甜菜紅素噴霧干燥粉抗氧化活性及其咀嚼片的研制

劉琪龍，韓海霞，包曉瑋，鐘志明，馬 強(qiáng)

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】甜菜紅素(Betacyanin)是一種天然食用色素，廣泛存在于莧科、藜科、紫茉莉科、商陸科等多種植物中，屬于酮、醌類衍生物[1]。研究甜菜紅素噴霧干燥粉(Betacyanins spray-dried powder，BSP)抗氧化作用及其咀嚼片的研制，對紅甜菜作為功能保健食品開發(fā)利用有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Ashwini等[2]提出富含甜菜紅素的食品具有作為功能性食品的潛力。甜菜紅素在食品領(lǐng)域正式批準(zhǔn)使用[3]。Vidal[4]發(fā)現(xiàn)甜菜紅素可抑制前列腺素和白三烯的生成，表明其可有效滅活環(huán)氧化酶和脂氧化酶。甜菜紅素可有效緩解百草枯對大鼠造成的肝損傷和肺損傷間質(zhì)性肺炎[5,6]。Farabegoli等[7]發(fā)現(xiàn)甜菜紅素對CaCo-2腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用明顯增強(qiáng)。呂思潤等[8]研究發(fā)現(xiàn)，甜菜紅素使細(xì)胞中的CAT和SOD活性提高，且可修復(fù)因H2O2造成的細(xì)胞損傷。郝秀梅等[9]研究結(jié)果表明，紅甜菜水提物及其用X-5純化后的色素均有較強(qiáng)的抗氧化能力。【本研究切入點】甜菜紅素具有量好的抗氧化作用，但甜菜紅素類功能性食品鮮有報道。近年來，經(jīng)x-5純化的甜菜紅素具有抗氧化作用[8,9]，而實驗采用DEAE-52纖維素從紅甜菜提取液中提取分離制得甜菜紅素濃縮汁，再利用納濾和噴霧干燥技術(shù)將該濃縮汁制備成甜菜紅素噴霧干燥粉(Betacyaninspray-dried powder，BSP)[10]。研究BSP抗氧化活性及其咀嚼片的研制。【擬解決的關(guān)鍵問題】以BSP作為供試品，研究其體外抗氧化作用，并以其為原料，以木糖醇、甘露醇、麥芽糊精、微晶纖維素、山梨糖醇為輔料，采用濕法制粒壓片制備BSP咀嚼片，為紅甜菜作為功能保健食品開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 原料

甜菜紅素噴霧干燥粉(BSP)，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院包曉瑋副教授制備并提供，木糖醇、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、微晶纖維素、麥芽糊精、硬脂酸鎂等試劑均為市售國產(chǎn)食品級。

1.1.2 試劑

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(純度>97%，上海源葉生物科技有限公司)、2,2’-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺(ABTS)(純度>98%，上海源葉生物科技有限公司)；鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、無水乙醇、過硫酸鉀、雙氧水、硫酸亞鐵等試劑均為市售國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器

AL204-IC電子分析天平(梅特勒-托利多儀器，上海有限公司)，硬度測量儀(上海黃海藥檢儀器有限公司)，DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)，SX-4-10型箱式電阻爐控制箱(天津市泰斯特儀器有限責(zé)任公司)，ZWY-200D智城恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)，TG16-W型高速離心機(jī)(湘儀責(zé)任有限公司)，標(biāo)準(zhǔn)分樣篩(20、80目)(浙江上虞市標(biāo)準(zhǔn)分樣篩廠)，T-6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 方 法

1.2.1 BSP的制備

將紅甜菜粉碎，過濾，采用DEAE-52纖維素分離制備甜菜紅素提取液，經(jīng)納濾膜過濾，濃縮，所得甜菜紅素濃縮液的色價為1 150.5 /mL，利用噴霧干燥技術(shù)將該濃縮液制備成BSP，BSP含有甜菜紅苷0.97 mg/g、甜菜紅素0.02 mg/g、仙人掌黃素0.07 mg/g。

1.2.2 BSP抗氧化實驗1.2.2.1 DPPH自由基清除能力

參照任薇等[11]的方法稍作改進(jìn)，取2 mL濃度分別為40、80、160、320、640、1 280 μg/mL的BSP樣品，加入2 mL DPPH乙醇溶液(0.1 mmol/L)，混勻，避光，于受控溫度(25±2)℃下靜置30 min，于517 nm處測得吸光度，VC為陽性對照，按公式(1)進(jìn)行計算。

(1)

式中，A1：2 mL樣品液+2 mL DPPH乙醇溶液；

A2：2 mL樣品液+2 mL無水乙醇；

A0：2 mL DPPH+2 mL 75%乙醇溶液。

1.2.2.2 ABTS自由基清除能力

參考Li等[12]方法，取濃度分別為40、80、160、320、640、1 280 μg/mL的BSP樣品0.8 mL，加入3.2 mL ABTS工作液，混勻，避光，于受控溫度(25±2)℃下靜置6 min，在734 nm處測定其吸光度。以VC溶液作為陽性對照，按公式(2)進(jìn)行計算。

(2)

式中，A1：樣品液+ABTS溶液混合液；

A2：樣品液+蒸餾水；

A0：蒸餾水+ABTS溶液混合液

1.2.2.3 羥基自由基清除能力

參照廖國會等[13]的方法，取濃度分別為40、80、160、320、640、1 280 μg/mL的BSP樣品1 mL，加入硫酸亞鐵(1.5 mmo1/L)、雙氧水(9 mmol/L)和水楊酸(9 mmol/L)各l mL，混勻，置于搖床使其反應(yīng)(37℃，30 min)，于510 nm處測定吸光度；按公式(3)進(jìn)行計算。

(3)

式中，A1：1 mL樣品液+1 mL FeSO4+1 mL H2O2；

A2：1 mL樣品液+1 mL FeSO4+1 mL H2O；

A0：1 mL H2O+1 mL FeSO4+1 mL H2O2。

1.2.2.4 還原能力

參照Lee等[14]的方法，取40、80、160、320、640、1 280 μg/mL的BSP樣品、PBS(pH 6.6)和鐵氰化鉀(1%)各1 mL，混勻后，于水浴反應(yīng)(50℃，20 min)，冷卻后，加入1 mL三氯乙酸(10%)，離心(3 000 r/min，10 min)，取上清液2 mL，加入2 mL蒸餾水，0.4 mL六水氯化鐵(1%)，混勻，反應(yīng)10 min。蒸餾水作為空白對照，VC溶液作為陽性對照，700 nm處測定吸光度[15]。

1.2.3 BSP咀嚼片制備工藝1.2.3.1 工藝流程

木糖醇、甘露醇、麥芽糊精、微晶纖維素、山梨糖醇

↓

甜菜紅素→配料→制軟材→濕法制?！稍铩！鷫浩?/p>

↑

硬脂酸鎂

1.2.3.2 咀嚼片感官評分標(biāo)準(zhǔn)

感官評定小組由12名食品專業(yè)研究生組成，以咀嚼片的色澤、口感、外觀、質(zhì)地為評價指標(biāo)，分別對輔料比(木糖醇:甘露醇:麥芽糊精:微晶纖維素:山梨糖醇)、原料(BSP)與輔料比、檸檬酸添加量、硬脂酸鎂添加量、潤濕劑進(jìn)行單因素篩選，確定BSP咀嚼片的制備工藝。列出BSP咀嚼片感官評價標(biāo)準(zhǔn)[15]。表1

表1 BSP咀嚼片感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table1 Sensory scoring criteria for BSP

1.2.3.3 輔料比例對BSP咀嚼片感官評價

設(shè)定原料與輔料比為1∶2，硬脂酸鎂和檸檬酸添加量均為1%，輔料比例分別為4∶2∶1∶1∶1、4∶2∶2∶1∶1、4∶3∶2∶1∶1、4∶4∶3∶1∶1、4∶4∶1∶2∶2。制得BSP咀嚼片，進(jìn)行感官評定，確定輔料比例。

1.2.3.4 原料與輔料比例對咀嚼片感官評價

設(shè)定輔料比為4∶4∶3∶1∶1，硬脂酸鎂和檸檬酸添加量均為1%，原料與輔料比例分別為1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3，按“1.2.3.1”下方法制得BSP咀嚼片，進(jìn)行感官評定，確定原料與輔料比例。

1.2.3.5 檸檬酸添加量對BSP咀嚼片感官評價

咀嚼片的口味一般以甜味為主，微酸，入口有涼爽感為宜，檸檬酸為常用的矯味劑，可以改善咀嚼片口感。設(shè)定原料與輔料比為1∶2，輔料比為4∶4∶3∶1∶1，硬脂酸鎂添加量為1%，檸檬酸添加量分別為0、0.5%、1%、1.5%、2%，按“1.2.3.1”方法制得BSP咀嚼片，進(jìn)行感官評定，確定檸檬酸添加量。

1.2.3.6 硬脂酸鎂添加量對BSP咀嚼片感官評價

設(shè)定原料與輔料比為1∶2，輔料比為4∶4∶3∶1∶1，檸檬酸添加量為1%，硬脂酸鎂添加量分別為0、0.5%、1%、1.5%、2%，制得BSP咀嚼片，進(jìn)行感官評定，確定硬脂酸鎂添加量。

1.2.3.7 潤濕劑對BSP咀嚼片感官評價的影響

潤濕劑不具有粘性，但噴灑后可以誘發(fā)物料本身的粘性，方便制成軟材，選擇蒸餾水、50%乙醇、75%乙醇、無水乙醇作為潤濕劑，以軟材過篩情況、制粒效果和粘沖情況為指標(biāo)，確定最適潤濕劑。

1.3 數(shù)據(jù)處理

在實驗中測定抗氧化指標(biāo)時，對每個指標(biāo)至少進(jìn)行3次重復(fù)測定，使用Excel-2016軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行基礎(chǔ)處理，使用SPSS-20.0軟件分析試驗數(shù)據(jù)，進(jìn)行描述性統(tǒng)計。結(jié)果由Origin-2017軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 BSP抗氧化

2.1.1 對DPPH自由基的清除能力

研究表明，當(dāng)濃度在40～1 280 μg/mL，BSP對DPPH自由基的清除能力具有劑量依賴性，在40～320 μg/mL，BSP對DPPH清除率漲幅較大，BSP對DPPH清除率的IC50為109.65 μg/mL，VC為42.51 μg/mL。圖1

圖1 BSP對DPPH自由基的清除率Fig.1 Scavenging rate of DPPH radical by BSP

2.1.2 對ABTS自由基的清除能力

研究表明，當(dāng)濃度在40～1 280 μg/mL，BSP對ABTS自由基清除能力具有劑量依賴性，在40～320 μg/mL濃度，BSP對ABTS清除率呈線性增加，BSP對ABTS清除率的IC50為260.49 μg/mL，VC為78.54 μg/mL。圖2

圖2 BSP對ABTS自由基的清除率Fig.2 Scavenging rate of ABTS free radicals by BSP

2.1.3 對羥基自由基的清除能力

研究表明，當(dāng)濃度在40～1 280 μg/mL，BSP對羥基自由基的清除能力具有劑量依賴性，在40～320 μg/mL濃度范圍內(nèi)，BSP對羥基自由基清除能力快速增強(qiáng)，BSP清除羥基自由基的IC50為89.59 μg/mL，VC為95.93 μg/mL。圖3

圖3 BSP對羥基自由基的清除率Fig. 3 Scavenging rate of hydroxyl radical by BSP

2.1.4 BSP還原能力測定

研究表明，隨著濃度的增加，反應(yīng)體系的吸光度增大，BSP還原能力隨濃度增加而增強(qiáng)，表現(xiàn)出良好的量-效關(guān)系，在40～1 280 μg/mL濃度范圍內(nèi)，BSP和VC的還原力相當(dāng)。圖4

圖4 BSP還原能力Fig. 4 BSP reduction capacity

2.2 BSP咀嚼片制備工藝

2.2.1 輔料比例對BSP咀嚼片感官評價的影響

研究表明，隨著輔料比例(木糖醇∶甘露醇∶麥芽糊精∶微晶纖維素∶山梨糖醇)的變化，BSP咀嚼片的感官評分呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)輔料比例為4∶2∶1∶1∶1時，因麥芽糊精和甘露醇占比較少，導(dǎo)致BSP咀嚼片粉粒感較大且甜度較小，當(dāng)輔料比例為4∶4∶3∶1∶1時，BSP咀嚼片的色澤均勻，無雜質(zhì)，甜度適中，外觀光潔平整，質(zhì)地良好，當(dāng)輔料比例為4∶4∶1∶2∶2時，BSP咀嚼片有粘牙感，選用輔料比例為4∶4∶3∶1∶1。圖5

圖5 不同輔料比例下BSP咀嚼片感官評價Fig.5 Effect of excipient ratio on sensory evaluation of BSP chewable tablets

2.2.2 原料與輔料比對咀嚼片感官評價的影響

研究表明，隨著原料(BSP)與輔料比例的變化，BSP咀嚼片感官評分呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當(dāng)原料與輔料比例為1∶1時，BSP咀嚼片味道偏淡，當(dāng)原料與輔料比例為1∶2時，BSP咀嚼片呈紫紅色，色澤均勻且紅甜菜風(fēng)味突出，當(dāng)原料與輔料比例為1∶3時，BSP咀嚼片甜度偏高且紅甜菜風(fēng)味不突出。原料與輔料比例為1∶2時較為合適。圖6

圖6 不同原料與輔料比下BSP咀嚼片感官評價Fig.6 Effect of raw material to adjuvant ratio on sensory evaluation of BSP chewable tablets

2.2.3 檸檬酸添加量對BSP咀嚼片感官評價的影響

研究表明，隨著檸檬酸添加量的增加，BSP咀嚼片的感官評分呈現(xiàn)先升后降的趨勢，當(dāng)檸檬酸添加量為0時，BSP咀嚼片甜度過高而發(fā)膩，使其口感不佳，當(dāng)檸檬酸添加量為1%時，BSP咀嚼片口感細(xì)膩，酸甜可口，當(dāng)檸檬酸添加量為2%時，BSP咀嚼片酸度較大，掩蓋了紅甜菜的風(fēng)味。檸檬酸添加量為1%較為合適。圖7

圖7 不同檸檬酸添加量下BSP咀嚼片感官評價Fig.7 Effect of citric acid addition on sensory evaluation of BSP chewable tablets

2.2.4 硬脂酸鎂添加量對BSP咀嚼片感官評價的影響

研究表明，隨著硬脂酸鎂添加量的增加，感官評分呈現(xiàn)先升后降的趨勢，當(dāng)其添加量小于1%時，物料粘性過小，制得BSP咀嚼片粉粒感明顯，從而使其口感不佳，當(dāng)硬脂酸鎂添加量為1.5%時，物料粘性良好，制得BSP咀嚼片無粉粒感，外觀光潔、無明顯裂痕，且硬度適中，當(dāng)硬脂酸鎂添加量為2%時，物料粘性大，制得BSP咀嚼片偏硬。硬脂酸鎂添加量為1.5%較為合適。圖8

圖8 不同硬脂酸鎂下BSP咀嚼片感官評價Fig.8 Effect of magnesium stearate on sensory evaluation of BSP chewable tablets

2.2.5 潤濕劑對BSP咀嚼片感官評價的影響

研究表明，物料與蒸餾水混合后，所得軟材質(zhì)粘性大，出現(xiàn)結(jié)塊現(xiàn)象，硬度較大，不易過篩；與50%乙醇混合后，所得軟材粘性較大，顆粒不均勻，過篩后顆粒大小不均勻；與75%乙醇混合后，所得軟材粘性適中，且過篩后顆粒均勻；與無水乙醇混合后，軟材粘性較小，過篩后顆粒均勻，但細(xì)粉過多，然而細(xì)粉過多會導(dǎo)致咀嚼片粉粒感明顯，且易出現(xiàn)裂痕，硬度較小，選擇75%乙醇為潤濕劑。表2

表2 不同濃度乙醇做潤濕劑Table 2 Experimental results of different concentrations of ethanol as wetting agents

2.2.6 驗證試驗

研究表明，3批BSP咀嚼片呈紫紅色片劑，色澤均勻，其外觀光潔圓整，厚度均勻，口感細(xì)膩，酸甜可口，具有甜菜紅素風(fēng)味，且無顆粒感，硬度適中，最終感官評分分別為(90.23±0.81)、(90.31±1.01)、(89.88±0.79)分，其平均分為(90.14±0.87)分。表3

表3 驗證實驗結(jié)果Table 3 Verification experiment results

3 討 論

DPPH測定法是一種快速、簡便、靈敏、可行的評價天然抗氧化劑抗氧化活性的，在國內(nèi)外應(yīng)用廣泛[16]。DPPH清除自由基的機(jī)理是在加氫抗氧劑的存在下，DPPH還原為DPPH-H，導(dǎo)致紫色褪色，從而抑制氧化反應(yīng)[17]。張靈幫等[18]研究得出，紅肉火龍果果皮和白肉火龍果果皮中甜菜紅素對DPPH自由基清除率的IC50分別為950、1 150 μg/mL，劉冰等[19]發(fā)現(xiàn)火龍果果皮甜菜紅素濃度為6 000 μg/mL時，對DPPH自由基的清除率為55%左右，郝秀梅等[9]研究結(jié)果表明，經(jīng)x-5純化的紅甜菜色素濃度為2 000 μg/mL時，對DPPH自由基的清除率為80%左右，試驗中，當(dāng)BSP濃度為640 μg/mL時，其清除率即可達(dá)81.16%，當(dāng)BSP濃度為1 280 μg/mL時，其清除率達(dá)92.23%，BSP對DPPH自由基具有更強(qiáng)清除能力。

ABTS自由基因氧化劑存在會形成穩(wěn)定的藍(lán)綠色自由基[20]，而當(dāng)有抗氧化劑存在時，ABTS自由基溶液會發(fā)生褪色。實驗基于抗氧化劑通過H原子轉(zhuǎn)移的自由基淬滅或通過單電子轉(zhuǎn)移的還原，對穩(wěn)定自由基ABTS產(chǎn)生清除能力[21]。呂思潤等[8]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)x-5純化的甜菜紅色素濃度為800 μg/mL時，對ABTS自由基的清除率為36%。試驗中，當(dāng)BSP濃度為800 μg/mL時，其清除率達(dá)70%左右，表明BSP對ABTS自由基具有較強(qiáng)的清除能力。

羥基自由基作為一種活性氧，能快速與機(jī)體內(nèi)多種分子發(fā)生反應(yīng)，造成細(xì)胞突變或死亡。從而對機(jī)體的損傷也最大[22]。張靈幫等[18]研究得出，紅肉火龍果果皮和白肉火龍果果皮中甜菜紅素對羥基自由基清除率的IC50分別為4 570、5 950 μg/mL，劉冰等[19]發(fā)現(xiàn)火龍果果皮甜菜紅素濃度為6 000 μg/mL時，對羥基自由基的清除率為60%左右，呂思潤等[8]研究結(jié)果表明，經(jīng)x-5純化的甜菜紅素濃度為400 μg/mL時，對羥基自由基的清除率為57%左右，試驗中，當(dāng)BSP濃度為160 μg/mL時，其清除率即可達(dá)54.31%，當(dāng)BSP濃度為1 280 μg/mL時，其清除率達(dá)91.26%，表明BSP具有更強(qiáng)的羥基自由基清除能力。

抗氧化劑能使鐵氰化鉀的三價鐵還原成亞鐵氰化鉀，亞鐵氰化鉀和三氯化鐵反應(yīng)生成Fe4[Fe(CN)6]3，其在700 nm處有最大吸收，因此，可間接測定抗氧化劑還原能力的大小，即吸光度值越大，還原能力越強(qiáng)[23]。郝秀梅等[9]的研究表明，經(jīng)x-5純化的紅甜菜色素濃度在250～2 000 μg/mL，其還原力弱于VC，而試驗中，BSP濃度在40～1 280 μg/mL范圍內(nèi)，BSP和VC的還原力相當(dāng)。

甜菜紅素是一種天然食用色素，具有較高的保健價值與酸堿穩(wěn)定性[24]。選用不同抗氧化活性評價體系，通過多方面及不同機(jī)制探討B(tài)SP的抗氧化活性，表明BSP具有較好的體外抗氧化活性。

4 結(jié) 論

4.1 BSP對DPPH、ABTS和羥基自由基均有一定的清除作用，其IC50分別為109.65、260.49、89.59 μg/mL，BSP在40～1280 μg/mL濃度下，還原能力與VC相當(dāng)。

4.2 BSP咀嚼片的最佳配方為：輔料比例(木糖醇∶甘露醇∶山梨糖醇∶微晶纖維素∶麥芽糊精)為4∶4∶3∶1∶1，原料(BSP)與輔料比例為1∶2，檸檬酸和硬脂酸鎂添加量分別為1%和1.5%，潤濕劑為75%乙醇。

4.3 BSP具有良好的抗氧化活性，以其為原料制備的咀嚼片，呈紫紅色，色澤均勻，酸甜可口，厚度均勻，硬度適中。