馬鈴薯甲蟲(chóng)LdATPaseE調(diào)控幼蟲(chóng)蛻皮的分子機(jī)制

廖蘭蘭，王 俊，付開(kāi)赟，丁新華，何 江，吐?tīng)栠d·阿合買提，郭文超

(1.塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091；3. 新疆農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳植物保護(hù)站，烏魯木齊 830049；4.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后工作站/新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)博士后流動(dòng)站，烏魯木齊 830091；5. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】液泡型H+-ATP酶(vATPase)定位于幾乎所有昆蟲(chóng)上皮組織的頂膜中，激活膜以吸收和/或分泌離子和流體，并在許多生理功能中起重要作用。這類酶可以通過(guò)水解ATP成ADP和磷酸，將氫離子泵出膜外，維持細(xì)胞膜電位，幫助膜上其它載體吸收或分泌離子或液體。囊泡型H+-ATP酶(vesicular H+-ATPase，vATPase)驅(qū)動(dòng)H+的跨過(guò)細(xì)胞膜的運(yùn)輸，形成跨膜H+電位差；H+電位差則驅(qū)動(dòng)Na+和/或 K+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體，而Na+/K+通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸從血淋巴中運(yùn)往中腸腸腔，腸腔內(nèi)Na+/K+則激發(fā)Na+/K+依賴的氨基酸吸收[1]。vATPase驅(qū)動(dòng)的H+的跨膜運(yùn)輸是昆蟲(chóng)吸收氨基酸的動(dòng)力基礎(chǔ)，因此，在昆蟲(chóng)營(yíng)養(yǎng)吸收過(guò)程中具有非常重要的作用，沉默vATPase的亞基常導(dǎo)致昆蟲(chóng)死亡[2-7]。【前人研究進(jìn)展】前人的研究已克隆出馬鈴薯甲蟲(chóng)中vATPase 3個(gè)亞基A、B和E的基因片段，并發(fā)現(xiàn)這3個(gè)亞基的dsRNA均引起馬鈴薯甲蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)的死亡[5,8]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】通過(guò)喂食馬鈴薯甲蟲(chóng)不同劑量的dsLdATPaseE，可導(dǎo)致幼蟲(chóng)在取食量、行動(dòng)力、入土能力、化蛹率、羽化率隨dsLdATPaseE劑量依賴性的下降現(xiàn)象。采用RACE技術(shù)克隆了馬鈴薯甲蟲(chóng)vATPaseE的編碼基因LdATPaseE全長(zhǎng)，應(yīng)用RNAi技術(shù)測(cè)定了敲低LdATPaseE對(duì)馬鈴薯甲蟲(chóng)幼蟲(chóng)蛻皮的影響，闡明馬鈴薯甲蟲(chóng)ATPaseE基因調(diào)控幼蟲(chóng)蛻皮分子機(jī)制?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】干擾LdATPaseE了解影響幼蟲(chóng)體重及化蛹的分子機(jī)理，LdATPaseE通過(guò)IIS信號(hào)途徑，調(diào)節(jié)保幼激素(JH)和蛻皮激素(MH)信號(hào)途徑，以及影響幼蟲(chóng)生長(zhǎng)和發(fā)育。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 馬鈴薯甲蟲(chóng)

馬鈴薯甲蟲(chóng)于2018年5月源于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院安寧渠綜合試驗(yàn)場(chǎng)天敵資源繁育研究中心，其飼養(yǎng)條件為溫度(26±1)℃、相對(duì)濕度50%～60%和光周期16L∶8D。收集的幼蟲(chóng)在養(yǎng)蟲(chóng)室用新鮮馬鈴薯嫩葉飼養(yǎng)，分別飼養(yǎng)至二齡、三齡和四齡開(kāi)始用于試驗(yàn)。

1.1.2 主要藥劑

總RNA提取試劑(TRIzol)購(gòu)自Invitrogen公司，引物合成購(gòu)自南京金斯瑞公司、SuperScript III反轉(zhuǎn)錄酶、Oligo (dT)18隨機(jī)引物、TaqDNA聚合酶、dNTP mixture (2.5和10 mmol/L) 、RNase抑制劑、DNA Marker購(gòu)自TaKaRa寶生物公司。pGEM-T easy vector購(gòu)自Promega公司。DNA凝膠回收試劑盒為AXYGEN公司或Promega公司產(chǎn)品；感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)AR級(jí)或進(jìn)口產(chǎn)品如酵母提取液(yeast extract)和胰蛋白胨(tryptone) 為Oxiod公司產(chǎn)品。保幼激素類似物吡丙醚(Pyr)和蛻皮酮類似物氯蟲(chóng)酰肼(Hal)為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)友情提供。

1.2 方 法

1.2.1 馬鈴薯甲蟲(chóng)ATPase基因表達(dá)載體的構(gòu)建1.2.1.1 馬鈴薯甲蟲(chóng)vATPase基因的克隆

馬鈴薯甲蟲(chóng)vATPase的E亞基首先是由報(bào)道的E亞基序列為基礎(chǔ)[5]，搜索馬鈴薯甲蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并獲得ATPaseE的完整序列，搜索程序?yàn)楸镜鼗疊LAST程序包(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，同源序列搜索過(guò)程中選定E值為10-5，獲得的目的基因的片段序列經(jīng)過(guò)CAP3組裝，組裝結(jié)果在nr數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源搜索分析驗(yàn)證。利用Premier 5.0設(shè)計(jì)End to End引物驗(yàn)證序列的完整性，5’RACE引物為5’-CGTTTGTGACCTGACCAAGTCGTTTA-3’，3’RACE引物為5’-TCCCAAATCCTGGAAAGCCTCA-3’。

PCR反應(yīng)體系(25 μL): cDNA 模板1 μL, dNTP 1 μL, 10×Mg2+Buffer 2.5 μL, 上下游引物各1 μL，其余用ddH2O補(bǔ)齊。PCR反應(yīng)條件: 94℃ 60 s; 94℃ 30 s, 52℃ 30 s,72℃ 2 min, 循環(huán)40次; 72℃ 10 min。反應(yīng)完成后樣品通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目標(biāo)條帶切膠回收，回收樣液直接送公司測(cè)序。

1.2.1.2 dsRNA原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)用大腸桿菌EscherichiacoliHT115(DE3) RNaseШ 缺失品系和南京農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈(zèng)的pET-2p dsRNA表達(dá)載體。載體構(gòu)建方法參照[9]，用于構(gòu)建ATPaseE-1/2 [(ATPasesubunitE-1/2), 參與H+跨膜運(yùn)輸]，F(xiàn)TZ-F1 [蛻皮激素基因(Fushi tarazu-factor 1), 參與蛻皮激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)],AS-C[咽側(cè)體靜止激素c基因(allatostatin-c gene)，參與調(diào)節(jié)保幼激素合成],JHAMT[保幼激素甲基轉(zhuǎn)移酶基因(juvenile hormone acid methyl transferase gene)，參與保幼激素的合成],SHD(細(xì)胞色素314a1和Cyp314a1基因，參與20-羥蛻皮酮的合成)的dsRNA的cDNA片段根據(jù)已有報(bào)道[10-11]，egfp為對(duì)照，PCR克隆獲得，獲得的各個(gè)組織的混合模板cDNA 1.0 μL，參照TaKaRa公司rTaq反應(yīng)體系以25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行克隆，PCR 反應(yīng)條件: 94℃ 3 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1 min，循環(huán)35次；72℃ 10 min。反應(yīng)獲得的片段連入全式金公司pEasy-T3載體，最終挑取獲得的陽(yáng)性克隆送南京金斯瑞測(cè)序，測(cè)序獲得的結(jié)果通過(guò)GeneDoc比對(duì)序列的正確性。驗(yàn)證的片段通過(guò)菌液擴(kuò)大培養(yǎng)并提取含有片段的Transit-T1載體，通過(guò)EcoRI酶切產(chǎn)生粘性末端，目標(biāo)片段通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離后通過(guò)膠回收純化，利用T4連接酶連入已通過(guò)EcoRI產(chǎn)生粘性末端的pET-2p載體，連接完成的載體轉(zhuǎn)入HT115(DE3)細(xì)胞中在含有卡那霉素(50 μg/mL)和四環(huán)素(12.5 μg/mL)的固體培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆。獲得的陽(yáng)性克隆通過(guò)測(cè)序和異丙基硫代半乳糖苷 (isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)誘導(dǎo)發(fā)酵dsRNA驗(yàn)證結(jié)果。誘導(dǎo)發(fā)酵的步驟參照呂東摸索的條件[12]，在菌液重新擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600=1.0時(shí)加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，發(fā)酵表達(dá)dsRNA 6 h即可獲得穩(wěn)定表達(dá)的濃度約為0.05 μg/μL的dsRNA[8]。以上所用試劑盒均按照其說(shuō)明書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)化程序進(jìn)行。表1

表1 用于構(gòu)建dsRNA表達(dá)載體的引物Table 1 Primers used in dsRNA synthesis

1.2.2 生物測(cè)定

根據(jù)方法[13-14]，試蟲(chóng)對(duì)菌液有顯著的拒食作用，以及取食dsLdATPaseE1/dsLdATPaseE2處理葉片1 d即能達(dá)到最佳效果[9]，以及0.05和0.1 μg/mL的保幼激素吡丙醚類似物(Pyr)和氯蟲(chóng)酰肼(Hal)點(diǎn)滴處理幼蟲(chóng)并不會(huì)引起可見(jiàn)的負(fù)作用[15]。在以上條件下，設(shè)計(jì)以下10個(gè)獨(dú)立的生物測(cè)定實(shí)驗(yàn)。

3組實(shí)驗(yàn)用于測(cè)定20E信號(hào)通道對(duì)四齡幼蟲(chóng)體內(nèi)LdATPase的抑制作用。第一組實(shí)驗(yàn)測(cè)試20E和Hal對(duì)LdATPase表達(dá)的影響：處理組為(1)ddH2O浸潤(rùn)葉片(對(duì)照)，(2)20E浸潤(rùn)葉片，(3)Hal浸潤(rùn)葉片，喂食1 d。實(shí)驗(yàn)二為敲低LdSHD：處理組為(1)PBS浸潤(rùn)葉片(空白對(duì)照)，(2)dsegfp浸潤(rùn)葉片(負(fù)對(duì)照)，(3)dsLdSHD浸泡葉片，喂食3 d。實(shí)驗(yàn)三為敲低LdFTZ-F1：處理組為(1)PBS浸潤(rùn)葉片(空白對(duì)照)，(2)dsegfp浸潤(rùn)葉片(負(fù)對(duì)照)，(3)dsLdFTZ-F1浸泡葉片，喂食3 d。以上每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理組均重復(fù)3次，用于提取RNA。

3組實(shí)驗(yàn)用于測(cè)定JH信號(hào)通道對(duì)LdATPase表達(dá)量的影響。實(shí)驗(yàn)一測(cè)試JH和Pyr對(duì)LdATPase表達(dá)的影響：處理組為(1) ddH2O浸潤(rùn)葉片(對(duì)照)，(2) JH浸潤(rùn)葉片，(3) 0.1 μg/mL Pyr浸潤(rùn)葉片，喂食1 d。實(shí)驗(yàn)二為敲低LdAS-C：處理組為(1)PBS浸潤(rùn)葉片(空白對(duì)照)，(2)dsegfp浸潤(rùn)葉片(負(fù)對(duì)照)，(3)dsLdAS-C浸泡葉片，喂食3 d。實(shí)驗(yàn)三為敲低LdJHAMT：處理組為(1)PBS浸潤(rùn)葉片(空白對(duì)照)，(2)dsegfp浸潤(rùn)葉片(負(fù)對(duì)照)，(3)dsLdJHAMT浸泡葉片，連續(xù)喂食3 d。以上每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理組均重復(fù)3次，然后用于提取RNA。

3組實(shí)驗(yàn)用于測(cè)定不同濃度dsLdATPaseE-1對(duì)三齡和四齡幼蟲(chóng)的影響。7個(gè)處理包括PBS、dsegfp、和dsLdATPaseE-1菌液稀釋100、101、102、103和104倍。每個(gè)處理重復(fù)6次。飼喂3 d后，取3個(gè)重復(fù)用于提取RNA；另3個(gè)重復(fù)用于測(cè)量體重及觀察化蛹情況。

2個(gè)實(shí)驗(yàn)測(cè)定敲低三齡和四齡幼蟲(chóng)體內(nèi)的LdATPaseE對(duì)IIS、JH和20E信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響。飼喂方法為1 d’dsRNA+2 d’PBS。共有4組處理：(1) PBS浸潤(rùn)葉片(空白對(duì)照)，(2)dsegfp浸潤(rùn)葉片(負(fù)對(duì)照)，(3) dsLdATPaseE-1浸泡葉片，(4) dsLdATPaseE-2浸泡葉片。每個(gè)處理重復(fù)9次。飼喂3 d后，3個(gè)重復(fù)用于提取RNA；3個(gè)重復(fù)用于提取JH；另3個(gè)重復(fù)用于提取20E。

1.2.3 20E與JH

20E由之前報(bào)道的超聲波方法提取[14]其滴度(ng / g體重)通過(guò)LC串聯(lián)質(zhì)譜儀-質(zhì)譜儀系統(tǒng)分析(LC-MS/MS)，方法步驟按照之前報(bào)道的方法進(jìn)行試驗(yàn)[15]。

血淋巴與JH的提取參照之前報(bào)道的方法[16]。LC-MS用來(lái)定量JH的滴度(ng / mL)[17]。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

qPCR引物利用GenScript在線網(wǎng)站設(shè)計(jì)，參數(shù)選擇默認(rèn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)采用熒光染料SYBR Green I，在ABI 7500 或ABI 7300 Real-Time PCR System上進(jìn)行。使用SYBR Premix ExTaq(TIi RNaseH Plus)進(jìn)行PCR反應(yīng)，加入的參比染料為Rox Reference Dye II或Dye。

cDNA模板來(lái)自于一齡、二齡、三齡和四齡幼蟲(chóng)，每個(gè)齡期間隔1 d取樣，四齡間隔8 h取樣，進(jìn)入漫游期的幼蟲(chóng)間隔1 d取樣。dsRNA處理樣品選自3次生物學(xué)重復(fù)中存活個(gè)體。對(duì)于組織表達(dá)分析cDNA模板取自4齡3 d幼蟲(chóng)的胸肌、腦-咽側(cè)體復(fù)合體、腹神經(jīng)索、前腸(FG)、中腸(MG)、馬氏管(MT)、回腸(IL)、直腸(RE)、血細(xì)胞(HC)、表皮(EP)、腹神經(jīng)節(jié)(VG)和脂肪體(FB)。對(duì)于所有的樣品，RNA通過(guò)試劑盒SV Total RNA Isolation System Kit (Promega)提取。每一組樣品包含5～30的個(gè)體并且均有3次生物學(xué)重復(fù)。定量的mRNA檢測(cè)通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)，均有3次技術(shù)重復(fù)?；虻南鄬?duì)表達(dá)量根據(jù)2-△△CT方法計(jì)算[18-19], 通過(guò)內(nèi)參基因 (RP18和ARF4)校準(zhǔn)[20]。qPCR反應(yīng)體系為20 μL: RNA使用1 μg, qPCR Mix Buffer 10 μL, qPCR上下游引物各0.8 μL, ROX Reference Dye I 0.4 μL, 剩余ddH2O補(bǔ)齊。qPCR的反應(yīng)步驟參考ABI 7300默認(rèn)反應(yīng)程序: 95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 60℃ 31 s, 共40個(gè)循環(huán)。表2

表2 用于qRT-PCR的引物Table 2 Primers used in qRT-PCR

1.3 數(shù)據(jù)處理

qRT-PCR數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，其中：ΔΔCT=ΔCT樣品-ΔCT參照物，ΔCT=CT靶基因-CT內(nèi)參基因，并以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示(3次重復(fù))，各發(fā)育階段mRNA相對(duì)表達(dá)量比較采用ANOVA的Tukey-Kramer分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)分析使用的軟件為SPSS(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯甲蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中LdATPaseE的時(shí)空表達(dá)

研究表明，LdATPaseE在所有測(cè)定的組織中均表達(dá)。LdATPaseE在回腸、直腸中表達(dá)量最高，在馬氏管、中腸和前腸中的表達(dá)量相對(duì)中等，在脂肪體、腹神經(jīng)索、表皮和血細(xì)胞中的表達(dá)量最低。

LdATPaseE在各個(gè)齡期皆有表達(dá)。在一齡、二齡和三齡的幼蟲(chóng)中，LdE75在蛻皮后出現(xiàn)高峰，在齡末期出現(xiàn)低谷。在四齡幼蟲(chóng)中，LdATPaseE的最高峰出現(xiàn)在蛻皮后72 h，低谷出現(xiàn)在蛻皮后96 h。圖1

注：測(cè)定組織表達(dá)時(shí)，cDNA模板來(lái)自于3日齡四齡幼蟲(chóng)的前腸(FG)、中腸(MG)、馬氏管(MT)、回腸(IL)、直腸(RE)、血細(xì)胞(HC)、表皮(EP)、腹神經(jīng)節(jié)(VG)和脂肪體(FB)。測(cè)定不同發(fā)育階段的表達(dá)時(shí)，cDNA模板來(lái)自于間隔1 d的一齡(I1D0、I1D1、I1D2)、二齡(I2D0、2D1、I2D2)、三齡(I3D0、I3D1、I3D2)幼蟲(chóng)和間隔8 h的四齡(I4H0、I4H8、I4H16、I4H24、I4H32、I4H40、I4H48、I4H56、I4H64、I4H72、I4H80、I4H88和I4H96)幼蟲(chóng)，IxD0/IxH0表示剛蛻皮的幼蟲(chóng)。測(cè)定基因的相對(duì)表達(dá)量時(shí), 共有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)包括5～30個(gè)體。相對(duì)表達(dá)量經(jīng)qRT-PCR測(cè)定，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。柱狀圖表示平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。柱頂不同字母表示P < 0.05水平差異顯著

2.2 激素調(diào)節(jié)LdATPaseE的表達(dá)機(jī)制

2.2.1 20E抑制LdATPaseE的表達(dá)

研究表明，在馬鈴薯甲蟲(chóng)L.decemlineata中 20E滴度的高峰和LdATPaseE的表達(dá)水平的低谷同時(shí)出現(xiàn)，這表示20E可能抑制LdATPaseE的表達(dá)。測(cè)試處理為：喂食水浸泡(CK)、Hal和 20E浸泡的葉片，時(shí)間為1 d。相比于對(duì)照CK的樣品，LdATPaseE的表達(dá)量在Hal和20E處理樣品中顯著下降。

RNAi降低LdSHD的表達(dá)水平后，LdATPaseE的表達(dá)mRNA水平顯著上升。RNAi方法敲低馬鈴薯甲蟲(chóng)四齡幼蟲(chóng)體內(nèi)LdFTZ-F1后，LdATPaseE的mRNA水平顯著上升。圖2

注：A：剛蛻皮的四齡幼蟲(chóng)取食水處理的馬鈴薯葉片(control)、0.1 μg/mL處理或10-6 M的 20E處理的葉片1 d；B：取食PBS、dsegfp、或dsSHD浸泡的葉片3 d；C：或取食PBS、dsegfp或 dsFTZ-F1浸泡葉片3 d。柱狀圖表示平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。柱頂不同的大寫(xiě)或小寫(xiě)字母表示在P< 0.05或P<0.01水平差異顯著

2.2.2 JH不參與調(diào)控LdATPaseE的表達(dá)

研究表明，馬鈴薯甲蟲(chóng)四齡幼蟲(chóng)攝取JH及其類似物吡丙醚后，對(duì)LdATPaseE表達(dá)量不明顯影響。采取RNAi方法敲低馬鈴薯甲蟲(chóng)四齡幼蟲(chóng)體內(nèi)LdAS-C后，JH滴度應(yīng)上升，但LdATPaseE的mRNA水平仍無(wú)變化。采取RNAi方法敲低馬鈴薯甲蟲(chóng)四齡幼蟲(chóng)體內(nèi)LdJHAMT后，JH滴度應(yīng)下降，但LdATPaseE的mRNA水平仍無(wú)變化。在馬鈴薯甲蟲(chóng)四齡幼蟲(chóng)階段，JH不參與調(diào)控LdATPaseE的表達(dá)。圖3

注：A：剛蛻皮的四齡幼蟲(chóng)取食水處理的馬鈴薯葉片(control)、0.1 μg/mL的吡丙醚或10-6 M的JH1 d。B：或者剛蛻皮的四齡幼蟲(chóng)取食PBS、dsegfp或dsAS-C浸泡的葉片3 d; C：或PBS、dsegfp或dsJHAMT浸泡的葉片3 d。不同的大寫(xiě)和小寫(xiě)字母表示在P<0.05和P<0.01水平差異顯著

2.2.3 激素調(diào)節(jié)LdATPaseE的表達(dá)機(jī)制

馬鈴薯甲蟲(chóng)三齡幼蟲(chóng)喂食1 ddsLdATPaseE1/dsLdATPaseE2處理葉片、2或5 d PBS處理葉片后，LdInR的mRNA水平分別上調(diào)了2.0和3.3倍，以及2.5和4.0倍。Ld4EBP的表達(dá)水平則分別上調(diào)了2.3 和3.0倍，以及3.5和4.1倍。馬鈴薯甲蟲(chóng)四齡幼蟲(chóng)喂食1 ddsLdATPaseE1/dsLdATPaseE2處理葉片、2 d PBS處理葉片后，LdInR的mRNA水平分別上調(diào)了4.4和6.0倍。Ld4EBP的表達(dá)水平則分別上調(diào)了3.5 和2.9倍。可見(jiàn)，取食dsLdATPaseE1/dsLdATPaseE2處理葉片抑制了馬鈴薯甲蟲(chóng)幼蟲(chóng)體內(nèi)的IIS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

馬鈴薯甲蟲(chóng)三齡幼蟲(chóng)喂食1 ddsLdATPaseE1/dsLdATPaseE2處理葉片、2 或5 d PBS處理葉片后，LdAS-C表達(dá)水平顯著上升了3.6和3.0倍，以及2.5和2.4倍。馬鈴薯甲蟲(chóng)四齡幼蟲(chóng)喂食1 ddsLdATPaseE1/dsLdATPaseE2處理葉片、2 d PBS處理葉片后，LdAS-C表達(dá)水平顯著上升了2.8和2.7倍。

馬鈴薯甲蟲(chóng)中，高水平表達(dá)的LdAS-C可能產(chǎn)生大量的AS-C蛋白，抑制JH的合成。測(cè)定JH合成關(guān)鍵酶：保幼激素酸甲基轉(zhuǎn)移酶LdJHAMT的轉(zhuǎn)錄水平。馬鈴薯甲蟲(chóng)三齡幼蟲(chóng)喂食1 ddsLdATPaseE1/dsLdATPaseE2處理葉片、2或5 d PBS處理葉片后，LdJHAMT表達(dá)水平顯著下降了64.0%和88.3%，以及63.2%和51.1% ；JH滴度顯著下降了78.2%和75.6%，以及78.9%和66.2%。馬鈴薯甲蟲(chóng)四齡幼蟲(chóng)喂食1 ddsLdATPaseE1/dsLdATPaseE2處理葉片、2 d PBS處理葉片后，LdJHAMT表達(dá)水平顯著下降了69.1%和75.0%；JH滴度顯著下降了82.4%和88.8% 。圖4

注：相對(duì)表達(dá)量經(jīng)qRT-PCR測(cè)定，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。20E的相對(duì)滴度通過(guò)(LC-MS/MS)系統(tǒng)檢測(cè)。JH的相對(duì)滴度通過(guò)LC-MSMS聯(lián)用測(cè)定。柱狀圖表示平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。柱頂不同的小寫(xiě)字母表示在P< 0.05水平差異顯著

馬鈴薯甲蟲(chóng)三齡幼蟲(chóng)取食dsLdATPaseE1/dsLdATPaseE2處理葉片后，其體內(nèi)LdSHD的表達(dá)水平下降，20E滴度降低，LdFTZ-F1-1 轉(zhuǎn)錄本也大幅減少。圖5

注：相對(duì)表達(dá)量經(jīng)qRT-PCR測(cè)定，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。20E的相對(duì)滴度通過(guò)(LC-MS/MS)系統(tǒng)檢測(cè)。JH的相對(duì)滴度通過(guò)LC-MSMS聯(lián)用測(cè)定。柱狀圖表示平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。柱頂不同的小寫(xiě)字母表示在P< 0.05水平差異顯著

取食dsLdATPaseE1/dsLdATPaseE2處理葉片也抑制了馬鈴薯甲蟲(chóng)幼蟲(chóng)體內(nèi)的20E信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

2.3 dsLdATPaseE的劑量效應(yīng)

研究表明，LdATPaseE的mRNA 水平、體重和化蛹率顯著下降，且下降幅度與使用劑量正相關(guān)。重要的是，dsLdATPaseE1/dsLdATPaseE2稀釋104倍后處理葉片，仍能顯著降低馬鈴薯甲蟲(chóng)三齡幼蟲(chóng)的化蛹率，而這一濃度僅相當(dāng)于5 ng/mL的dsRNA濃度。圖6

注：5個(gè)不同濃度的dsE1(左欄)和dsE2(右欄)分別浸泡葉片飼喂試蟲(chóng)1 d，隨后用PBS浸泡葉片飼喂試蟲(chóng)2 d后，測(cè)定了試蟲(chóng)的靶標(biāo)基因表達(dá)量(A和B)、幼蟲(chóng)體重(C和D)和化蛹率(E和F)。空白對(duì)照(CK)用PBS浸泡葉片、負(fù)對(duì)照(dsegfp)用最高濃度(即稀釋100倍的菌液)連續(xù)飼喂幼蟲(chóng)3 d。柱狀圖表示平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。柱頂不同的小寫(xiě)字母表示在P< 0.05水平差異顯著

LdATPaseE的mRNA 水平、體重和化蛹率的下降幅度也與使用劑量正相關(guān)。對(duì)LdATPaseE的mRNA 水平的最低有效濃度為稀釋104倍即dsRNA濃度為5 ng/mL。對(duì)體重影響的最低有效濃度為稀釋102倍即dsRNA濃度為500 ng/mL。對(duì)化蛹率影響的最低有效濃度為稀釋103倍即dsRNA濃度為50 ng/mL。圖7

注：5個(gè)不同濃度的dsE1(左欄)和dsE2(右欄)分別浸泡葉片飼喂試蟲(chóng)1 d，隨后用PBS浸泡葉片飼喂試蟲(chóng)2 d后，測(cè)定試蟲(chóng)的靶標(biāo)基因表達(dá)量(A和B)、幼蟲(chóng)體重(C和D)和化蛹率(E和F)。空白對(duì)照(CK)用PBS浸泡葉片、負(fù)對(duì)照(dsegfp)用最高濃度(即稀釋100倍的菌液)連續(xù)飼喂幼蟲(chóng)3 d。柱狀圖表示平均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)誤。柱頂不同的小寫(xiě)字母表示在P< 0.05差異顯著

3 討 論

vATPase是一個(gè)高度進(jìn)化保守的古老跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合體，在真核生物中擁有多個(gè)重要的功能。研究在馬鈴薯甲蟲(chóng)L.decemlineata中克隆并描述了囊泡型ATP酶E亞基(vATPase subunit E，LdATPaseE)的基因。在黑腹果蠅中，E亞基被單個(gè)基因編碼。系統(tǒng)發(fā)育的結(jié)果證明了ATPaseE亞基的蛋白質(zhì)在昆蟲(chóng)類群中形成一個(gè)大分支，而2個(gè)哺乳動(dòng)物形成了一個(gè)小分支，該2支互相分開(kāi)。這些結(jié)果表明，馬鈴薯甲蟲(chóng)中的LdATPaseE與黑腹果蠅的ATPaseE為直系同源關(guān)系。

在昆蟲(chóng)中，vATPases擔(dān)負(fù)腸道的營(yíng)養(yǎng)吸收、馬氏管液體的分泌和卵母細(xì)胞的液體吸收等重要功能[21-22]。與vATPase的功能一致，結(jié)果表明，LdATPaseE在馬鈴薯甲蟲(chóng)四齡幼蟲(chóng)腸道和馬氏管中表達(dá)量很高。

在一至三齡的幼蟲(chóng)中，LdE75在蛻皮后出現(xiàn)高峰，在齡末期出現(xiàn)低谷。在四齡幼蟲(chóng)中，LdATPaseE的最高峰出現(xiàn)在蛻皮后72 h，低谷出現(xiàn)在蛻皮后96 h?？梢?jiàn)，在馬鈴薯甲蟲(chóng)L.decemlineata中20E滴度的高峰和LdATPaseE的表達(dá)水平的低谷同時(shí)出現(xiàn)。20E的高峰抑制LdATPaseE的表達(dá)。

20E和蛻皮酮類似物氯蟲(chóng)酰肼(Hal)在幼蟲(chóng)末齡抑制了LdATPaseE的表達(dá)量。相反，喂食LdSHD和LdFTZ-F1的dsRNA降低20E的水平則上調(diào)了LdATPaseE的表達(dá)量。因此，20E的峰值抑制了LdATPaseE的表達(dá)。相反，取食JH及其類似物吡丙醚、敲低咽側(cè)體靜止激素基因LdAS-C[23]和保幼激素酸甲基轉(zhuǎn)移酶LdJHAMT[24]都不影響馬鈴薯甲蟲(chóng)四齡幼蟲(chóng)體內(nèi)LdATPaseE表達(dá)量。JH不參與調(diào)控LdATPaseE。

4 結(jié) 論

采用RNAi技術(shù)敲低LdATPaseE表達(dá)量不僅引起二齡幼蟲(chóng)的死亡，而且影響三齡和四齡幼蟲(chóng)的化蛹，可見(jiàn)馬鈴薯甲蟲(chóng)三齡和四齡幼蟲(chóng)對(duì)dsLdATPaseE非常敏感。對(duì)于三齡幼蟲(chóng)，dsLdATPaseE1/dsLdATPaseE2稀釋104倍后處理葉片，仍能顯著降低馬鈴薯甲蟲(chóng)的化蛹率，而這一濃度僅相當(dāng)于5 ng/mL的dsRNA濃度。對(duì)于四齡幼蟲(chóng)，對(duì)LdATPaseE的mRNA 水平的最低有效濃度為稀釋104倍即dsRNA濃度為5 ng/mL。對(duì)體重影響的最低有效濃度為稀釋102倍即dsRNA濃度為500 ng/mL。對(duì)化蛹率影響的最低有效濃度為稀釋103倍即dsRNA濃度為50 ng/mL。LdATPaseE是應(yīng)用RNAi技術(shù)治理馬鈴薯甲蟲(chóng)幼蟲(chóng)的候選基因。

敲低LdATPaseE還顯著升高了LdInR與Ld4EBP的表達(dá)量，抑制一個(gè)蛻皮激素合成基因的轉(zhuǎn)錄，降低20E滴度和一個(gè)20E響應(yīng)基因的表達(dá)。敲低2個(gè)LdE75亞型還抑制了一個(gè)JH合成酶基因的表達(dá)，降低了JH滴度，下調(diào)了一個(gè)JH早期響應(yīng)基因的表達(dá)量。敲低LdATPaseE通過(guò)抑制IIS信號(hào)途徑，降低20E和JH的滴度、下調(diào)20E和JH信號(hào)而影響幼蟲(chóng)生長(zhǎng)和發(fā)育。

在馬鈴薯甲蟲(chóng)四齡幼蟲(chóng)階段，20E通過(guò)其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制LdATPaseE的表達(dá)。