大鼠良性前列腺增生模型的建立及評(píng)估

王文地，鄭玉婷，馬 允，張玥輝，崔 潔，侯俊玲，3*，王文全，，3*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；3.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 102488)

良性前列腺增生(BPH)是中老年男性常見疾病，且隨著年齡的增長發(fā)病率逐漸增加，80歲以上發(fā)病率高達(dá)69.2%[1-2]。前列腺增生臨床表現(xiàn)為梗阻性或刺激性癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致血尿、膀胱結(jié)石和腎功能衰竭[3-4]。目前用于體內(nèi)研究的BPH模型有異種移植模型、轉(zhuǎn)基因小鼠模型、激素誘導(dǎo)模型、自發(fā)(猩猩/狗)模型[5]，其中外源性丙酸睪酮(TP)誘導(dǎo)的BPH大鼠模型由于其操作方便，在國內(nèi)外研究中廣泛使用，但目前仍缺少對(duì)TP注射量的相關(guān)研究。本文旨在針對(duì)外源性激素誘導(dǎo)大鼠BPH模型進(jìn)行探討，明確其對(duì)前列腺產(chǎn)生的影響，以血清雙氫睪酮(DHT)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、表皮生長因子(EGF)和BCL-2相關(guān)X蛋白(Bax)表達(dá)水平作為判斷是否建模成功的指標(biāo)，補(bǔ)充TP注射量的相關(guān)研究；同時(shí)考慮到泌尿系統(tǒng)病變是前列腺增生的潛在并發(fā)癥，在傳統(tǒng)BPH模型成功因素的基礎(chǔ)上增加了腎功能檢測，觀察外源性睪酮誘導(dǎo)模型對(duì)大鼠腎功能的影響，以補(bǔ)充驗(yàn)證該模型是否同樣具備這一臨床癥狀。本研究還以建模完成后1個(gè)月為時(shí)間節(jié)點(diǎn)，探索該模型維持時(shí)間及造模對(duì)大鼠體質(zhì)量、臟器指數(shù)的影響與機(jī)體自行恢復(fù)情況。

1 儀器與材料

1.1儀器 3K15型臺(tái)式離心機(jī)(德國Sigma公司)；FA2004N型電子分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；120型全自動(dòng)生化儀(日本東芝公司)；TEK-Ⅱ mini型血細(xì)胞分析儀(江西特康公司)；Multiskan FC型酶標(biāo)儀(上海賽默飛世爾儀器有限公司)；JJ-12J型脫水機(jī)和JB-P5型包埋機(jī)，均購自武漢俊杰電子有限公司；RM2016型病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)。

1.2試藥 丙酸睪酮注射液(批號(hào)080231055)，哈爾濱三馬獸藥業(yè)有限公司；尿素氮(UREA)、肌酐(CREA)和血糖(GLU)(批號(hào)分別為20190701、20190901、20190901)，北京北檢新創(chuàng)源生物技術(shù)有限公司；雙氫睪酮(DHT)、表皮生長因子(EGF)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)和BCL-2相關(guān)X蛋白(Bax)試劑盒(批號(hào)分別為ml002998、ml003029、ml202807、ml2544569)，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；水合氯醛(批號(hào)20181017)，天津市福晨化學(xué)試劑廠；100 mL·L-1中性甲醛溶液(批號(hào)20181212)，北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠40只，雄性，體質(zhì)量為280～320 g，由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供，許可證編號(hào)：SCXK(京)2019-0010，動(dòng)物被安置在(22±2) ℃、相對(duì)濕度為55%±5%的層流氣流室中。在12 h明暗交替的循環(huán)中，給大鼠提供標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室飲食和隨意飲水，所有SD大鼠均于常規(guī)條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1TP誘導(dǎo)模型的成模劑量考察實(shí)驗(yàn) 將24只雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為對(duì)照組以及TP低、中、高劑量組，每組6只，分籠喂養(yǎng)。造模期間，對(duì)照組皮下注射大豆油(0.001 mL·g-1)，TP低、中、高劑量組分別皮下注射16.7、33.3、50.0 mg·kg-1的TP，2 d 1次，連續(xù)4周。在最后1次治療后禁食24 h，腹主動(dòng)脈取血，處死大鼠。切除前列腺，稱定質(zhì)量，用100 mL·L-1中性甲醛溶液固定，進(jìn)行常規(guī)組織處理和HE染色。所有血樣靜置2 h后以4 000 r·min-1離心10 min，收集血清，于-80 ℃條件下儲(chǔ)存，根據(jù)DHT、EGF、IGF-1和Bax的Elisa試劑盒說明書檢測各組大鼠血清中各指標(biāo)的表達(dá)水平，并用全自動(dòng)生化儀檢測血清中CREA、UREA和GLU的表達(dá)水平。

2.2大鼠BPH模型評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn) 將16只雄性SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為對(duì)照組(處理方法同2.1項(xiàng)下)和TP高劑量組，每組8只，分籠飼養(yǎng)。造模4周，每組隨機(jī)選取4只大鼠于末次給藥后禁食24 h，處死，將此時(shí)間節(jié)點(diǎn)記為實(shí)驗(yàn)第4周。其余4只大鼠留置28 d恢復(fù)期，期間記錄每周體質(zhì)量，處死，將此時(shí)間節(jié)點(diǎn)記為實(shí)驗(yàn)第8周。仔細(xì)采集各組大鼠前列腺、肝臟、腎臟、睪丸、脾臟和胸腺，稱定質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)(臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量÷體質(zhì)量×100%)。大鼠血清處理方法同2.1項(xiàng)下。

3 結(jié)果與分析

3.1TP誘導(dǎo)大鼠前列腺組織變化 前列腺指數(shù)是判斷BPH造模成功與否的重要指標(biāo)。注射4周后，TP高、中、低劑量組的前列腺指數(shù)均顯著高于對(duì)照組。BPH的臨床病理學(xué)特征是前列腺基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞增殖[6-8]，不同劑量TP誘導(dǎo)對(duì)前列腺形態(tài)的影響見圖1。由圖1可知，對(duì)照組前列腺組織學(xué)表現(xiàn)正常，上皮細(xì)胞呈立方或柱狀。TP高、中、低劑量組前列腺均顯示腺體結(jié)構(gòu)較差，有嚴(yán)重的細(xì)胞增生和壞死病變；TP低劑量組上皮細(xì)胞層和基質(zhì)細(xì)胞間隙均大于對(duì)照組，前列腺內(nèi)可見空泡；TP中劑量組腺體中度增生；TP高劑量組前列腺組織的組織結(jié)構(gòu)被破壞，上皮細(xì)胞及組織間隙嚴(yán)重增生。3個(gè)不同劑量組間比較，TP高劑量組間質(zhì)細(xì)胞增殖程度高。

圖1 TP對(duì)大鼠前列腺組織病理學(xué)變化的影響 (HE染色，×200)

3.2不同劑量TP誘導(dǎo)的大鼠血清生化因子變化情況 以血清DHT、EGF、IGF-1和Bax表達(dá)水平為指標(biāo)，對(duì)TP低、中、高劑量組大鼠進(jìn)行比較研究，篩選適宜成模劑量，見表1。由表1可知，BPH與體內(nèi)性激素的代謝密切相關(guān)，特別是與雄激素受體結(jié)合的DHT，可刺激前列腺間質(zhì)和腺體的增生[9-10]。與對(duì)照組相比，TP高劑量組血清DHT水平顯著升高，而TP中、低劑量組則無顯著差異。有研究認(rèn)為，DHT能夠調(diào)節(jié)生長因子并通過旁分泌信號(hào)誘導(dǎo)增殖[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1可促進(jìn)前列腺上皮細(xì)胞有絲分裂[13]，EGF也可通過作用于前列腺細(xì)胞膜上的受體促進(jìn)細(xì)胞分裂[14]。TP高、低劑量組的IGF-1和EGF的水平均顯著高于對(duì)照組，而TP中劑量組則顯著低于對(duì)照組。除了生長因子的作用外，研究發(fā)現(xiàn)BPH與細(xì)胞凋亡異常減少也有一定關(guān)聯(lián)[15-16]。與對(duì)照組相比，TP高、中劑量組的Bax表達(dá)水平明顯較低，而與TP低劑量組比較則無明顯差異。綜上所述，皮下注射50.0 mg·kg-1TP是制備非去勢大鼠BPH模型的適宜劑量。

表1 TP低、中、高劑量組血清檢測指標(biāo)對(duì)比結(jié)果

3.3造模對(duì)大鼠腎功能的影響 基于BPH造型成功性考察中相關(guān)生化因子結(jié)果，對(duì)比TP高劑量組大鼠與對(duì)照組間腎功能因子表達(dá)水平，觀察DHT誘導(dǎo)對(duì)腎臟的影響，見表2。在臨床檢驗(yàn)中，血清GLU、UREA和CREA的表達(dá)水平常作為腎功能是否異常的評(píng)價(jià)指標(biāo)[17]。由表2可知，TP誘導(dǎo)4周后，TP高劑量組腎臟指數(shù)顯著高于對(duì)照組，CREA和GLU表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，UREA表達(dá)水平與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，在50.0 mg·kg-1劑量下制備BPH模型對(duì)大鼠腎臟功能有一定影響。

表2 TP高劑量組對(duì)腎功能的影響

3.4模型維持時(shí)間的評(píng)價(jià) 見表3。由表3可知，實(shí)驗(yàn)第4周，TP高劑量組大鼠的前列腺指數(shù)和DHT表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)第8周，TP高劑量組大鼠前列腺指數(shù)仍明顯高于對(duì)照組，但DHT表達(dá)水平與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TP高劑量組大鼠DHT表達(dá)水平在28 d后恢復(fù)正常，表明該模型維持時(shí)間少于28 d。

表3 2個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)前列腺指數(shù)與DHT檢測結(jié)果

3.5造模對(duì)大鼠體質(zhì)量影響的評(píng)價(jià) 見表4。由表4可知，在皮下注射期間，從實(shí)驗(yàn)第2周開始，TP高劑量組大鼠體質(zhì)量顯著低于對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)第8周，TP高劑量組大鼠體質(zhì)量仍顯著低于對(duì)照組，但差異逐漸減小。結(jié)果表明，TP誘導(dǎo)的BPH模型對(duì)大鼠體質(zhì)量下降有影響，停藥后逐漸恢復(fù)。

表4 模型評(píng)價(jià)研究的各周體質(zhì)量變化

3.6造模對(duì)大鼠各臟器指數(shù)的影響 見表5。由表5可知，實(shí)驗(yàn)第4周，TP高劑量組腎臟指數(shù)和睪丸指數(shù)均明顯高于對(duì)照組，胸腺指數(shù)和肝臟指數(shù)顯著低于對(duì)照組，2組間脾臟指數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)第8周，TP高劑量組腎臟指數(shù)仍顯著高于對(duì)照組，而胸腺、睪丸、脾臟、肝臟指數(shù)與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，注射TP使大鼠腎臟和睪丸指數(shù)增加，胸腺和肝臟指數(shù)降低，實(shí)驗(yàn)第8周，胸腺、睪丸、肝臟指數(shù)恢復(fù)正常，但腎臟指數(shù)并未恢復(fù)。

表5 2個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)各臟器指數(shù)檢測結(jié)果

4 討論

建立完善的BPH大鼠模型可以為有效藥物的選擇奠定基礎(chǔ)[18]。在本研究中，TP高劑量組的前列腺上皮細(xì)胞增厚，表現(xiàn)為前列腺增生，前列腺指數(shù)及血清中DHT、EGF和IGF-1的表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，Bax的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，可能通過抑制細(xì)胞凋亡而延長細(xì)胞存活時(shí)間，表明皮下注射50 mg·kg-1TP可成功建立大鼠BPH模型。TP中劑量組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TP中、低劑量組血清Bax及DHT水平均與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，不能認(rèn)為造模成功。BPH的發(fā)生被認(rèn)為是雌激素和雄激素比例變化的結(jié)果[19-20]，Mbaka G等[21]用交錯(cuò)劑量的外源性睪酮和雌二醇誘導(dǎo)大鼠前列腺增生。結(jié)合上述研究和本研究中TP低劑量組數(shù)據(jù)，考慮是否為內(nèi)源性激素反饋效應(yīng)。這一研究結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了劑量研究的必要性[22-24]。

有研究發(fā)現(xiàn)，雄激素及其受體通過激活腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)，導(dǎo)致炎癥加重，對(duì)腎臟產(chǎn)生不利影響[25-26]，而腎臟作為泌尿系統(tǒng)的重要器官，與前列腺增生密切相關(guān)，目前較少研究將腎功能作為參數(shù)之一。本研究檢測了腎功能指標(biāo)的變化，有助于更好地理解BPH的發(fā)病機(jī)制，并為解決其并發(fā)癥制定新的策略[27]。此外，許多研究者設(shè)計(jì)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)來篩選BPH藥物，考慮到藥物的肝腎毒性，但常常忽視模型本身可能引起的肝腎功能不全。本研究數(shù)據(jù)顯示，TP誘導(dǎo)的BPH模型大鼠腎功能不全，腎臟指數(shù)較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，也會(huì)引起GLU、CREA水平異常降低(P<0.05)。

本研究結(jié)果顯示，TP會(huì)引起大鼠體質(zhì)量及胸腺、睪丸和肝臟指數(shù)異常(P<0.05)，在實(shí)驗(yàn)第8周，該異常逐漸恢復(fù)，但腎臟指數(shù)仍高于對(duì)照組(P<0.05)。在實(shí)驗(yàn)第8周，檢測大鼠前列腺指數(shù)及DHT表達(dá)水平，DHT表達(dá)水平已恢復(fù)正常(P>0.05)。因此，基于該模型進(jìn)行藥效學(xué)研究時(shí)，藥物的治療周期應(yīng)盡量與造模同期進(jìn)行，以降低造模后的機(jī)體自我恢復(fù)能力對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生假陽性影響。