沒食子酸在大鼠體內(nèi)的藥物動力學特征及生物利用度研究

朱鈺璞，張維敏，武 坤，王四旺，余 喆，李 驊*

(1.空軍軍醫(yī)大學基礎(chǔ)醫(yī)學院學員大隊，西安 710032；2.解放軍第518醫(yī)院藥劑科，西安 710043；3.空軍軍醫(yī)大學藥學系中藥與天然藥物學教研室，西安 710032；4.空軍軍醫(yī)大學藥學系藥物化學與藥物分析學教研室，西安 710032)

沒食子酸(3，4，5-三羥基苯甲酸，gallic acid，GA)又名五倍子酸，是一種天然多酚類化合物，廣泛存在于丹皮、赤芍、廣棗、費菜等活血化瘀中藥材中，亦富含于檸檬、石榴、葡萄以及綠茶、紅茶等預防心血管疾病的藥食中[1-3]，是眾多中成藥中的主要有效成分[4-6]。研究顯示，沒食子酸不僅具有顯著的抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化以及神經(jīng)保護和心臟保護活性[7-11]，且具有良好的安全性。急性毒性實驗表明，當沒食子酸給藥劑量達到小鼠體內(nèi)給藥的最高限度時仍未觀察到小鼠有死亡或急性中毒的現(xiàn)象[12]。沒食子酸單體單劑量給藥后的藥物動力學行為已有相關(guān)文獻報道，如Shahrzad S等[13-14]通過高效液相色譜法(HPLC)考察了人單劑量口服沒食子酸單體后的藥物代謝動力學特性，王曉莉等[15]對大鼠單劑量灌胃沒食子酸后的體內(nèi)藥物動力學特征進行了初步探究。本實驗擬通過建立測定大鼠血漿中沒食子酸的HPLC法，研究大鼠單次灌胃不同劑量及靜脈注射沒食子酸后的藥物動力學特征和絕對生物利用度，為沒食子酸及其相關(guān)制劑的開發(fā)及臨床應用提供數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與材料

1.1儀器 LC-2010A HT型高效液相色譜系統(tǒng)(日本Shimadzu公司)；ME235S型微量分析天平(德國Sartorius公司)；TDZ5-WS型臺式低速離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；Certrifuge 5417R臺式高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)。

1.2試藥 沒食子酸原料藥(質(zhì)量分數(shù)≥99.0%，西安金綠生物工程技術(shù)有限公司，批號160903)；沒食子酸對照品(質(zhì)量分數(shù)≥99.0%，中國食品藥品檢定研究院，批號11831-200803)；4-乙酰氨基酚(質(zhì)量分數(shù)≥98.0%，國藥集團化學試劑有限公司，批號20141128)；甲醇為色譜純(美國Honeywell公司)；水為去離子水；聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP K30，巴斯夫新材料有限公司)；微晶纖維素(山東聊城阿華制藥股份有限公司)；交聯(lián)羧甲基纖維素鈉(明臺化工股份有限公司)；磷鎢酸鈉(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；十二烷基硫酸鈉(安徽山河藥用輔料股份有限公司)；0.45 μm聚偏四氟乙烯膜(杭州科百特過濾器材有限公司)。

1.3實驗動物 雄性SD大鼠，體質(zhì)量為320～350 g，購自空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心，合格證號：SCXK(軍)字第2012-0007號。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Woburn Bio-technologies Stamsil ODS-BP色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；流動相：甲醇-冰醋酸-水(5∶1.9∶93.1)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：272 nm；進樣量：20 μL。

2.2對照品溶液和藥液的配制 精密稱取沒食子酸對照品10 mg，置于10 mL棕色量瓶中，加體積分數(shù)為50%的甲醇(含體積分數(shù)為1%的冰醋酸)使溶解，定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為1.00 mg·mL-1的對照品母液；將對照品母液按比例稀釋，制成沒食子酸系列對照品溶液(質(zhì)量濃度為0.05～20.00 μg·mL-1)，4 ℃冷藏待用。精密稱取4-乙酰氨基酚對照品10 mg，置于10 mL棕色量瓶中，加體積分數(shù)為50%的甲醇(含體積分數(shù)為1%的冰醋酸)使溶解，定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為1.00 mg·mL-1的內(nèi)標母液；將內(nèi)標母液稀釋，制成4-乙酰氨基酚質(zhì)量濃度為40 μg·mL-1的內(nèi)標供試溶液，4 ℃冷藏待測。精密稱取沒食子酸原料藥適量，分別用蒸餾水制成沒食子酸質(zhì)量濃度為10、5 mg·mL-1的藥液。

2.3血漿樣品的處理 精密吸取血漿200 μL，置于離心管中，加體積分數(shù)為50%的甲醇(含體積分數(shù)為1%的冰醋酸)100 μL，2.2項下制備的內(nèi)標供試溶液(40 μg·mL-1)50 μL，1 mol·L-1鹽酸100 μL，乙酸乙酯1.5 mL，用渦旋振蕩器充分振搖5 min，以4 000 r·min-1離心15 min，吸取上清液，重復以上步驟，合并上清液，氮氣吹干。用200 μL流動相復溶，再以12 000 r·min-1離心，取上清液20 μL進樣。

2.4分析方法的確證

2.4.1專屬性考察 取大鼠空白血漿[4，16]，按照2.3項下方法處理后進樣分析，獲得空白血漿色譜圖、空白血漿添加沒食子酸、4-乙酰氨基酚(內(nèi)標)色譜圖以及大鼠給藥后含藥血漿的色譜圖，見圖1。由圖1可知，沒食子酸和內(nèi)標峰保留時間分別為7.0、13.3 min，二者分離度良好且無內(nèi)源性雜質(zhì)峰干擾，表明本實驗色譜條件適宜，提取處理方法合適，專屬性較強。

圖1 沒食子酸專屬性實驗典型色譜圖

2.4.2標準曲線的建立及定量下限 取200 μL空白血漿，加入2.2項下制備的沒食子酸對照品溶液(質(zhì)量濃度為0.05～20.00 μg·mL-1)100 μL，除不加100 μL 體積分數(shù)為50%的甲醇(含體積分數(shù)為1%的冰醋酸)外，其余按照2.3項下方法處理，得相應系列質(zhì)量濃度(0.025～10.000 μg·mL-1)的血漿對照品溶液，分別進樣進行色譜分析。以沒食子酸質(zhì)量濃度(x)為橫坐標、沒食子酸與4-乙酰氨基酚峰面積之比(y)為縱坐標，進行回歸分析，得標準曲線方程y=0.421 1x+0.022 5(r=0.999 9)，結(jié)果表明，沒食子酸質(zhì)量濃度在0.025～10.000 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為0.025 μg·mL-1。

2.4.3精密度和回收率實驗 取200 μL空白血漿[4，16]，分為日內(nèi)與日間2組，分別加入沒食子酸對照品適量，配制成質(zhì)量濃度分別為0.078、0.625、2.500、8.000 μg·mL-1的含藥血漿樣品溶液，加入內(nèi)標4-乙酰氨基酚溶液，按照2.3項下血漿樣品處理方法提取處理，日內(nèi)組每日測定5次，日間組每日測定1次并連續(xù)測定5 d，記錄沒食子酸與4-乙酰氨基酚峰面積，代入回歸方程計算其質(zhì)量濃度。同法測定相對回收率。測定結(jié)果見表1。由表1可知，所有樣品的日內(nèi)精密度RSD值小于2.58%，日間精密度RSD值小于3.40%，平均相對回收率大于97.43%，符合生物樣品的質(zhì)量控制要求。

表1 沒食子酸在大鼠血漿內(nèi)的精密度、準確度和相對回收率測定結(jié)果

取200 μL大鼠空白血漿，加入沒食子酸對照品適量，配制成質(zhì)量濃度分別為0.078、0.625、2.500、8.000 μg·mL-1的含藥血漿樣品溶液，加入內(nèi)標4-乙酰氨基酚溶液，按照2.3項下血漿樣品處理方法提取處理，進樣后記錄沒食子酸峰與4-乙酰氨基酚峰面積比A1。另取2.2項下制備的相應質(zhì)量濃度的對照品溶液直接進樣，記錄沒食子酸峰與4-乙酰氨基酚峰面積比A2。按公式計算絕對回收率(Rabs)，Rabs=A1÷A2×100%。結(jié)果表明，各組平均回收率分別為87.31%、88.79%、90.02%、91.56%，且在待測質(zhì)量濃度范圍內(nèi)RSD值均小于5%，符合生物樣品的質(zhì)量控制要求。

2.4.4穩(wěn)定性實驗 為了覆蓋預期樣本所處的不同實驗環(huán)境和條件，按照2.4.3項下方法配制沒食子酸質(zhì)控樣品，按照2.3項下方法處理并測定沒食子酸質(zhì)量濃度[4，16-17]。結(jié)果表明，短期(室溫下2 h)、長期(-80 ℃儲存1個月)、反復凍融(凍-融循環(huán)3次)穩(wěn)定性實驗中沒食子酸質(zhì)量濃度RSD值均小于15%，符合生物樣品的質(zhì)量控制要求。

2.5藥物動力學實驗 將32只雄性SD大鼠隨機分為4組，每組8只，實驗前禁食12 h，不禁水。其中3組大鼠灌胃(10 mL·kg-1)給予沒食子酸，劑量分別為50、100、200 mg·kg-1；另一組為靜脈給藥組，經(jīng)尾靜脈注射(2 mL·kg-1)給予沒食子酸10 mg·kg-1。灌胃給藥后于0、10、30、60、90、120、180、300、420、540、600 min，靜脈給藥后于0、2、5、10、20、30、45、60、90、120、180、240、300 min，分別從大鼠眼眶后靜脈叢采血400～500 μL，置于肝素化處理過的抗凝管中，以4 000 r·min-1離心15 min，分離血漿，按照2.3項下方法處理并測定沒食子酸質(zhì)量濃度。繪制得到大鼠血藥質(zhì)量濃度-時間曲線，見圖2。

圖2 不同劑量沒食子酸在大鼠體內(nèi)的平均血藥質(zhì)量濃度-時間曲線

運用DAS2.1軟件對血藥質(zhì)量濃度-時間參數(shù)進行非房室模型的統(tǒng)計矩法擬合，獲得沒食子酸單次不同劑量給藥后的主要藥物動力學參數(shù)，見表2。依據(jù)公式：絕對生物利用度(Fabs)=(AUC非靜脈×D靜脈)÷(AUC靜脈×D非靜脈)，計算不同劑量給藥后沒食子酸在大鼠體內(nèi)的Fabs，其中，AUC非靜脈為非靜脈給藥途徑藥時曲線下面積，D靜脈為靜脈給藥途徑給藥劑量，AUC靜脈為靜脈給藥途徑藥時曲線下面積，D非靜脈為非靜脈給藥途徑給藥劑量，結(jié)果見表2。

表2 不同劑量沒食子酸在大鼠體內(nèi)的藥物動力學參數(shù)

3 討論

3.1樣品處理方法的優(yōu)化 前期預實驗時對比了有機溶劑(乙腈、甲醇)沉淀法、強酸(1 mol·L-1鹽酸、體積分數(shù)為10%的三氯乙酸)沉淀法等直接沉淀樣品蛋白的方法，樣品經(jīng)處理后進樣分析所得色譜圖雜質(zhì)峰較多，且強度較強，對目標峰造成一定干擾。后改用1 mol·L-1鹽酸預處理樣品溶液，再用乙酸乙酯分別萃取2次，合并萃取液經(jīng)氮氣吹干的方法[4]。采用該預處理方法進樣分析所得色譜圖，干擾峰較少，響應信號全面，能夠滿足實驗需求。

3.2色譜條件的優(yōu)化 本實驗采用與沒食子酸分子結(jié)構(gòu)及保留時間相對接近的4-乙酰氨基酚為內(nèi)標，采用甲醇-水洗脫系統(tǒng)對沒食子酸和4-乙酰氨基酚進行洗脫分離，當甲醇-水的比例為5∶95時，沒食子酸和4-乙酰氨基酚色譜峰均與內(nèi)源性響應信號峰分離良好[4]。由于結(jié)構(gòu)中強極性基團與反相色譜柱填料硅膠中的羥基之間的相互作用，沒食子酸和4-乙酰氨基酚在測定過程中均存在不同程度的拖尾現(xiàn)象，本實驗在洗脫系統(tǒng)中加入適量競爭性的有機酸(體積分數(shù)為1.9%的冰醋酸)，可使硅膠羥基吸附達到飽和，從而有效改善峰形，增加峰對稱性。預實驗考察了依利特、Woburn、Kromasil等反相色譜柱的分離效果，結(jié)果顯示，Woburn Stamsil ODS-BP C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱的分離效果較好，故選用其為正式實驗分析測試柱。沒食子酸及4-乙酰氨基酚供試品經(jīng)二極管陣列檢測器掃描后均顯示在272 nm波長處有強吸收，故確定色譜檢測波長為272 nm。

3.3沒食子酸的藥物動力學研究 沒食子酸不同劑量灌胃給藥后，10 min即可在血漿樣品中被檢出，但血藥質(zhì)量濃度約在90 min才達到最大值。Konishi Y等[18]研究表明，沒食子酸跨腸上皮細胞膜轉(zhuǎn)運方式為細胞旁路通道轉(zhuǎn)運，非極化且與pH值無關(guān)，推測沒食子酸的吸收速率受胞膜孔道數(shù)量及緊密連接蛋白表達程度的影響[19]。大鼠灌胃50、100、200 mg·kg-1沒食子酸后，Cmax隨劑量升高而成比例遞增，分別為(0.83±0.15)、(1.71±0.29)、(3.13±0.56) μg·mL-1，AUC0～t隨劑量增加而成比例遞增，分別為(137.07±24.75)、(262.55±22.05)、(501.64±31.64) mg·min·L-1，而MRT0～t、CL及t1/2相對恒定，表明在給藥劑量范圍內(nèi)，沒食子酸在大鼠體內(nèi)呈現(xiàn)典型的線性藥物動力學特征。此外，不同劑量沒食子酸灌胃后Vd分別為(78.52±8.51)、(89.60±10.53)、(83.56±10.64) L·kg-1，說明其在組織中可以廣泛分布。靜脈注射沒食子酸后，血藥質(zhì)量濃度在分布相下降迅速，至90 min后以較緩慢的速度從體內(nèi)消除，其CL約為0.061 L·min-1·kg-1。根據(jù)2.5項下公式計算得出沒食子酸的Fabs較低，平均值約為14.71。文獻報道[20]，大鼠口服沒食子酸后腹主動脈沒食子酸質(zhì)量濃度與門靜脈中的質(zhì)量濃度幾乎相同，藥物受腸道菌群及肝藥酶的影響較小。因此，與沒食子酸的首過效應相比，腸道上皮細胞膜的透過性更可能是影響沒食子酸生物利用度的因素，這也提示我們在未來開發(fā)基于沒食子酸的新藥時應設(shè)計更加適合其吸收的新型遞藥系統(tǒng)。