似度。

2)進樣精密度試驗

取同一批次羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑,按1.3.2節(jié)中的方法制備供試品溶液,按1.3.1節(jié)中的條件測定,連續(xù)進樣6次,測定HPLC色譜圖,計算相似度。

3)重復性試驗

取同一批次羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑,按1.3.2節(jié)中的方法平行制備6份供試品溶液,按1.3.1節(jié)中的條件分別進樣,測定HPLC色譜圖,計算相似度。

4)穩(wěn)定性試驗

取羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑,按1.3.2節(jié)中的方法制備供試品溶液,按1.3.1節(jié)中的條件分別于0、2、4、6、8、12、18、24和48 h進樣,測定HPLC色譜圖,計算相似度。

5)共有峰的辨識

取羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑,按1.3.2節(jié)中的方法制備供試品溶液,按2.3節(jié)中的方法制備對照品溶液,按1.3.1節(jié)中的條件分別進樣,測定HPLC色譜圖。

6)樣品的測定

分別取3批羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑、羅布麻葉配方顆粒,按1.3.2節(jié)中的方法制備供試品溶液,按1.3.1節(jié)中的條件分別進樣,測定HPLC色譜圖。

2 結果與討論

2.1 耐用性試驗結果

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012年版)[11]計算各條件下指紋圖譜的相似度。色譜柱耐用性試驗結果見表2。由表2可知：表中各數據表示此行此列所對應的兩種色譜柱之間的相似度。以第一行為例(從左至右)，Kromasil與Kromasil品牌結果之間的相似度為1.000，Kromasil與Agilent品牌結果之間的相似度為0.951，Kromasil與Phenomenex品牌之間的相似度為1.000，Kromasil與Waters品牌結果之間的相似度為1.000。綜上，4種色譜柱HPLC指紋圖譜相似度對比結果均大于0.950，表明各色譜柱耐用性良好。

表2 色譜柱耐用性相似度

柱溫耐用性試驗結果見表3。由表3可知：表中各數據表示此行此列所對應的兩種色譜柱溫度之間的相似度。以第一行為例(從左至右)，35與35 ℃條件下結果之間的相似度為1.000，35與40 ℃條件下結果之間的相似度為0.998，35與45 ℃條件下結果之間的相似度為1.000。綜上，表3中不同柱溫條件下HPLC指紋圖譜相似度對比結果均大于0.990，表明各柱溫耐用性良好。

表3 柱溫耐用性相似度

流速耐用性結果見表4。由表4可知：表中各數據表示此行此列所對應的兩種色譜柱溫度之間的相似度。以第一行為例(從左至右)，0.8 mL/min與0.8 mL/min條件下的流速結果之間的相似度對比結果為1.000，0.8 mL/min與1.0 mL/min條件下流速結果之間的相似度為1.000，0.8 mL/min與1.2 mL/min條件下流速結果之間的相似度對比結果為1.000。以上可知，流速HPLC指紋圖譜相似度為1.000。綜上， 表4中各流速面相比結果均良好。

表4 流速耐用性相似度

方法學試驗中,各耐用性試驗結果良好,其中色譜柱耐用性相似度偏低,但最低相似度仍能達到0.950,最后選擇了Kromasil 100-5-C18色譜柱,是因為此色譜柱分離度較好且無顯著拖尾現(xiàn)象;進樣精密度、重復性和穩(wěn)定性試驗的共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD值均小于3%,說明該種方法進樣精密度、重現(xiàn)性和48 h內穩(wěn)定性均良好。以上結果表明：該方法可被應用于羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑指紋圖譜。

在對羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑指紋譜圖摸索試驗中,首先對流動相的體系進行了考察,先考察了乙腈-水、甲醇-水兩個系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)甲醇-水系統(tǒng)分離效果不如乙腈-水系統(tǒng),考慮到羅布麻葉中含有黃酮類和酚類物質,在流動相中加入離子抑制劑來抑制酚羥基離子化[12],如醋酸、H3PO4和甲酸,結果表明：H3PO4-乙腈的分離效果最為理想。樣品檢測時采用PDA檢測器對供試品溶液進行全波長掃描,全面考察不同吸收波長的色譜圖,重點考察了256和360 nm處的譜圖特征,結果顯示：360 nm處色譜信息豐富,基線更加平穩(wěn),故選擇360 nm作為吸收波長。提取條件方面,考慮到便捷性采用超聲提取法。因羅布麻葉配方顆粒提取溶劑為H2O,故分別使用H2O、體積分數50%乙醇、體積分數75%乙醇、體積分數90%乙醇和相同濃度的甲醇進行提取,結果顯示：相同濃度甲醇與乙醇作為提取溶劑無顯著差異,考慮到甲醇具有毒性故選擇乙醇,且采用體積分數50%乙醇提取的色譜圖分離效果好,故選擇體積分數50%乙醇作為提取溶劑。

2.2 方法學驗證結果

2.2.1 進樣精密度試驗結果

進樣精密度試驗結果中,試驗共標定7個共有峰,以1號峰為參照峰,計算其余6個共有峰相對保留時間和相對峰面積的相對標準偏差(RSD)值,結果見表5和6。如表5所示：各峰相對保留時間RSD值均小于1.00%；如表6所示：各峰相對峰面積RSD值均小于1.00%,以上均說明該方法進樣精密度良好。

表5 進樣精密度試驗共有峰的相對保留時間

表6 進樣精密度試驗共有峰的相對峰面積

2.2.2 重復性試驗結果

重復性試驗結果中,試驗共標定7個共有峰,以1號峰為參照峰,計算其余6個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD值,結果見表7和8。如表7所示：各峰相對保留時間RSD值均小于1.00%。如表8所示：各峰相對峰面積RSD值均小于等于3.00%；以上均表明該方法重現(xiàn)性良好。

表7 重復性試驗共有峰的相對保留時間

表8 重復性試驗共有峰的相對峰面積

2.2.3 穩(wěn)定性試驗結果

穩(wěn)定性試驗結果中,試驗共標定7個共有峰,以1號峰為參照峰,計算其余6個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD值,結果見表9和10。如表9所示：各峰相對保留時間RSD均小于1.00%。如表10所示：各峰相對峰面積RSD均小于1.00%,以上均表明該方法48 h內穩(wěn)定性良好。

表9 穩(wěn)定性試驗共有峰的相對保留時間

表10 穩(wěn)定性試驗共有峰的相對峰面積

2.3 色譜峰的辨認結果

相同色譜條件下,金絲桃苷、槲皮苷與羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑指紋圖譜各色譜峰比較,發(fā)現(xiàn)羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑指紋圖譜中的1號峰、4號峰與金絲桃苷、槲皮苷保留時間吻合,故將羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑指紋圖譜中的1號峰、4號峰分別鑒定為金絲桃苷、槲皮苷，對比情況見圖1，這與《中國藥典》2015年版第一部中羅布麻葉的含量測定項為金絲桃苷相一致[13-14]。

圖1 羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑對照指紋圖譜Fig.1 Reference HPLC fingerprints of traditional decoction of Apocynum venetum leaves

現(xiàn)代研究表明,黃酮類化合物是羅布麻葉中最重要的活性成分,例如金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素和槲皮苷等。前期研究還發(fā)現(xiàn)[13-14]：羅布麻葉配方顆粒指紋圖譜中可以指認出槲皮素,但在羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑指紋圖譜中未出現(xiàn),原因可能是羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑濃度較低,物質含量少,未達到檢測限;羅布麻葉飲片指紋圖譜中指認出綠原酸,但在羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑和配方顆粒液相色譜圖中綠原酸對應的保留時間處有兩個峰疊加在一起,極有可能是羅布麻葉經過煎煮后與綠原酸結構相似的物質有所增加,具體情況仍有待進一步探討。

2.4 樣品的測定結果

將羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑和羅布麻葉配方顆粒HPLC指紋圖譜數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012年版)[11],比對后發(fā)現(xiàn),羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑的7個共有特征峰,在羅布麻葉配方顆粒中均有顯示,且通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012年版)[11],計算了各樣品共有色譜峰與標準模式中對應的色譜峰的相似度,發(fā)現(xiàn)對照指紋圖譜相似度均大于0.950。圖2為羅布麻葉配方顆粒與傳統(tǒng)湯劑指紋圖譜對比圖。由圖2可知：羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑的7個共有特征峰在羅布麻葉配方顆粒中均有顯示，說明羅布麻葉配方顆粒在生產過程中的主要物質種類與傳統(tǒng)湯劑相一致。表11為HPLC指紋圖譜相似度，由表11可知：通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012年版)[11]，計算了各樣品共有色譜峰與標準模式中對應的色譜峰相似度，發(fā)現(xiàn)各配方顆粒、傳統(tǒng)湯劑與對照指紋圖譜相似度均大于0.950。表格中的數據表示此行此列所對應的兩種物質之間的相似度，以第一行為例，前3個1.000分別為配方顆粒1與配方顆粒1、配方顆粒2、配方顆粒3結果之間的相似度，0.901為配方顆粒1與傳統(tǒng)湯劑1結果之間的相似度，0.926為配方顆粒1與傳統(tǒng)湯劑2結果之間的相似度，0.918為配方顆粒1與傳統(tǒng)湯劑3結果之間的相似度，0.981為配方顆粒1與對照指紋圖譜之間的相似度。

S1為1907013批羅布麻葉配方顆粒;S2為1908013批羅布麻葉配方顆粒;S3為1908023批羅布麻葉配方顆粒;S4為190414批傳統(tǒng)湯劑;S5為190415批傳統(tǒng)湯劑;S6為190416批傳統(tǒng)湯劑圖2 羅布麻葉配方顆粒與傳統(tǒng)湯劑指紋圖譜對比圖Fig.2 Comparison on HPLC fingerprints of formula granules and traditional decotion of Apocynum venetum leaves

表11 HPLC指紋圖譜相似度

3 結論

通過對羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑以及配方顆粒的HPLC指紋圖譜相關性進行研究,闡明了羅布麻葉配方顆粒在生產過程中與傳統(tǒng)湯劑的成分基本保持一致。本試驗將羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑和羅布麻葉配方顆粒的指紋圖譜通過系統(tǒng)處理后,發(fā)現(xiàn)對照指紋圖譜相似度大于0.950,說明羅布麻葉配方顆粒與羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑的相似度很高,且兩者均有相同的7個共有峰,因此能夠確定兩者成分基本保持一致,且具有良好的相關性,該HPLC指紋圖譜可應用于羅布麻葉配方顆粒生產過程,以監(jiān)控其質量變化,為羅布麻葉配方顆粒工業(yè)化生產提供了有關科學依據。