異葉青蘭總黃酮的含量測定及體外抗氧化活性研究

馬雪潔，程路峰，楊淑梅*，何雯（.新疆醫(yī)科大學藥學院，烏魯木齊 8300；.成都市第五人民醫(yī)院，成都 630）

異葉青蘭（Dracocephalum heterophyllumBenth）別名白花夏枯草、甜蜜罐、龍頭草、白花梔子花，為唇形科青蘭屬多年生草本植物，在我國主要分布于新疆、內蒙古、西藏、青海、寧夏、甘肅等地。研究發(fā)現異葉青蘭含有揮發(fā)油類、黃酮類、有機酸類、生物堿類、多糖類、萜類、木質素類等化學成分[1-3]。主要用于高血壓、支氣管炎、肺熱、肝火頭痛、淋巴結炎、口腔潰瘍等[4-7]。近年來有研究表明，異葉青蘭的提取物具有抗高血壓、心血管保護、抗缺氧、抗病毒等藥理作用[8-9]，但對其抗氧化作用研究較少，因此本實驗通過回流提取、純化制備異葉青蘭中總黃酮，采用硝酸鋁比色法進行含量測定，通過檢測異葉青蘭總黃酮清除DPPH、ABTS自由基能力和總抗氧化能力，評價其體外抗氧化活性，以期為該藥材的開發(fā)應用提供參考依據。

1 材料

1.1 試藥

異葉青蘭采自新疆阿克陶縣，經中國科學院新疆理化技術研究所沈觀冕研究員鑒定為青蘭屬植物異葉青蘭全草。

亞硝酸鈉、硝酸鋁（分析純，天津永晟精細化工有限公司）；無水乙醇（分析純，天津市致遠化學試劑有限公司）；蘆丁對照品（批號：SR8250，含量≥98%）、維生素C對照品（批號：SV2180，純度＞98%）（中國食品藥品檢定研究院）；ABTS自由基清除能力檢測試劑盒（貨號：BC1315）、總抗氧化能力檢測試劑盒（貨號：BC4770）（北京索萊寶科技有限公司）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，東京化成工業(yè)株式會社，純度＞97%）。

1.2 儀器

N-1100型旋轉蒸發(fā)器（上海泉杰儀器有限公司）；YB202N電子天平（上海怡臺電子科技有限公司）；XMTD-7000型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；島津UV-2550型紫外分光光度計（日本島津公司）；Multiskan GO型全自動酶標儀（Thermo美國）；KQ3200D型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法與結果

2.1 異葉青蘭總黃酮的提取與純化

根據課題組前期研究確定的提取工藝，取異葉青蘭全草1 kg，粉碎，加入70%乙醇（料液比＝1∶40，g/mL），50℃加熱回流提取3次，每次提取2 h，收集3次提取液，旋轉蒸發(fā)濃縮。用適量蒸餾水稀釋上述濃縮后的液體，以70%乙醇作為洗脫劑，AB-8大孔吸附樹脂層析柱洗脫純化，收集純化后的液體，旋蒸濃縮后冷凍干燥，粉碎備用，異葉青黃酮得率為3.6%。

2.2 溶液的制備

2.2.1 蘆丁對照品溶液的制備 精密稱量蘆丁對照品10 mg用70%乙醇充分溶解，并定容至50 mL，搖勻備用，即得質量濃度為0.2 mg·mL－1的蘆丁對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取異葉青蘭總黃酮粉末0.1 g，加入70%乙醇，超聲溶解，并定容至50 mL，搖勻備用，即得質量濃度為2 mg·mL－1的異葉青蘭總黃酮溶液。

2.2.3 顯色溶液的制備

① 5% NaNO2溶液的制備：精密稱量亞硝酸鈉2.5 g，加入蒸餾水，充分溶解并定容至50 mL，搖勻備用。

② 10% Al（NO3）3溶液的制備：精密稱量硝酸鋁5.0 g，加入蒸餾水，充分溶解并定容至50 mL，搖勻備用。

③ 4% NaOH溶液的制備：精密稱量氫氧化鈉4.0 g，加入蒸餾水，充分溶解并定容至100 mL，搖勻備用。

④ 0.04 mg·mL－1的DPPH溶液的制備：精密稱取DPPH粉末4.0 mg，用95%乙醇溶解定容至100 mL，搖勻備用。

2.3 顯色方法及最大吸收波長選擇

參考文獻[10]方法，精密量取蘆丁對照品溶液和供試品溶液各1 mL置于25 mL量瓶，分別加入5% NaNO2溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，分別加入10% Al（NO3）3溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，加入4% NaOH溶液10 mL搖勻，并用70%乙醇定容至25 mL，靜置30 min。以70%乙醇為空白溶液，于400～800 nm波長處掃描各溶液，確定最大吸收波長為510 nm。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 精密吸取“2.2.1”項下蘆丁對照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于25 mL量瓶中，按“2.3”項下顯色方法依次加入顯色溶液，以顯色后的空白對照溶液調零，于λ＝510 nm處測定吸光度值，以蘆丁對照品溶液質量濃度（mg·mL－1）為橫坐標，吸光度為縱坐標進行線性回歸并繪制標準曲線，得回歸方程為：Y＝12.08X－0.0103，R2＝0.9997。結果表明，蘆丁對照品質量濃度在0.008～0.048 mg·mL－1內與吸光度具有良好的線性關系。

2.4.2 精密度試驗 精密量取“2.2.1”項下蘆丁對照品2 mL，按“2.3”項下顯色方法依次加入顯色溶液，于λ＝510 nm波長處，連續(xù)重復6次測定蘆丁對照品吸光度，根據結果計算RSD為0.12%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復性試驗 精密稱量異葉青蘭總黃酮樣品50.0 mg，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，精密量取0.5 mL，按“2.3”項下方法顯色，于λ＝510 nm波長處測定6份供試品溶液的吸光度，根據結果計算RSD為1.9%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 精密量取0.5 mL供試品溶液，按“2.3”項下方法室溫放置顯色，以顯色后的空白對照溶液調零，分別在0、15、30、45、60 min時測定供試品溶液吸光度，根據結果計算RSD為1.6%（n＝6），表明供試品在60 min內穩(wěn)定。

2.5 含量測定

精密稱量異葉青蘭總黃酮粉末50.0 mg，按“2.2.2”項下方法制備異葉青蘭總黃酮溶液，精密量取0.5 mL，按“2.3”項下顯色方法進行顯色，于λ＝510 nm波長處測定吸光度值。并將吸光度代入線性回歸方程，按下式計算異葉青蘭總黃酮含量。總黃酮含量（%）＝（C×V1×V3）/（V2×W）×100%，結果異葉青蘭總黃酮的平均含量為48.6%。其中C為總黃酮濃度，V1為異葉青蘭總黃酮供試品母液體積，V2為從供試品母液中量取的體積，V3為測定時溶液的總體積，W為稱取總黃酮樣品的質量。

2.6 異葉青蘭總黃酮體外抗氧化活性測定

2.6.1 DPPH自由基清除能力測定 參考文獻[11]的方法，并稍作調整。精密吸取1 mL不同質量濃度的異葉青蘭總黃酮于試管中，分別加入2 mL DPPH溶液，將其混合搖勻，室溫避光反應30 min，于517 nm波長處測得樣品吸光度值A樣品。吸取75%乙醇1 mL，再加入95%乙醇2 mL，混勻后，517 nm處測得吸光度值A對照。吸取1 mL75%乙醇于試管內，再加入2 mL DPPH溶液，測得其吸光度值A空白。同法精密移取1 mL不同質量濃度維生素C作為樣品溶液，用1 mL的蒸餾水替代樣品溶液，分別加入2 mL DPPH或95%乙醇作為空白或對照，測得吸光度。按下式分別計算異葉青蘭總黃酮和維生素C對DPPH自由基的清除率。DPPH自由基的清除率（%）＝[A空白－（A樣品－A對照）]/A對照×100%。結果當異葉青蘭總黃酮的質量濃度為0.01～0.6 mg·mL－1時，隨著質量濃度的增大，異葉青蘭總黃酮清除DPPH自由基的能力逐漸增強，且有較為顯著的量效關系。當質量濃度達到0.6 mg·mL－1時，其清除率高達82.94%。而當質量濃度大于0.6 mg·mL－1時，其對DPPH自由基的清除率增長幅度逐漸變小。與維生素C相比，異葉青蘭總黃酮對DPPH自由基的清除能力稍弱。通過SPSS 21.0 軟件分析，異葉青蘭總黃酮和維生素 C 清除DPPH自由基的IC50值分別為0.063 mg·mL－1和0.012 mg·mL－1（見圖1）。

圖1 異葉青蘭總黃酮對DPPH自由基清除率曲線Fig 1 Scavenging rate curve of the total flavonoids of Dracocephalum heterophyllum Benth on DPPH free radicals

2.6.2 ABTS自由基清除能力測定 參考文獻[12]按照試劑盒說明配制ABTS工作液并按步驟進行操作，酶標儀預熱30 min以上，調節(jié)波長至405 nm測定。按下式分別計算異葉青蘭總黃酮和維生素C的ABTS自由基清除能力。ABTS自由基清除率（%）＝[A空白－（A樣品－A對照）]/A空白×100%。結果當質量濃度為0.01～0.4 mg·mL－1時，隨著質量濃度的增大，異葉青蘭總黃酮對ABTS自由基的清除能力逐漸增強，有明顯的量效關系。且質量濃度為0.4 mg·mL－1時，其清除率可高98.48%。而當質量濃度大于0.4 mg·mL－1時，其對ABTS 自由基的清除率的增長趨勢逐漸變緩。當維生素C 的質量濃度在0.01～1 mg·mL－1時，隨著質量濃度的增大，其清除自由基能力也增大，且當質量濃度為0.1 mg·mL－1時，清除率高達98.42%。而當質量濃度大于0.1 mg·mL－1時，其對ABTS 自由基的清除率的增長趨勢逐漸變緩。當質量濃度達到0.4 mg·mL－1時，其清除ABTS自由基的能力與維生素C 相當。通過SPSS 21.0 軟件分析，異葉青蘭總黃酮和維生素C清除ABTS自由基的IC50值分別為0.079 mg·mL－1和0.028 mg·mL－1（見圖2）。

圖2 異葉青蘭總黃酮對ABTS 自由基清除率曲線Fig 2 Scavenging rate curve of the total flavonoids of Dracocephalum heterophyllum Benth on ABTS free radicals

2.6.3 總抗氧化能力測定 按照試劑盒說明進行操作，制備40 μmol·mL－1FeSO4標準溶液，并將其用蒸餾水稀釋至不同濃度梯度，提前30 min預熱酶標儀，調節(jié)波長至593 nm測定測定吸光度，以Fe2＋終濃度為橫坐標，對應的吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，并按下式分別計算異葉青蘭總黃酮和維生素C 總抗氧化能力。總抗氧化能力（μmol·mL－1）＝X×V反總/V樣＝34X，其中V反總指反應總體積，V樣為反應中樣本體積。以Fe2＋終濃度為橫坐標，以△A為縱坐標（其中△A指樣品的抗氧化能力以達到同樣吸光度變化值），X指樣品扣除空白后的吸光度代入回歸方程得到的Fe2＋當量（μmol·L－1）。結果在本實驗研究濃度范圍內，隨著異葉青蘭總黃酮質量濃度的增大，其總抗氧化能力也增大，當質量濃度達到1 mg·mL－1時，其總抗氧化能力值為5.81 μmol·mL－1。隨著質量濃度的增大，維生素C總抗氧化能力逐漸增強，當質量濃度達到1 mg·mL－1時，其總抗氧化能力值為10.79 μmol·mL－1，是相同濃度異葉青蘭總黃酮總抗氧化能力的1.86倍，故維生素C的總抗氧化能力強于異葉青蘭總黃酮（見圖3）。

圖3 異葉青蘭總黃酮總抗氧化能力Fig 3 Total antioxidant capacity of total flavonoid of Dracocephalum heterophyllum Benth

3 討論

本實驗采用70%乙醇加熱回流提取、純化得到異葉青蘭總黃酮提取物。通過硝酸鋁比色法測定異葉青蘭總黃酮含量，測得異葉青蘭總黃酮平均含量為48.6%，所建立的方法操作簡便。近年來，大量研究表明，許多疾病的發(fā)生都與自由基以及人體氧化應激狀態(tài)有關[13]。自由基是一種由機體氧化反應而產生的具有較強的氧化性的有害化合物，它能損害人體的組織和細胞，并引起多種慢性疾病的發(fā)生[14]。DPPH是一種性質穩(wěn)定且其醇溶液顯深紫色的自由基，該自由基在517 nm處存在吸收峰[15]。ABTS自由基清除能力檢測法可用于親水性和親脂性物質抗氧化能力測定。經氧化后的ABTS可生成穩(wěn)定的ABTS＋自由基，該陽離子呈藍綠色，在405 nm或734 nm波長處有最大吸收峰[16]。本實驗通過檢測異葉青蘭總黃酮清除DPPH、ABTS自由基的能力以及總抗氧化能力，發(fā)現異葉青蘭總黃酮質量濃度與其清除自由基以及抗氧化能力之間存在一定的量效關系，提示可以對該藥材在抗氧化方面的應用做更深入的研究。