腎?、蛱柗綄gA腎病大鼠腸道菌群的調節(jié)作用研究＊

歐陽文坤，田春陽，劉華熙，鄧伊健，趙曉山，孫曉敏

(南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院 廣州 510515)

IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)是一組以IgA或IgA為主的免疫復合物在腎小球系膜區(qū)呈顆粒樣或團塊樣彌漫性沉積為特征的原發(fā)性腎小球疾病，是導致終末期腎病的主要原因之一。IgAN臨床表現多種多樣，且發(fā)病機制尚未明確，現代醫(yī)學在臨床上至今仍無對IgAN有效的特異性治療藥物，但中醫(yī)學對IgAN的防治積累了豐富經驗并且取得顯著療效。在中醫(yī)學中未找到能直接與IgAN對應的病名，根據其主要臨床表現和證候，可將其歸于“尿血”“尿濁”“水腫”“腎風”等疾病的范疇[1]。

人體腸道菌群參與體內代謝過程，其與機體形成了能相互調節(jié)的一種動態(tài)平衡的共生狀態(tài)[2]。正常情況下，腸黏膜免疫系統對腸道菌群呈免疫耐受表現[3]，一旦腸道內環(huán)境某些因素異常變化，就會打破這種共生狀態(tài)，導致疾病發(fā)生。De Angelis等[4]發(fā)現IgAN患者的腸道菌群存在生態(tài)失調，與健康人相比，IgAN患者糞便中的有益菌數量明顯減少，而有害菌數量增多。近年來Coppo R[5]提出的與IgAN發(fā)病機制相關的“腸腎關聯”學說得到廣泛認可，其認為當各種原因導致腸道黏膜免疫功能異常時，機體對食物抗原、腸道菌群等會出現免疫耐受缺陷，腸道屏障功能下降，腸道中內毒素吸收入體增加，激活黏膜相關淋巴組織，使機體處于亞臨床炎癥狀態(tài)，從而使異常糖基化IgA1大量產生，形成循環(huán)免疫復合物增多，最后沉積于腎小球系膜區(qū)，導致IgAN發(fā)生。單純性血尿是IgAN最常見的臨床表現，屬于中醫(yī)“尿血”范疇，近代醫(yī)家多認為脾腎兩虛為其基本病機，脾虛不能統血，腎虛不能固攝，精血不循常道而外泄，發(fā)為血尿[6]。因此血尿病程日久，多責之于脾，脾胃學說是與腸道菌群關系最為直接的理論之一[7]。中醫(yī)理論“脾為后天之本”，認為脾主運化水谷精微、化生氣血，中醫(yī)的“脾”在現代醫(yī)學中是涉及到消化吸收、水鹽代謝、能量轉化以及免疫內分泌等多系統、多器官的綜合功能單位[8]；這與腸道菌群在后天定植成長走向成熟的穩(wěn)態(tài)過程及在維持機體生長發(fā)育的重要作用相一致。同時，中醫(yī)理論“腎為先天之本，脾為后天之本”認為腎中精氣的盛衰影響著子代的先天稟賦與生長發(fā)育，與遺傳物質關系密切；而脾之精氣來源于水谷精微，其功能易受環(huán)境、飲食影響，脾腎二者先后天相互滋養(yǎng)，功能相互協同[9]。因此，“腸腎關聯”學說與中醫(yī)證候“脾腎兩虛”的理論實質有密切關聯。

本課題組通過多年治療IgAN所創(chuàng)立的健脾益腎經驗方“腎?、蛱柗健币淹ㄟ^臨床及實驗證明，其對IgAN有明顯療效[10-13]，其具體機制尚未明確，因此本研究使用宏基因組學研究方法，探討腎病Ⅱ號方治療IgAN大鼠的腸道微生物調節(jié)機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

本次實驗采用40只4周齡的SPF級健康雄性SD大鼠，體質量在180-220 g之間，均采購自廣東省實驗動物中心，在南方醫(yī)科大學實驗動物中心SPF級動物實驗室進行飼養(yǎng)和實驗操作。飼養(yǎng)時保持室內安靜，空氣相對濕度控制為40%-60%，溫度控制在22℃-26℃，自由進食、水，4只大鼠/籠。

1.2 實驗藥物及材料

“腎病Ⅱ號方”藥物組成為：熟地20 g、山藥30 g、山萸肉20 g、白茅根30 g、大小薊20 g、煅牡蠣30 g、炙甘草5 g。所用中藥飲片購自南方醫(yī)院中藥房，按照(熟地：山藥：山萸肉：白茅根：大小薊：煅牡蠣：炙甘草=4∶6∶4∶6∶4∶6∶1)的藥物比例制作復方濃縮液。本實驗中“腎?、蛱柗健惫辔笣舛确譃榈汀⒅?、高劑量3種，將臨床單日的用藥量(熟地20 g、山藥30 g、山萸肉20 g、白茅根30 g、大小薊20 g、煅牡蠣30 g、炙甘草5 g)作為中劑量，低劑量濃度為中劑量二分之一，高劑量濃度為中劑量兩倍，然后按照藥理學體表面積來換算，得出腎病Ⅱ號方的低、中、高劑量的灌藥濃度分別為：1 g·kg-1、2 g·kg-1、4 g·kg-1(此處為熟地劑量)。

牛血清白蛋白(美國Sigma-Aldrich公司)；脂多糖(美國Sigma-Aldrich公司)；四氯化碳(上海阿拉丁生化科技股份供銷公司)；肌酐檢測試劑盒、尿素氮檢測試劑盒、尿蛋白檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；E.Z.N.A.?soil試劑盒(Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.)；TransGen AP221-02(TransStart Fastpfu DNA Polymerase)；PCR儀(ABIGeneAmp?9700型)；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)；QuantiFluor?-ST藍色熒光定量系統(Promega公司)。

1.3 分組及造模

本實驗分組共分為5組。將40只SD大鼠按8只/組來隨機分為以下5組：正常組，模型組，腎病Ⅱ號方低、中、高劑量組。本次實驗的造模方法[14]采用異種蛋白免疫誘導模型，本課題組對其調整了一些劑量，并進行整合、優(yōu)化，具體造模操作如下：①使用牛血清白蛋白(BSA)對SD大鼠以600 mg·kg-1進行隔天灌胃；②同時，每周一次在皮下分別注射四氯化碳(CCl4)0.1 mL和蓖麻油(0.5 mL)；③分別在第7、10、13周這3個時間點在SD大鼠的尾靜脈以0.25 mg·kg-1的劑量每周一次來注射脂多糖(LPS)。整個造模過程一共持續(xù)15周。對于模型組，腎?、蛱柗降?、中、高劑量，這4組采用上述方法造模，而正常組組則灌胃等量的純凈水并且腹腔注射等量的生理鹽水。從第15周開始，腎病Ⅱ號方低、中、高劑量組按不同藥物濃度每日灌胃腎?、蛱柗綕饪s液，持續(xù)6周，正常組、模型組每日灌胃等量純凈水，持續(xù)6周。

1.4 樣本收集

從使用異種蛋白免疫誘導模型到第15周造模完成后，用代謝籠開始采集大鼠的24 h尿液，每周1次，用試劑盒檢測尿蛋白肌酐比(PCR)、24 h尿蛋白濃度。

在用腎病Ⅱ號方中藥濃縮液灌胃6周后，即在第21周實驗結束之后，用水合氯醛來麻醉。使用促凝管在大鼠用腹主動脈采集得到的血液樣本收集起來，使用試劑盒檢測血肌酐、血尿素氮。

采血后取左腎置4%多聚甲醛固定液處理后，石蠟包埋進行常規(guī)病理切片，制作4μm厚連續(xù)切片，蘇木精-伊紅染色，于光學顯微鏡下觀察病理組織學改變。

取盲腸中的糞便按照E.Z.N.A.?soil試劑盒說明書對大鼠糞便樣本進行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質量。用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)引物對V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增。擴增程序為：95℃預變性3 min，27個循環(huán)(95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s)，最后72℃延伸10 min。擴增體系為20 uL，包括4ul 5*FastPfu緩沖液、2 uL 2.5 mM dNTPs、0.8 uL引物(5 uM)、0.4 uL FastPfu聚合酶、10 ng DNA模。使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit說明書進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluor?-ST進行檢測定量。根據Illumina MiSeq平臺標準操作規(guī)程將純化后的擴增片段構建PE 2*300的文庫。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序(安諾優(yōu)達基因科技(北京)有限公司)。原始數據上傳至NCBI數據庫中。原始測序序列使用Trimmomatic軟件質控，使用FLASH軟件進行拼接，去除無法拼接的序列。使用UPARSE軟件，根據97%的相似度對序列進行OTU聚類；使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDPclassifier對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva數據庫(SSU123)，設置比對閾值為70%[15]。

1.5 統計分析

各組實驗數據用xˉ±s表示，采用SPSS24.0軟件進行統計學處理，數據符合正態(tài)分布且方差齊時采用單因素方差分析，方差不齊時采用Kruskal-Wallis檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 一般情況檢測

正常組精神狀態(tài)較好，活動較多，動作靈活，其毛發(fā)色澤整齊光亮，大小便均正常，在實驗過程中對其進行操作時其應激反應較小。

模型組整體出現倦怠、嗜睡、精神萎靡狀態(tài)，活動較少，毛發(fā)色澤疏松黯淡，小便顏色偏黃，大便正常，在實驗過程中對其進行操作時其應激反應大。

腎病Ⅱ號方低中高劑量3組在給藥干預之后，精神狀態(tài)在整體上有所恢復，活動較造模過程中變多，動作靈活，毛發(fā)較整齊，小便色偏清，大便正常，在實驗過程中對其進行操作時其應激反應仍然較大。

2.2 血液檢測

2.2.1 腎功能

如表1、圖1所示，與正常組相比，模型組的尿素氮(BUN)與血肌酐(Cr)均升高，差異具有統計學意義(P＜0.05)；與模型組相比，腎病Ⅱ號方高劑量組的尿素氮與血肌酐有所下降，差異具有統計學意義(P＜0.05)；而腎病Ⅱ號方低、中劑量組這兩組與模型組相比無統計學差異(P＞0.05)。

表1 各組大鼠腎功能比較

2.3 尿液檢測

2.3.1 尿蛋白肌酐比(PCR)

如表2、圖2所示，與正常組相比，模型組PCR升高，差異具有統計學意義(P＜0.05)。與模型組相比，腎?、蛱柗礁邉┝拷MPCR顯著降低(P＜0.05)。而腎?、蛱柗降?、中劑量組這兩組的PCR與模型組相比無統計學差異(P＞0.05)。

表2 各組大鼠PCR比較

2.3.2 24 h尿蛋白定量

如表3、圖3所示，在第15周使用腎?、蛱柗礁深A前，模型組及腎?、蛱柗浇M低、中、高劑量組的24h尿蛋白定量均顯著高于正常組(P＜0.05)。而給藥干預后，在第19-21周，腎?、蛱柗礁邉┝拷M的24 h尿蛋白定量顯著低于模型組(P＜0.05)，呈明顯恢復趨勢。而腎?、蛱柗降?、中劑量組這兩組的24 h尿蛋白定量與模型組相比無顯著性差異，下降趨勢不夠明顯。

圖1各組大鼠尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)水平比較

圖2各組大鼠尿蛋白肌酐比(PCR)水平比較

表3 各組大鼠24小時尿蛋白定量比較

圖3 各組大鼠24小時尿蛋白定量比較

2.4 腎臟組織病理學

由圖4可見，在光鏡下，正常組大鼠的腎組織結構清晰，腎小管結構規(guī)則，未見明顯病理改變。模型組可見腎小球基底膜增厚，系膜細胞輕度增生，系膜基質增多，部分腎小管上皮細胞腫脹。與模型組相比，腎病Ⅱ號方低、中劑量組呈現相似病理改變；腎?、蛱柗礁邉┝拷M的系膜細胞增生有所減輕，系膜基質較模型組有所減輕，腎小管結構基本正常。

圖4 各組大鼠腎組織HE染色病理學觀察

Amplified region 338F_806R Samples 22 Sequences 1232698 Bases/bp 537126141 Averagelength/bp 435.73

2.5 測序結果和OTU分布

根據上述血液檢測、尿液檢測和病理改變的結果來看，腎?、蛱柗礁邉┝拷M大鼠的尿蛋白、腎功能及組織病理變化較模型組有統計學差異，而中劑量及低劑量大鼠與模型組未出現統計學差異，故腸道菌群檢測實驗部分僅對空白組、模型組、腎病Ⅱ號方高劑量組這3組大鼠的糞便樣本進行菌群分析。

如表4所示，本次實驗共22個樣本，得到1232698條序列，537126141個堿基，經比對后的平均長度為435.73bp。

Venn圖[16]用于統計多個樣本中所獨有和共有的OTU數目，能比較直觀地表現樣本的OTU數目組成的相似性及重疊情況。本次實驗經OTU聚類后得到831個OTU。如圖5所示，3組共有705個OTU，正常組和模型組共有740個OTU，模型組和高劑量組共有729個OTU。

圖5 Venn圖

2.6 α多樣性分析

α多樣性用來反映微生物群落的豐度和多樣性。評價菌群豐度的指標有Ace指數、Chao指數，都用以估計群落中所含OTU數目。評價菌群多樣性的指標有Shannon指數、Simpson指數，都用以評估菌群的群落多樣性，值越大說明群落多樣性越高。如表5、圖6所示，3組之間的Ace指數、Chao指數、Shannon指數和Simpson指數均無統計學差異。

圖6 α多樣性指標

稀釋曲線可以用來比較測序數據量不同的樣本中物種的豐度，用來說明樣本的測序數據量是否合理，當曲線趨向平坦時，說明測序數據量合理。如圖7所示，所有樣本曲線趨于平緩，表明本實驗樣本測序數據量合理。

圖7 稀釋曲線

2.7 β多樣性分析

β多樣性指樣本間物種多樣性，能反映每個組內各個樣本的物種組成差異大小。PCoA分析，即主坐標分析(principal co-ordinates analysis)，是利用距離表征β多樣性的指標，可用來研究樣本群落組成的相似性或差異性。PCoA圖中的橫、縱坐標軸刻度是相對距離，并無實際意義，圖中的點之間的距離越大則β多樣性越大，物種組成差異也就越大。如圖8的PCoA主坐標分析結果顯示，能看到正常組、模型組和高劑量組3組的群落結構存在明顯差異。

圖8 腸道樣本PCoA分析圖

分組正常組模型組高劑量組Ace 626.25±33.32 619.67±28.47 630.38±43.22 Chao 633.50±41.87 637.00±32.47 632.25±45.07 Shannon 4.65±0.10 4.37±0.28 4.46±0.28 Simpson 0.0241±0.0041 0.0405±0.0168 0.0394±0.0189

本實驗分析3組間的群落組成差異采用PERMANOVA，并且分別基于Bray-Curtis Index、Jaccard Index和Jensen-Shannon Divergence的PCoA來分析三組的群落結構的聚集情況，如圖9所示，3組的群落結構之間有顯著差異(Bray-Curtis Index：F-value=2.3772，R-squared=0.20015，P-value＜0.002；Jaccard Index：F-value=1.937，R-squared=0.16937，pvalue＜0.002；Jensen-Shannon Divergence：F-value=3.5334，R-squared=0.2711，P-value＜0.001)。

圖9 Bray-Curtis Index(左)；Jaccard Index(中)；Jensen-Shannon Divergence(右)

由此可見，3組間的群落結構能夠顯著區(qū)分，并且腎病II號方高劑量組的群落結構介于正常組和模型組的群落結構之間，有向正常組恢復的趨勢。

2.8 群落結構組分圖

根據分類學分析結果來明確3組樣本在門、屬水平上的分類學比對情況，得知3組樣本中含有何種微生物以及各微生物的相對豐度。使用統計學的分析方法，觀測3組樣本在門、屬水平上的群落結構，對比3組樣本的群落結構，觀測其變化情況。

2.8.1 菌門水平

腸道菌群結構直方圖展示了微生物種類及其相對豐度，所有樣本可分類到個8菌門，在各組中Firmicutes(厚壁菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Proteobacteria(變形桿菌門)、Actinobacteria(放線菌門)均占據97%以上(圖10)。

圖10 門水平菌群結構組成

與正常組相比，模型組的Firmicutes(厚壁菌門)豐度顯著減少(P＜0.05)，Bacteroidetes(擬桿菌門)、Proteobacteria(變形桿菌門)豐度增多(P＞0.05)，Actinobacteria(放線菌門)和Cyanobacteria(藍藻門)豐度顯著增多(P＜0.05)(表6)。

表6 菌門結構組成

與模型組相比，腎病II號方高劑量組的Firmicutes(厚壁菌門)豐度增多(P＞0.05)，Bacteroidetes(擬桿菌門)、Proteobacteria(變形桿菌門)豐度減少(P＞0.05)，Tenericutes(柔膜菌門)豐度顯著增多(P＜0.05)，以上菌門有向正常組恢復趨勢。

2.8.2 菌屬水平

如圖11所示，在所有樣本中均檢測出Muribaculaceae_norank、 Lachnospiraceae_NK4A136_group(毛螺菌屬)、Lachnospiraceae_unclassified(毛螺菌屬)、Allobaculum(支原體科)、Desulfovibrionaceae_uncultured(脫硫弧菌科)、Romboutsia，這6種菌屬的豐度之和在每個樣品中都超過了50%。

圖11 屬水平菌群結構組成

2.9 LEfSe分析

LEfSe(LDA Effect Size)[17]是一種用于發(fā)現高維生物標識和揭示基因組特征的軟件，能夠用于發(fā)現兩組或多組樣本中最能解釋組間差異的物種特征，以及這些特征對組間差異的影響程度[18]。LEfSe能確定各組之間具有顯著差異的細菌類群。LEfSe分析主要有3大步驟：1.利用非參數Kruskal-Wallis秩和檢驗來檢測不同組之間的物種豐度差異，找到在豐度上有顯著差異的物種；2.使用Wilcoxon秩和檢驗來檢驗上一步的差異物種在不同組間子分組中的差異一致性；3.最后運用線性判別分析(LDA)估計這些差異物種豐度對組間差異效果影響的大小。LDA分值越大，代表物種豐度對差異效果影響越大。

圖12是聚類樹圖，紅色、綠色和藍色區(qū)域分別表示正常組、模型組和高劑量組。樹枝中的紅色、綠色和藍色節(jié)點分別表示在各自組別中起重要作用的微生物類群，而黃色節(jié)點則表示在三組中均沒起重要作用的微生物類群。聚類樹圖中的英文字母表示的物種名稱在圖的下方展示。從里圈往外圈看，依次是門、綱、目、科、屬水平的物種。

圖12 3組腸道樣本的聚類樹圖(LDA＞2.0，P＜0.05)

本研究采用LEfSe分析來確定各組之間具有顯著差異的細菌類群。如圖13所示，本次研究在正常組發(fā)現16個分類群，模型組發(fā)現8個分類群，腎病II號方高劑量組發(fā)現61個分類群。

圖13 3組樣本中有顯著作用的菌群LDA分值直方圖(LDA＞2.0，P＜0.05)

正常組在 Clostridiales(梭桿菌目)、Lachnospiraceae(毛螺旋菌科)、Firmicutes(厚壁菌門)等類群的豐度較高。模型組在Gammaproteobacteria(變形桿菌綱)、Coprococcus_2(糞球菌屬)、Bacteroidales_g_unclassified(擬桿菌屬)等類群的豐度較高。高劑量組在Ruminococcaceae(瘤胃菌科)、Parasutterella、Bifidobacterium(雙歧桿菌屬)等類群的豐度較高。

3 討論

本課題組所創(chuàng)健脾益腎經驗方“腎?、蛱柗健彼幬锝M成為：熟地、山藥、山萸肉、白茅根、大小薊、煅牡蠣、炙甘草。方中熟地為補腎滋陰要藥，填精益髓；山藥補氣滋陰，平補脾腎；山萸肉補腎澀精；三者構成六味地黃丸中的“三補”，具有補腎填精作用。方中白茅根涼血止血，清熱利尿；大小薊涼血止血，散瘀利尿；一起合用能增強涼血止血之功。煅牡蠣固澀斂陰，能增強山萸肉補腎滋陰固精之力。炙甘草調和諸藥。本研究使用腎?、蛱柗街兴帩饪s液干預IgA腎病大鼠，實驗結果顯示，腎?、蛱柗娇捎行Ц纳艻gA腎病模型大鼠腎功能及腎臟病理損傷。

在腸道菌群實驗中，使用16SrRNA測序技術檢測在IgA腎病大鼠中腎?、蛱柗綄δc道菌群的影響。通過β多樣性分析我們發(fā)現正常組、模型組、腎病Ⅱ號方高劑量組三組間的群落結構能夠顯著區(qū)分，并且腎病II號方高劑量組的群落結構介于正常組和模型組的群落結構之間，有向正常組恢復的趨勢。通過LEfSe分析，發(fā)現在模型組中，顯著差異類群包括Gammaproteobacteria(變形桿菌綱)、Coprococcus_2(糞球菌屬)和Bacteroidales_g_unclassified(擬桿菌屬)，說明它們可能在IgA腎病的發(fā)病中起重要作用，有學者[19]發(fā)現當變形桿菌綱的革蘭陰性菌增多時，可通過破壞腸道黏膜屏障功能，增加腸道通透性，使內毒素進入循環(huán)增多；腎病Ⅱ號方高劑量組的顯著差異類群

包括Ruminococcaceae(瘤胃菌科)、Parasutterella和Bifidobacterium(雙歧桿菌屬)，表明它們可能在腎?、蛱柗綄gA腎病發(fā)揮干預作用的過程中起重要作用，有研究表明[20-21]雙岐桿菌能夠酸化腸道內環(huán)境，能夠抑制病原菌和腐敗菌的生長，從而保護腸道屏障，減少內毒素進入循環(huán)。上述結果說明腎?、蛱柗侥軌蚋淖僆gA腎病大鼠腸道中的微生物組成。

綜上，腎?、蛱柗娇捎行Ц纳艻gA腎病大鼠腎功能及腎臟病理損傷，IgA腎病大鼠腸道菌群結構發(fā)生了顯著性變化，IgA腎病的發(fā)病可能跟這些顯著差異的細菌有關，而腎?、蛱柗娇赡芡ㄟ^調節(jié)腸道菌群結構來起到治療IgA腎病的作用。目前調控腸道菌群失調已成為治療的新靶點，大量研究[23-26]發(fā)現益生菌具有免疫調節(jié)作用，能增強腸道屏障功能，減少內毒素入血，改善機體慢性炎癥狀態(tài)，延緩腎病進展；而Chemouny等[27]通過口服抗生素調節(jié)菌群來治療人源化IgA腎病小鼠。盡管近年來相關研究較多，但各類腸道菌群的功能及其驅動IgA腎病發(fā)病的機制尚未完全明了。本研究僅就腎病Ⅱ號方對IgA腎病大鼠模型腸道菌群的變化情況進行了檢測，并未能深入探討此類變化在IgA腎病發(fā)生發(fā)展中的具體機制，以及中藥復方成分在此過程中的確切作用。因此未來的研究將繼續(xù)以腸道菌群為治療靶點，擬用無菌小鼠和宏基因組學技術結合，探究特定菌群具體的上下游通路機制，明確其在IgA腎病發(fā)病中的作用，為治療IgA腎病的研究提供新思路。