心臟成纖維細(xì)胞釋放的IL-6在阿霉素致SD乳鼠心肌細(xì)胞損傷中的作用研究*

滕嘉碩，李夢(mèng)思，羅遠(yuǎn)良，廖 嘉，吳森泉，王一陽(yáng)，王華東，呂秀秀

（暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與公共衛(wèi)生學(xué)院病理生理學(xué)系，國(guó)家中醫(yī)藥管理局病理生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510632）

阿霉素/多柔比星（doxorubicin，DOX）是一種蒽環(huán)類(lèi)抗腫瘤藥物，被廣泛應(yīng)用于白血病、淋巴瘤及實(shí)體瘤的治療［1］。隨著腫瘤幸存者人數(shù)的增加，長(zhǎng)期使用DOX導(dǎo)致的不良影響，嚴(yán)重影響腫瘤愈后患者的生存質(zhì)量，尤其對(duì)兒童腫瘤幸存者影響更為突出［2］。DOX可導(dǎo)致急性和慢性心臟毒性，DOX急性心臟毒性現(xiàn)在已經(jīng)較為罕見(jiàn)，而DOX慢性心臟毒性，主要表現(xiàn)為劑量累積效應(yīng)。研究顯示，當(dāng)DOX累計(jì)劑量達(dá)到700 mg/m2時(shí)，充血性心力衰竭發(fā)生率高達(dá)48%。雖然發(fā)生心肌病在很大程度上是劑量依賴(lài)性的，但由于個(gè)體易感性的不同，低劑量使用DOX依然可以引起心肌病［3］。越來(lái)越多的研究顯示，在進(jìn)行化療治療過(guò)程中或化療結(jié)束時(shí)，有些患者雖沒(méi)有明確的心功能障礙癥狀，但此時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)舒張功能障礙。因此，有研究者提出傳統(tǒng)觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為DOX慢性心臟毒性是晚發(fā)事件，可能僅代表實(shí)施檢測(cè)的時(shí)間，而不能真正反映其心臟毒性發(fā)生的時(shí)間［4］。目前，DOX引起舒張功能障礙的機(jī)制尚不完全清楚，心肌炎癥、心肌肥大、心肌表型的改變、纖維化以及間質(zhì)增生、能量生成障礙等改變，均可導(dǎo)致心臟舒張功能障礙。

近年來(lái)，白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）在心力衰竭發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用日益受到關(guān)注。有研究指出，炎癥生物標(biāo)志物對(duì)左室舒張功能有很好的預(yù)測(cè)潛力，特別是IL-6的水平和左室舒張功能之間具有很強(qiáng)的相關(guān)性［5］。相關(guān)研究顯示，輸注IL-6可通過(guò)非依賴(lài)血壓升高途徑，導(dǎo)致大鼠左心室肥厚；IL-6缺失會(huì)減弱血管緊張素Ⅱ和去甲腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚［6］。以上結(jié)果從不同層面肯定了IL-6在心肌肥厚發(fā)生發(fā)展中的作用。

有研究證實(shí)，在DOX慢性心臟損傷動(dòng)物模型中，血清以及心臟組織中IL-6水平均顯著升高［7］。然而，IL-6在DOX慢性心臟毒性中發(fā)揮何種作用尚不確定。此外，IL-6來(lái)源十分廣泛，心血管系統(tǒng)中的內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞以及心肌細(xì)胞都能產(chǎn)生IL-6［8］。不同刺激作用于心臟，誘導(dǎo)生成IL-6的效應(yīng)細(xì)胞可能不盡相同，如在LPS刺激下，H9C2細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量IL-6［9］；另有研究報(bào)道，β腎上腺受體激動(dòng)后小鼠心肌組織中產(chǎn)生的IL-6則主要來(lái)源于心臟成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblats，CF）而非心肌細(xì)胞（cardiomyocytes，CM）［10］。

因此，本研究旨在通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，觀(guān)察DOX分別刺激SD乳鼠心臟成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞后，IL-6釋放的情況，并進(jìn)一步探討IL-6在DOX引起心肌細(xì)胞損傷中發(fā)揮的作用及機(jī)制，為臨床早期防治DOX慢性心肌病提供參考資料。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

出生1～3 d的SPF級(jí)SD大鼠乳鼠，雌雄不限，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK（粵）2018-0002。

2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)液（Gibco）；PBS、HBSS和2.5%的不含EDTA不含酚紅的胰酶（HyClone）；胎牛血清（Gibco）；青霉素、鏈霉素（Thermo Fisher）；10 mg DOX粉劑（瀚輝制藥有限公司）；TraKine?F-actin Staining Kit（Abbkine）；RIPA液、BCA試劑定量試劑和配膠試劑盒（碧云天公司）；共聚焦皿（Abcam）；Transwell 6孔板小室（Corning）和CCK-8工作液（Sigma）；IL-6的ELISA試劑盒及IL-6抗體（R&D）；GAPDH抗體（Ab‐cam）；心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）抗體（武漢三鷹公司）；腦鈉尿肽（brain natriuretic pep‐tide，BNP）抗體（萬(wàn)類(lèi)生物公司）；肌球蛋白重鏈7（myosin heavy chain 7，MYH7）抗體（Santa Cruz）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔和羊抗小鼠Ⅱ抗（鼎國(guó)生物科技公司）。

3 主要方法

3.1 心臟成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞的培養(yǎng) 取SD乳鼠，放入75%乙醇中消毒10 s，經(jīng)異氟烷吸入麻醉后，將其四肢固定于泡沫板上，移入超凈臺(tái)內(nèi)。用眼科剪打開(kāi)胸腔，用眼科鑷夾取心臟，置于預(yù)冷的PBS中，使用眼科直鑷擠壓心臟兩側(cè)，洗去心臟內(nèi)的殘血。剪取心臟組織，保留心臟的心室肌部分，將其剪碎至糜狀，加入5～10倍體積的0.125%的胰酶消化心臟組織，第1次消化7 min后，棄上清，再加入5～10倍體積的0.125%的胰酶消化5～7次。加入等體積的完全培養(yǎng)液于收集到的細(xì)胞上清液中，置于離心機(jī)中800×g，離心7 min。用完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，接種于培養(yǎng)瓶中。放置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，通過(guò)差速貼壁分離心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞，使用超順磁氧化鐵微球（SIOP）法提純心肌細(xì)胞。

3.2 CCK-8檢測(cè)心臟成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞的活力 心臟成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，分為對(duì)照組，1、2和4μmol/L DOX處理組。37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入10μL的CCK-8工作液混勻，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 min。使用酶標(biāo)儀在450 nm、570 nm雙波長(zhǎng)處讀取每孔的吸光度（A）值，計(jì)算出各組成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞的活力，從而確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)中DOX的使用劑量。

3.3 ELISA法檢測(cè)心臟成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞上清中IL-6的含量 將心臟成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞分別接種于96孔板中，48 h后給予1μmol/L DOX處理48 h后，收集細(xì)胞上清液，根據(jù)ELISA試劑盒的步驟依次進(jìn)行操作，最后使用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的A值，將540 nm或590 nm設(shè)置為校正波長(zhǎng)。繪制線(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞上清中IL-6的含量。

3.4 免疫熒光染色觀(guān)察細(xì)胞骨架F-肌動(dòng)蛋白（F-ac‐tin）的形態(tài) 鬼筆環(huán)肽（phalloidin）是一種從毒性菇類(lèi)分離的多肽物質(zhì)，通過(guò)其與細(xì)胞中F-actin的特異性結(jié)合而觀(guān)察細(xì)胞骨架蛋白中絲狀肌動(dòng)蛋白的變化。心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，首先用1μmol/L DOX刺激心臟成纖維細(xì)胞24 h，形成條件培養(yǎng)液。然后將心肌細(xì)胞分成心肌細(xì)胞對(duì)照組、1μmol/L DOX處理心肌細(xì)胞組、成纖維細(xì)胞上清培養(yǎng)液處理心肌細(xì)胞組和條件培養(yǎng)液處理心肌細(xì)胞組。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸去共聚焦皿中的培養(yǎng)液，加入PBS洗皿3次，每次5 min。加入1 mL提前預(yù)冷的4%多聚甲醛，室溫固定30 min后，加入PBS洗3次，每次5 min。加入0.1%的Tri‐ton X-100 1 mL，室溫打孔5 min。PBS洗皿3次，每次5 min。加入200μL staining solution，室溫下染色30 min。PBS洗2次后，每孔加入300μL的DAPI染液，室溫下避光孵育15 min。接著用PBS洗3次，每次5 min。然后放置于共聚焦顯微鏡下觀(guān)察。

3.5 Western blot檢測(cè)心肌細(xì)胞ANP、BNP和MYH7的蛋白水平 原代心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，運(yùn)用Transwell小室共培養(yǎng)心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，上室接種成纖維細(xì)胞，下室接種心肌細(xì)胞，分為心肌細(xì)胞對(duì)照組、1μmol/L DOX處理心肌細(xì)胞組、共培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)照組和1μmol/L DOX處理共培養(yǎng)細(xì)胞組。處理24 h后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗3次，加入適量的RIPA裂解液，冰上裂解5 min，用刮刀刮取下室心肌細(xì)胞，收集細(xì)胞混合物于EP管中。4℃、6 000×g離心15 min，BCA法測(cè)定蛋白濃度，然后用5×loading buffer和RIPA裂解液調(diào)整待測(cè)樣本的濃度。取10μL的樣品進(jìn)行SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)100 V，1 h轉(zhuǎn)至PVDF膜，TBST漂洗3次，每次5 min，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，用抗ANP（1∶1 000）、抗BNP（1∶1 000）、抗MYH7（1∶1 000）和抗GAPDH（1∶1 000）的Ⅰ抗4℃孵育過(guò)夜。TBST漂洗3次，用山羊抗兔（1∶10 000）和山羊抗鼠（1∶10 000）的Ⅱ抗室溫孵育1 h后，TBST漂洗10 min，洗3次。超敏ECL化學(xué)發(fā)光法顯色后，使用Image J圖像分析軟件測(cè)量灰度值。

3.6 Western blot進(jìn)一步檢測(cè)使用IL-6抗體拮抗實(shí)驗(yàn)中心肌細(xì)胞ANP和MYH7的蛋白水平 細(xì)胞共培養(yǎng)方法同上，將實(shí)驗(yàn)分為4組：共培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)照組、1μmol/L DOX處理共培養(yǎng)細(xì)胞組、10 mg/L IL-6抗體處理共培養(yǎng)細(xì)胞組和1μmol/L DOX+10 mg/L IL-6抗體處理共培養(yǎng)細(xì)胞組。處理24 h后，提取細(xì)胞。取10μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，TBST漂洗5 min，洗3次后，將條帶置于5%脫脂牛奶中封閉1 h，用抗ANP（1∶1 000）、抗MYH7（1∶1 000）和抗GAPDH（1∶1 000）的Ⅰ抗4℃孵育過(guò)夜。TBST漂洗3次，用山羊抗兔（1∶10 000）和山羊抗鼠（1∶10 000）的Ⅱ抗室溫孵育1 h后，TBST漂洗3次，每次10 min。超敏ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，ImageJ圖像分析軟件測(cè)量灰度值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。統(tǒng)計(jì)資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組數(shù)據(jù)之間使用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行檢驗(yàn)，組間比較采用t檢驗(yàn)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 DOX刺激24 h后心臟成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞活力的變化

用1μmol/L、2μmol/L和4μmol/L的DOX處理心臟成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞，加藥24 h后，檢測(cè)DOX對(duì)心臟成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞的損傷情況。如圖1所示，DOX處理心臟成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞24 h后，心臟成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞的活力均顯著下降，與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。其中2μmol/L和4μmol/L DOX處理后，細(xì)胞存活率均低于50%，因此，我們選用1μmol/L的DOX來(lái)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Figure1.Effects of DOX on the viability of cardiac fibroblasts（CF）and cardiomyocytes（CM）.DOX significantly decreased the viability of CF and caused CM damage.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control group.圖1 DOX對(duì)心臟成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞活力的影響

2 DOX刺激48 h后心臟成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞上清中IL-6的水平

1μmol/L DOX處理心臟成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞48 h后，ELISA檢測(cè)上清中IL-6的水平。如圖2所示，DOX處理48 h后，成纖維細(xì)胞上清中IL-6的含量顯著增加，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；但DOX處理心肌細(xì)胞48 h后，其上清中IL-6水平與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P>0.05）。

3 DOX刺激成纖維細(xì)胞后的條件培養(yǎng)液對(duì)心肌細(xì)胞骨架F-actin的影響

如圖3所示，對(duì)照組心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞上清培養(yǎng)液處理的心肌細(xì)胞中有完整的F-actin，肌絲排列整齊且清晰。而1μmol/L DOX處理的心肌細(xì)胞的F-actin排列紊亂、斷裂。條件培養(yǎng)液處理的心肌中F-actin不僅出現(xiàn)斷裂，而且還出現(xiàn)肌絲變成圓形或聚集在細(xì)胞邊緣、長(zhǎng)肌絲斷裂消失等現(xiàn)象。

4 DOX處理可促進(jìn)共培養(yǎng)的心肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞體系中心肌細(xì)胞肥大相關(guān)蛋白的表達(dá)

Figure 2.The release of IL-6 from cardiac fibroblasts（CF）and cardiomyocytes（CM）after DOX treatment was detect‐ed by ELISA.DOX promotes the release of IL-6 from CF，but the release of IL-6 from CM did not increase significantly.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control group.圖2 DOX處理心臟成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞48 h后細(xì)胞上清中IL-6的含量

如圖4所示，1μmol/L DOX處理心肌細(xì)胞24 h后，ANP、BNP及MYH7的蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組心肌細(xì)胞（P<0.01），1μmol/L DOX處理的共培養(yǎng)組中，心肌細(xì)胞ANP、BNP及MYH7的蛋白表達(dá)顯著高于1μmol/L DOX處理的心肌細(xì)胞（P<0.01）。

5 IL-6抗體可抑制DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)體系中心肌細(xì)胞ANP和MYH7的蛋白表達(dá)

10 mg/L IL-6抗體處理DOX刺激的共培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，共培養(yǎng)體系中心肌細(xì)胞ANP及MYH7的蛋白表達(dá)顯著低于1μmol/L DOX處理的共培養(yǎng)細(xì)胞組（P<0.05）。10 mg/L IL-6抗體處理的共培養(yǎng)細(xì)胞組組心肌細(xì)胞中ANP及MYH7的蛋白表達(dá)和對(duì)照組比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P>0.05），見(jiàn)圖5。

討 論

Figure 3.Phalloidin staining to observe the morphological changes of cytoskeletal protein F-actin.The green staining position is F-ac‐tin，while the blue staining is DAPI.The scale bar=50μm.圖3 鬼筆環(huán)肽染色后熒光顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞骨架蛋白F-actin形態(tài)

Figure 4.Effects of DOX on the protein levels of ANP,BNPand MYH7 in cardiomyocytes were determined by Western blot.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs CM group；##P<0.01 vs CM+DOX group.圖4 Western blot檢測(cè)DOX處理對(duì)心肌細(xì)胞中ANP、BNP和MYH7蛋白表達(dá)水平的影響

自上世紀(jì)以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)DOX心臟毒性的機(jī)制進(jìn)行了大量研究，并相繼提出了多種假說(shuō)，包括氧化應(yīng)激損傷、線(xiàn)粒體功能異常和心肌細(xì)胞凋亡等［11］。然而，到目前為止，DOX慢性心臟毒性的機(jī)制尚不清楚。隨著臨床檢測(cè)心功能手段不斷完善，DOX慢性心臟毒性早期就會(huì)出現(xiàn)舒張功能障礙。如果將心肌細(xì)胞作為唯一細(xì)胞靶點(diǎn)，很難對(duì)上述現(xiàn)象進(jìn)行闡述。心臟中其它類(lèi)型細(xì)胞陸續(xù)被提出作為DOX心臟毒性的細(xì)胞靶點(diǎn)［12］。心臟中非心肌細(xì)胞的數(shù)量遠(yuǎn)多于心肌細(xì)胞，包括心臟成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞等。其中，心臟成纖維細(xì)胞在促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)形成，以及維持心功能方面的意義已被認(rèn)可［13］。我們的前期研究證實(shí)：DOX能刺激原代培養(yǎng)的SD乳鼠心臟成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，同時(shí)釋放大量的炎癥因子，其中就包括IL-6［14］。此外，有研究顯示，DOX心臟損傷動(dòng)物模型中，血清以及心臟組織中IL-6水平均顯著升高。鑒于IL-6的水平和左室舒張功能之間具有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。因此，我們推測(cè)IL-6在DOX慢性心臟毒性中發(fā)揮著一定作用。鑒于不同刺激作用于心臟，誘導(dǎo)生成IL-6的效應(yīng)細(xì)胞可能不盡相同，心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞均可產(chǎn)生IL-6，在不同的刺激條件下，產(chǎn)生IL-6的細(xì)胞種類(lèi)也不近相似。DOX刺激后，心臟組織中升高的IL-6到底來(lái)源于何種細(xì)胞，尚未見(jiàn)報(bào)道。

Figure 5.Effects of DOX and IL-6 antibody on the protein levels of ANP（A）and MYH7（B）in cardiomyocytes were determined by Western blot.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs CM+CFgroup；#P<0.05 vs CM+CF+DOX group.圖5 Western blot檢測(cè)DOX和IL-6抗體對(duì)心肌細(xì)胞中ANP和MYH7蛋白表達(dá)水平的影響

因此，本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)CCK-8法檢測(cè)DOX對(duì)原代培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞活力的影響，確定DOX的使用劑量和作用時(shí)間。選取1μmol/L DOX分別處理SD乳鼠的心臟成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞48 h后，ELISA法測(cè)定成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞上清中IL-6的含量，結(jié)果表明：1μmol/L DOX能促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞釋放大量的IL-6，但是心肌細(xì)胞釋放IL-6并沒(méi)有顯著增加。這表明DOX刺激后，心臟組織中的IL-6主要來(lái)源于成纖維細(xì)胞。

IL-6具有多種生物學(xué)活性，除了具有促炎、抗炎特性，它還具有類(lèi)似激素的行為特征。IL-6主要可通過(guò)經(jīng)典的IL-6受體信號(hào)通路和反式激活I(lǐng)L-6受體信號(hào)，參與調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的心臟細(xì)胞存活、凋亡、肥大和膠原合成等多個(gè)過(guò)程［15］。DOX刺激成纖維細(xì)胞釋放的IL-6，在DOX心臟毒性中發(fā)揮何種作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需求，我們分別采用條件培養(yǎng)液和Transwell小室共培養(yǎng)模擬體內(nèi)心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞共存的微環(huán)境，觀(guān)察了1μmol/L DOX刺激24 h后，心肌細(xì)胞骨架蛋白形態(tài)的改變，結(jié)果表明條件培養(yǎng)液可導(dǎo)致心肌細(xì)胞肌絲排列紊亂、斷裂。

當(dāng)各種刺激導(dǎo)致心臟代償或者失代償肥大時(shí)，ANP的表達(dá)增加。BNP是由心肌細(xì)胞合成的具有生物學(xué)活性的天然激素，主要在心室中表達(dá)，常被作為心衰定量標(biāo)志物，當(dāng)心臟出現(xiàn)損傷時(shí)，BNP的表達(dá)顯著增加。MYH7是心肌的重要組成部分，當(dāng)心肌出現(xiàn)肥厚損傷時(shí)，MYH7的表達(dá)顯著增加。因此我們應(yīng)用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)心肌細(xì)胞ANP、BNP和MYH7的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，DOX刺激24 h后，成纖維細(xì)胞及心肌細(xì)胞共培養(yǎng)組中心肌細(xì)胞ANP、BNP和MYH7的蛋白表達(dá)水平高于心肌細(xì)胞組。以上結(jié)果提示，原代細(xì)胞培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞在DOX誘導(dǎo)心肌損傷和肥大中發(fā)揮著作用。但尚不確定這種作用是否與心臟成纖維細(xì)胞釋放的IL-6相關(guān)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證IL-6在DOX誘導(dǎo)心肌損傷和肥大中的作用，我們通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)使用IL-6抗體，目的在于拮抗/中和DOX刺激成纖維細(xì)胞釋放的IL-6后，觀(guān)察心肌細(xì)胞ANP、MYH7的蛋白水平是否發(fā)生變化。結(jié)果顯示加入了IL-6抗體后，共培養(yǎng)組中反應(yīng)心肌損傷和肥大的蛋白表達(dá)顯著下降。

綜上所述，雖然前期已有研究顯示DOX刺激后，心臟組織和血清中會(huì)產(chǎn)生大量的IL-6，但并未闡述DOX誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-6的細(xì)胞來(lái)源，更沒(méi)有提及IL-6在DOX誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷中的作用。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，初步觀(guān)察到DOX刺激作用下，原代培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞會(huì)分泌大量IL-6，而并不會(huì)刺激原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞釋放大量的IL-6。同時(shí)，利用條件培養(yǎng)液和Transwell小室共培養(yǎng)方式，模擬體內(nèi)心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞共存的微環(huán)境，觀(guān)察DOX刺激作用下，原代培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞分泌的IL-6對(duì)心肌細(xì)胞肥大、損傷的作用。但DOX引起心臟成纖維細(xì)胞產(chǎn)生釋放大量IL-6的機(jī)制，以及IL-6通過(guò)何種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，實(shí)現(xiàn)促心肌肥大損傷的？本課題尚未闡述。此外，還需進(jìn)一步確定心臟中的其它細(xì)胞類(lèi)型如內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞在DOX刺激下產(chǎn)生IL-6的情況及IL-6在DOX慢性心臟毒性中的作用，這也將是今后課題需要開(kāi)展的重要內(nèi)容。