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    新型α-葡萄糖苷酶抑制劑YG-18在小鼠體內(nèi)的降糖作用、分子對接及急性毒性研究

    2021-07-03 08:18:32閻成炟郭崇真張東虎趙凌霄林建陽中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部沈陽110001中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院沈陽110122
    中南藥學(xué) 2021年6期
    關(guān)鍵詞:波糖阿卡糖苷酶

    閻成炟,郭崇真,張東虎,趙凌霄,林建陽*(1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部,沈陽 110001;2.中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,沈陽 110122)

    糖尿病是一種以高血糖為主要臨床特點的常見的慢性內(nèi)分泌性疾病。國際糖尿病聯(lián)盟的數(shù)據(jù)顯示,2015年全球糖尿病患病率為8.8%,預(yù)計2040年成人糖尿病患病率將上升到10.4%[1]。在我國成年人中,糖尿病的患病率高達(dá)11.6%[2],而其中占比非常高的便是2型糖尿病。2型糖尿病,即非胰島素依賴型糖尿病,是糖尿病最常見的類型,占所有糖尿病病例的90%以上[3]。控制餐后血糖是治療2型糖尿病的關(guān)鍵。

    α-葡萄糖苷酶抑制劑可以抑制小腸刷狀緣上的α-葡萄糖苷酶對碳水化合物的轉(zhuǎn)化,從而延緩葡萄糖吸收,降低餐后血糖,在全球被廣泛應(yīng)用于2型糖尿病的一線治療[4]。此外,除降糖活性,α-葡萄糖苷酶抑制劑還被發(fā)現(xiàn)與腫瘤轉(zhuǎn)移[5]、干擾宿主細(xì)胞的N-寡糖鏈生物合成以阻止病毒復(fù)制有關(guān)[6]。α-葡萄糖苷酶抑制劑具有起效快速且安全性高的特點。目前,在臨床上使用的上市藥物主要是阿卡波糖(acarbose)、伏格列波糖(voglibose)和米格列醇(miglitol)。傳統(tǒng)上對于α-葡萄糖苷酶抑制劑的開發(fā)與研究大多基于其擬糖骨架結(jié)構(gòu),例如亞胺糖、硫糖、二糖等結(jié)構(gòu)[7-8]。然而,傳統(tǒng)的研究開發(fā)面臨著諸多問題,比如活性差、自然豐度低和立體化學(xué)過于復(fù)雜等[9]。因此,對于非糖α-葡萄糖苷酶抑制劑的開發(fā)具有廣闊前景[10-11]。

    根據(jù)前期報道[12],將苯磺酰胺查爾酮結(jié)構(gòu)整合到苯并吡喃中,設(shè)計得到的3-[4-(苯基磺酰胺)苯甲酰]-2H-1-苯并吡喃-2-酮結(jié)構(gòu),具有成為非糖α-葡萄糖苷酶抑制劑的巨大潛力。在前期研究中,該系列化合物中體外活性最強(qiáng)的化合物YG-18(如圖1)的半數(shù)抑制濃度(IC50)為(0.014±0.003)μmol·L-1,高于陽性對照藥物阿卡波糖。為了探究該藥物在體內(nèi)的降低糖負(fù)荷后的血糖藥效和作用機(jī)制、藥物與酶活性部位可能的相互作用模式與安全性,本研究考察了該系列化合物中的YG-18在正常大鼠體內(nèi)對蔗糖和葡萄糖負(fù)荷后的影響,并通過分子模擬分析研究了其對α-葡萄糖苷酶的抑制行為。最后,根據(jù)OECD急性毒性實驗指導(dǎo)原則[13]觀察了該藥物單次口服4 h、48 h和14 d的毒性反應(yīng)、臟器情況和存活狀態(tài)的急性經(jīng)口毒性。

    圖1 YG-18的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 1 Chemical structure of YG-18

    1 材料

    1.1 試藥

    YG-18(沈陽藥科大學(xué)藥物化學(xué)教研室,純度≥ 98.0%);阿卡波糖(艾覽化工科技有限公司);二甲基亞砜(DMSO,天津市大茂化學(xué)試劑廠);聚氧乙烯蓖麻油EL、甘油(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司);蔗糖、葡萄糖等試劑均為分析純。

    1.2 儀器

    One Touch Ultra Vue血糖儀[強(qiáng)生(中國)醫(yī)療器材有限公司];SQP電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);D3024R離心機(jī)(大龍興創(chuàng)實驗儀器股份公司);體重秤(慈溪市天東衡器廠);恒溫超聲儀(上海柯祁儀器設(shè)備有限公司)。

    1.3 實驗動物

    SPF級ICR小鼠(22~24 g),SPF級KM小鼠(22~24 g)[遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(遼)2020-0001]。

    2 方法

    2.1 YG-18單次給藥對正常ICR小鼠蔗糖、葡萄糖負(fù)荷后血糖影響

    小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)兩周后,ICR小鼠48只,隨機(jī)分為正常組、陽性藥物阿卡波糖組(Acar,9.6 mg·kg-1,ig)和YG-18組(7.23 mg·kg-1,ig)[14],每組8只,雌雄各半,每個實驗組平行設(shè)置兩組。其中藥物溶媒由0.67% DMSO、5% 聚氧乙烯蓖麻油EL、3% 甘油與生理鹽水組成。正常組給予空白溶媒進(jìn)行灌胃給藥。阿卡波糖組、YG-18組灌胃對應(yīng)的藥物。

    禁食不禁水12 h后,平行設(shè)置的兩組小鼠分別灌胃給予蔗糖(4.0 g·kg-1)和葡萄糖(2.0 g·kg-1)負(fù)荷,用尾部采血法,通過血糖儀測定空腹血糖及給藥后0.5、1、2 h的血糖值,并計算血糖曲線下面積(AUC)。

    2.2 分子對接實驗

    利用Chemdraw 19.0繪制出阿卡波糖與YG-18的化學(xué)結(jié)構(gòu),使用Chem3D 19.0將其轉(zhuǎn)變?yōu)?D結(jié)構(gòu),并對其進(jìn)行構(gòu)象的優(yōu)化。分子對接研究使用Discovery Studio v16.1進(jìn)行。對接計算采用從PDB數(shù)據(jù)庫中獲得的α-葡萄糖苷酶與葡萄糖絡(luò)合物(PDB代碼:3A4A)的晶體結(jié)構(gòu)。去除蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中所有的結(jié)合水,并將所有的氫原子添進(jìn)結(jié)構(gòu)中。該蛋白質(zhì)前期進(jìn)行制備、優(yōu)化和能量最小化處理。以α-葡萄糖苷酶共結(jié)晶的活性結(jié)合位點設(shè)置配體對接的空間,采用拉馬克遺傳算法進(jìn)行對接實驗。對接的多種結(jié)合結(jié)果中,選取了能量最低的構(gòu)象為本次實驗對藥物與酶抑制方式的預(yù)測構(gòu)象。最后,使用Pymol和Discovery Studio v16.1繪制藥物與酶結(jié)合方式構(gòu)象。

    2.3 急性經(jīng)口毒性實驗

    根據(jù)OECD急性毒性實驗指導(dǎo)原則[13],將50只KM小鼠隨機(jī)分為4組給藥組與1組空白對照組,每組10只,雌雄各半。因YG-18無毒性資料可以參考且水溶性差,故給藥組采用的是OECD急性毒性實驗指導(dǎo)原則中推薦的175、550、1750、2000 mg·kg-1的序列給藥劑量,并使用羧甲基纖維素鈉配制混懸液灌胃給藥,除限定濃度2000 mg·kg-1外,其余對數(shù)劑量間隔1/2。

    禁食不禁水12 h后,空白對照組小鼠給予溶媒羧甲基纖維素鈉單次灌胃處理,給藥組單次灌胃給藥處理,每組序貫進(jìn)行。給藥當(dāng)日連續(xù)觀察4 h,之后固定時間間隔觀察48 h。如果組內(nèi)死亡小鼠數(shù)量大于半數(shù),則降低下一組小鼠給藥劑量;如果組內(nèi)死亡小鼠數(shù)量小于半數(shù),則提高下一組小鼠給藥劑量。每一組存活動物均觀察14 d,后期死亡動物在統(tǒng)計時記為死亡。觀察結(jié)束后處死小鼠,解剖后觀察各組小鼠的器官的形態(tài)、顏色、質(zhì)地等有無明顯變化。

    2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

    使用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,分析模型選取單因素方差分析(one-way ANOVA),P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義,實驗中的數(shù)據(jù)采用Graph Pad Prism 8繪制作圖。

    3 結(jié)果

    3.1 YG-18單次給藥對正常ICR小鼠口服蔗糖、葡萄糖負(fù)荷后血糖水平影響

    為了驗證YG-18在體外降低餐后血糖的藥效和作用機(jī)制,選取正常ICR小鼠作為模型,單次給藥后,分別記錄蔗糖、葡萄糖負(fù)荷后的血糖水平的血糖值變化,觀察其對血糖的影響,結(jié)果見圖2。

    YG-18在7.23 mg·kg-1的劑量下單次給藥能降低正常小鼠蔗糖負(fù)荷后血糖的峰值(P<0.05),且YG-18組的血糖濃度-時間曲線下面積顯著降低(P<0.001)(見圖2A)。而在圖2B中,YG-18在7.23 mg·kg-1劑量下單次給藥對正常小鼠葡萄糖負(fù)荷后的各時間點的血糖和血糖濃度-時間曲線下面積均無明顯影響(P>0.05)。

    圖2 YG-18(7.23 mg·kg-1)對正常ICR小鼠血糖及血糖濃度-時間曲線下面積的影響Fig 2 Effect of YG-18(7.23 mg·kg-1)on the blood glucose and the blood glucose concentration time curve in ICR rats

    由此可以證明,新型化合物YG-18的體內(nèi)降糖作用的靶點為α-葡萄糖苷酶,只能對非單糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖產(chǎn)生抑制作用,進(jìn)而發(fā)揮降糖作用,而對直接攝入葡萄糖的血糖變化無法發(fā)揮作用。

    3.2 分子對接

    本次實驗分別采用了3D與2D方式展示了藥物-酶的結(jié)合構(gòu)象,見圖3、4。圖3展示了α-葡萄糖苷酶-阿卡波糖之間的相互結(jié)合的3D與2D構(gòu)象,圖4展示了α-葡萄糖苷酶-YG-18相互結(jié)合的3D與2D構(gòu)象。結(jié)果顯示,阿卡波糖與酶結(jié)構(gòu)中GLN 279、GLU 411和ARG442等氨基酸殘基形成氫鍵,氫鍵也是其與酶結(jié)合的主要方式。YG-18可能會與酶結(jié)構(gòu)中的GLN 279、ARG 315、GLU 411、ASN 415和ARG 442氨基酸殘基形成氫鍵;除氫鍵外,其可能還與ASP 69、ASP 215、GLU 277氨基酸殘基形成范德華力。YG-18展現(xiàn)出的α-葡萄糖苷酶抑制活性可能與這樣的結(jié)合方式有關(guān),且兩種藥物共同結(jié)合的ASP 69、GLU 277、GLN 279、GLU 411、ARG 442等氨基酸殘基可能為抑制活性的關(guān)鍵氨基酸。

    圖3 阿卡波糖-α-葡萄糖苷酶結(jié)合體的3D(A)和2D(B)結(jié)構(gòu)Fig 3 3D(A)and 2D(B)structure of acarbose-α-glucosidase

    圖4 YG-18-α-葡萄糖苷酶結(jié)合體的3D(A)和2D(B)結(jié)構(gòu)Fig 4 3D(A)and 2D(B)structure of YG-18-α-glucosidase

    3.3 急性經(jīng)口毒性實驗

    OECD指導(dǎo)原則下YG-18單次給藥的序列劑量中,未能得出該藥物的LD50。各給藥組給藥后4 h內(nèi),小鼠開始出現(xiàn)不良反應(yīng),主要表現(xiàn)為腹瀉,而腹瀉為α-葡萄糖苷酶的主要不良反應(yīng)之一。腹瀉在給藥后12 h內(nèi)全部恢復(fù)。除腹瀉外,各劑量組均無其他不良反應(yīng),未出現(xiàn)死亡,根據(jù)全球統(tǒng)一毒性分級系統(tǒng)(Globally Harmonized Classification System)分類,YG-18可以被認(rèn)為是幾乎無毒的。

    在實驗結(jié)束后對所有小鼠進(jìn)行頸椎脫臼處死,解剖后觀察,發(fā)現(xiàn)各組小鼠除有2只存在腸道梗阻外,其余小鼠器官的形態(tài)、顏色、質(zhì)地都未發(fā)現(xiàn)顯著異常。根據(jù)小鼠發(fā)生腹瀉的毒性反應(yīng)推測,該藥物的毒性反應(yīng)主要是通過α-葡萄糖苷酶導(dǎo)致碳水化合物吸收緩慢,從而導(dǎo)致腹瀉。

    4 討論

    在本次研究中,化合物YG-18降低了蔗糖負(fù)荷后正常ICR小鼠的血糖峰值,并明顯降低了負(fù)荷2 h內(nèi)的血糖濃度-時間曲線下面積。由此可見,YG-18雖然對于血糖峰值的影響不如陽性對照藥阿卡波糖,但是在1 h時的血糖可以控制在與阿卡波糖相同的水平,且2 h內(nèi)的血糖濃度-時間曲線下面積顯著下降。在葡萄糖負(fù)荷后,阿卡波糖和YG-18組的血糖均未下降。根據(jù)α-葡萄糖苷酶抑制劑的作用特點,這證明YG-18是通過抑制小腸刷狀緣上的α-葡萄糖苷酶起到降血糖作用的。

    本研究利用α-葡萄糖苷酶共結(jié)晶蛋白模型分析了YG-18與α-葡萄糖苷酶相互作用的潛在機(jī)制,發(fā)現(xiàn)YG-18主要通過氫鍵、范德華力、π-陰/陽離子、π-π相互作用與α-葡萄糖苷酶結(jié)合,而阿卡波糖中主要的相互作用只有氫鍵和范德華力。兩種藥物通過不同結(jié)合作用共同抑制的氨基酸殘基主要有ASP 69、GLU 277、GLN 279、GLU 411、ARG 442等,說明這些氨基酸殘基可能是藥物對α-葡萄糖苷酶產(chǎn)生抑制作用的關(guān)鍵氨基酸。

    在急性經(jīng)口毒實驗中,雖然本次實驗未能得出該YG-18的LD50值,但是在2000 mg·kg-1,小鼠在14 d內(nèi)均未出現(xiàn)死亡及其他毒性反應(yīng),各臟器也未出現(xiàn)器質(zhì)性改變,說明YG-18在2000 mg·kg-1劑量內(nèi)具有很好的安全性,LD50>2000 mg·kg-1。

    在合成工藝方面看來,目前,已上市的α-葡萄糖苷酶抑制劑阿卡波糖的工業(yè)合成途徑主要為游動放線菌(Actinoplanes spp.)發(fā)酵生產(chǎn)[15],由于是微生物途徑合成生產(chǎn),在合成過程中需對菌株選育、發(fā)酵條件等條件嚴(yán)格控制,合成工藝非常復(fù)雜。與生物合成工藝相比,通過有機(jī)化學(xué)合成的新型α-葡萄糖苷酶抑制劑YG-18的工藝則較為簡單,且后續(xù)路線優(yōu)化過程簡便快捷,可以大規(guī)模合成,合成純度也可以保證。所以就合成工藝而言,通過有機(jī)化學(xué)合成的新型α-葡萄糖苷酶抑制劑具有很大的優(yōu)勢。

    有研究表明,α-葡萄糖苷酶抑制劑不僅有降糖作用,還可以通過抑制腫瘤細(xì)胞表面N-糖基化蛋白的表達(dá)抗癌細(xì)胞遷移作用[16];此外,α-葡萄糖苷酶抑制劑還可以通過抑制宿主細(xì)胞中參與順序修建病毒包膜糖蛋白N-連接寡糖的α-葡萄糖苷酶從而抑制病毒的復(fù)制,達(dá)到抗病毒作用,現(xiàn)在已被證明可以被其抑制的病毒有登革病毒(DENV),黃熱病病毒(YFV)和寨卡病毒(ZIKV)等[17-19]?,F(xiàn)有已上市的α-葡萄糖苷酶抑制劑吸收均較差,只在腸道內(nèi)產(chǎn)生局部作用。然而無論是抗腫瘤還是抗病毒作用,僅依靠腸道內(nèi)的局部作用顯然是無法實現(xiàn)的,如新型α-葡萄糖苷酶抑制劑具有較高的生物利用度,可為后續(xù)開發(fā)研究其體內(nèi)抗腫瘤、抗病毒作用提供支持。

    綜上所述,本研究為YG-18的降糖作用、潛在抑制機(jī)制和安全性提供了一定的參考和依據(jù),同時也為后續(xù)對于3-[4-(苯基磺酰胺)苯甲酰]-2H-1-苯并吡喃-2-酮母核結(jié)構(gòu)的化合物開發(fā)更加強(qiáng)效的α-葡萄糖苷酶抑制劑提供了依據(jù)。

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