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    基于分子對接技術(shù)篩選抗新型冠狀病毒的先導(dǎo)化合物

    2021-07-05 07:15:52崔鶴蓉陳可點亓金釵吳倩文戴子琦王鵬龍雷海民
    西北藥學(xué)雜志 2021年3期
    關(guān)鍵詞:皂苷元薯蕷結(jié)合能

    崔鶴蓉,陳可點,王 成,亓金釵,吳倩文,戴子琦,張 玫,徐 冰,王鵬龍,雷海民

    (北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 102488)

    由2019 年新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染所致的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)具有傳染性強(qiáng)、傳播迅速、死亡率高等特點,嚴(yán)重危害人類健康[1-4],僅在2個月已造成7.7萬余人感染,2 500余人死亡[5-6]。目前臨床尚無針對SARS-CoV-2的特效藥物,主要采用傳統(tǒng)臨床治療非典型肺炎(SARS)患者的干擾素、利巴韋林、洛匹那韋-利托那韋(lopinavir-ritonavir)等藥物治療COVID-19患者,該療法具有明顯的不良反應(yīng)且易產(chǎn)生耐藥性[7]。亟需開發(fā)安全有效、價格低廉、推廣性強(qiáng)的潛在藥物,使SARS-CoV-2做到可防、可控、可治。研究表明,冠狀病毒主要蛋白酶(3CLpro)在病毒的復(fù)制中發(fā)揮了重要作用,能夠通過抑制3CLpro功能,從而阻斷SARS-CoV-2在宿主體內(nèi)的復(fù)制,因此3CLpro是抗SARS-CoV-2的重要靶點[8]。課題組長期致力于基于“配伍-拼合”思路的中藥先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)與開發(fā)研究,在前期國家863項目、科技重大專項等課題的支持下,建立了涵蓋3 000余種化學(xué)實體的樣品庫,在藥物合成及活性篩選方面積累了一定的研究思路和技術(shù)方法。目前,課題組已經(jīng)搜集、合成并證實具有抗病毒活性的中藥活性成分及系列衍生物4類120種,包括白樺脂酸等三萜類成分和海鞘醇、膽甾醇等甾體類成分等?;诖?,本研究采用分子對接技術(shù),以冠狀病毒纖突蛋白(S蛋白)和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)受體的結(jié)合蛋白作為目的靶點,評價“配伍-拼合”化合物庫中4類120種化合物與目的靶點的結(jié)合能力,篩選潛在候選藥物并對其進(jìn)行分析,以期為抗SARS-CoV-2藥物的研發(fā)創(chuàng)制提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1軟件及數(shù)據(jù)庫 目的靶點處理及分子對接主要采用AutoDock 4.2.6、MGLTools 1.5.6、PyRx、Q-Site Finder等軟件及RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org);化合物處理主要采用Chemdraw 12.0、PyMol、GuassView 5.0、Guassian 09W等軟件;圖像繪制采用Discovery Studio 2016 Client與PyMol等軟件。

    1.2目的靶點前處理 根據(jù)文獻(xiàn)確定PDB編號為6vw1的蛋白晶體作為研究對象,晶體結(jié)構(gòu)分辨率為2.68 ?,見圖1。從RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org)中獲得SARS-CoV-2-S-ACE2結(jié)合蛋白的三維結(jié)構(gòu),刪去水分子,添加極性氫并修復(fù)不完整殘基得到優(yōu)化受體,以Q-Site Finder預(yù)測得到作用位點(結(jié)合位點坐標(biāo)X=84.540 9,Y=16.269 3,Z=139.080 3),Q-SiteFinder是比較經(jīng)典的基于能量的結(jié)合位點的預(yù)測算法,這個算法的具體內(nèi)容可以分為以下幾步,首先將甲基探針初始化在蛋白質(zhì)的表面,然后計算蛋白質(zhì)和所有甲基探針之間的相互作用能量,這里的作用力是指范德華力,作用力較強(qiáng)的探針會被保留下來,最后通過每個區(qū)域探針的數(shù)量進(jìn)行排序來確定最終的結(jié)合位點。X、Y、Z表示所確定的結(jié)合位點的坐標(biāo)。作為活性位點,生成結(jié)合口袋,exhaustiveness設(shè)定為8。將與編號為6vw1的蛋白對接結(jié)合能絕對值較高的化合物與3CLpro蛋白(PDB ID:6LU7)進(jìn)行對接,驗證初步預(yù)測結(jié)果。

    圖1 SARS-CoV-2-S-ACE2結(jié)合蛋白晶體結(jié)構(gòu)

    1.3化合物的前處理 基于“配伍-拼合”化合物庫中搜集白樺脂酸類、薯蕷皂苷元類、甾醇類和鬼臼毒素類4類120種衍生物的三維結(jié)構(gòu),由Guassian和Sybyl X 2.0的分子能量最小化模塊生成形狀和靜電匹配的最小能量構(gòu)象,得到優(yōu)化配體。

    1.4分子對接 對上述優(yōu)化配體分別與優(yōu)化受體的結(jié)合口袋通過Grids得到小分子拮抗劑與蛋白質(zhì)相互作用的可能活性構(gòu)象,進(jìn)行半柔性分子對接,構(gòu)象為“BEST”,將對接成功的化合物按照打分值binding affinity(kcal·mol-1)絕對值大小降序排列,保留前3%的化合物作為候選SARS-CoV-2-S-ACE2結(jié)合阻斷劑,將結(jié)果(結(jié)合能)與基準(zhǔn)值(-1.435 kcal·mol-1)[8-9]以及所有化合物的平均結(jié)合能(-10.1 kcal·mol-1)分別進(jìn)行比較分析。

    1.5圖像繪制 導(dǎo)出3CLpro蛋白(PDB ID:6LU7)、與編號為6vw1的蛋白對接結(jié)合能絕對值較高化合物的PDB文件,經(jīng)DS軟件優(yōu)化后,導(dǎo)入Pymol進(jìn)行圖像繪制。

    2 結(jié)果

    2.1白樺脂酸類化合物的結(jié)合能力 結(jié)果顯示,鬼臼毒素類、甾醇類、薯蕷皂苷元類和白樺脂酸類4類120種衍生物與SARS-CoV-2-S-ACE2的平均結(jié)合能為-10.1 kcal·mol-1,7種化合物對接失敗。其中白樺脂酸類化合物(28種,見表1)與SARS-CoV-2-S-ACE2的平均結(jié)合能為-11.813 6 kcal·mol-1,低于參考文獻(xiàn)中的基準(zhǔn)值(-1.435 kcal·mol-1)和所有化合物的平均結(jié)合能(-10.1 kcal·mol-1),表明白樺脂酸結(jié)構(gòu)母核與SARS-CoV-2-S-ACE2具有較好的結(jié)合能力;BH-11、BH-12為打分值前3%化合物,但與其他白樺脂酸類化合物之間的結(jié)合能相差不大,表明不同氨基酸的引入幾乎不會影響白樺脂酸結(jié)構(gòu)母核的結(jié)合能力,BH-11、BH-12、BH-9(結(jié)合能絕對值前3)與SARS-CoV-2-S-ACE2及3CLpro蛋白的結(jié)合位點預(yù)測結(jié)果見圖2,其中BH-11、BH-12、BH-9與3CLpro蛋白的結(jié)合能分別為-8.56、-7.82、-8.42 kcal·mol-1。

    圖2 白樺脂酸類化合物與SARS-CoV-2-S-ACE2及3CLpro的結(jié)合位點預(yù)測

    表1 白樺脂酸類化合物與SARS-CoV-2-S-ACE2的結(jié)合能

    2.2薯蕷皂苷元類化合物的結(jié)合能力 結(jié)果顯示,薯蕷皂苷元類化合物(18種,見表2)與SARS-CoV-2-S-ACE2的平均結(jié)合能為-11.261 1 kcal·mol-1,低于參考文獻(xiàn)中的基準(zhǔn)值(-1.435 kcal·mol-1)和所有化合物的平均結(jié)合能(-10.1 kcal·mol-1),表明薯蕷皂苷元結(jié)構(gòu)母核與SARS-CoV-2-S-ACE2具有較好的結(jié)合能力;DG-04(薯蕷皂苷元-BOC脯氨酸)和DG-13(薯蕷皂苷元-脯氨酸)的結(jié)合能絕對值相對較大,表明脯氨酸的引入能增強(qiáng)薯蕷皂苷元與SARS-CoV-2-S-ACE2的結(jié)合能力,DG-13、DG-04、DG-02(結(jié)合能絕對值前3)與SARS-CoV-2-S-ACE2及3CLpro蛋白的結(jié)合位點預(yù)測結(jié)果見圖3,其中DG-13、DG-04、DG-02與3CLpro蛋白的結(jié)合能分別為-8.49、-7.31、-7.94 kcal·mol-1。

    表2 薯蕷皂苷元類化合物與SARS-CoV-2-S-ACE2的結(jié)合能

    圖3 薯蕷皂苷元類化合物與SARS-CoV-2-S-ACE2及3CLpro的結(jié)合位點預(yù)測

    2.3甾醇類化合物的結(jié)合能力 結(jié)果顯示,甾醇類化合物(32種,見表3)與SARS-CoV-2-S-ACE2的平均結(jié)合能為-10.15 kcal·mol-1,低于參考文獻(xiàn)中的基準(zhǔn)值(-1.435 kcal·mol-1)和所有化合物的平均結(jié)合能(-10.10 kcal·mol-1),化合物1(3β-O-乙?;戠薮?為打分值前3%化合物,其結(jié)合能力明顯強(qiáng)于其他甾醇類化合物,表明乙?;茉鰪?qiáng)膽甾醇與SARS-CoV-2-S-ACE2的結(jié)合能力,化合物1、18、10(結(jié)合能絕對值前3)與SARS-CoV-2-S-ACE2及3CLpro蛋白的結(jié)合位點預(yù)測結(jié)果見圖4,其中化合物1、18、10與3CLpro蛋白的結(jié)合能分別為-8.15、-8.13、-7.19 kcal·mol-1。

    表3 甾醇類化合物與SARS-CoV-2-S-ACE2的結(jié)合能

    圖4 甾醇類化合物與SARS-CoV-2-S-ACE2及3CLpro的結(jié)合位點預(yù)測

    2.4鬼臼毒素類化合物的結(jié)合能力 結(jié)果顯示,鬼臼毒素類化合物(42種,見表4)與SARS-CoV-2-S-ACE2的平均結(jié)合能為-8.641 46 kcal·mol-1,低于參考文獻(xiàn)中的基準(zhǔn)值(-1.435 kcal·mol-1),高于所有化合物的平均結(jié)合能(-10.1 kcal·mol-1),表明鬼臼毒素結(jié)構(gòu)母核與SARS-CoV-2-S-ACE2的結(jié)合能力較差,不適合開展相關(guān)研究。其中結(jié)合能絕對值較高的化合物P-19、P-23與3CLpro蛋白的結(jié)合能分別為-5.28、-6.08 kcal·mol-1,驗證了上述推論。

    表4 鬼臼毒素類化合物與SARS-CoV-2-S-ACE2的結(jié)合能

    3 討論

    SARS-CoV-2與嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)、中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)相似,屬于β冠狀病毒[10]。受體結(jié)合很大程度上決定了冠狀病毒的宿主范圍和組織嗜性[7,11]。S蛋白對于病毒進(jìn)入細(xì)胞過程中的病毒-細(xì)胞受體相互作用是必不可少的[7,11]。中國科學(xué)院上海巴斯德研究所[12]和武漢病毒研究所[10]的科學(xué)家先后分別發(fā)現(xiàn):SARS-CoV-2和SARS病毒一樣,均是通過利用S蛋白結(jié)合人體細(xì)胞表面的ACE2蛋白進(jìn)入細(xì)胞。此外研究表明,ACE2的表達(dá)與冠狀病毒的表達(dá)、復(fù)制均密切相關(guān)[13-14]。因此ACE2和S蛋白被認(rèn)為是開發(fā)針對SARS-CoV-2的抗病毒藥物的誘人靶標(biāo)[12-15]。6vw1蛋白(DOI:10.2210/pdb6VW1/pdb)是SARS-CoV-2與人ACE2的受體結(jié)合域,是冠狀病毒受體識別的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),被選作本研究目的靶點以篩選設(shè)計小分子破壞ACE2和S蛋白之間的相互作用,進(jìn)而展開具有針對性的研究。3CLpro的主要功能是介導(dǎo)靶向CoV非結(jié)構(gòu)性蛋白(NSPs)成熟,參與RNA轉(zhuǎn)錄翻譯、蛋白合成加工及修飾、蛋白復(fù)制和宿主感染等重要過程。因此,抑制3CLpro活性將阻止病毒的感染和復(fù)制,這使3CLpro成為小分子抑制劑的主要靶標(biāo)之一,且尚未發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)具有類似裂解特異性的識別蛋白酶,所以這種小分子抑制劑具有較好的安全性[16-18]。通過計算ACE2蛋白結(jié)合能較低的化合物與3CLpro蛋白的結(jié)合能力,能進(jìn)一步篩選出具有抗SARS-CoV-2潛力的優(yōu)勢化合物。

    幾千年來,中醫(yī)藥在疫病的防治方面形成了系統(tǒng)的理論并積累了豐富的臨床經(jīng)驗,清肺排毒湯等中藥復(fù)方在臨床應(yīng)用中被證實能較好地抗SARS-CoV-2活性[19-20]。中藥在抗病毒方面具有許多化學(xué)藥物所不具備的優(yōu)點,中藥治療病毒感染性疾病不僅以清除體內(nèi)病原體為目的,而且能通過調(diào)動機(jī)體特異性和非特異性免疫功能來增強(qiáng)抗病毒感染的能力。中藥有數(shù)千年的臨床應(yīng)用歷史,其安全性和有效性得到大家的廣泛認(rèn)可,同時中藥有效成分具有結(jié)構(gòu)多樣、生物活性豐富等多方面的優(yōu)勢,是新藥開發(fā)和先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)的寶貴資源。基于中藥及中藥復(fù)方和分子對接技術(shù)[21-22]進(jìn)行抗SARS-CoV-2藥物的篩選,可以減少盲目性,提高藥物研發(fā)的效率。

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