活血接骨方對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中Wnt信號(hào)通路及Sclerostin基因的影響＊

俞云飛，王建偉，馮 驊，尹 恒，華 臻，吳 毛

(無錫市中醫(yī)醫(yī)院骨科 無錫 214000)

1 引文

骨折作為以骨小梁損傷斷裂為病理特征的臨床疾病，骨折愈合是指骨折處連續(xù)性組織修復(fù)，而骨組織的修復(fù)重建涉及多種組織和細(xì)胞參與，其中干細(xì)胞來源的骨組織重建是骨折修復(fù)的重要組成部分，骨髓則是干細(xì)胞的主要來源。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)也稱骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cell，MSC)是骨髓內(nèi)存在的一類非造血干細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體發(fā)生骨折時(shí)，在局部微環(huán)境的誘導(dǎo)刺激下，向骨折處聚集、遷移，誘導(dǎo)并分化成為成骨細(xì)胞參與骨組織修復(fù)與重建。現(xiàn)代研究表明[1]，BMSCs可以在多種生物信號(hào)因子及信號(hào)通路的調(diào)控下參與骨代謝過程。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族，包括BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-9等具有骨誘導(dǎo)活性的生物因子，被證實(shí)可以通過Smad、Wnt等骨代謝相關(guān)信號(hào)通路參與調(diào)控BMSCs介導(dǎo)的骨修復(fù)過程[2]。

Sclerostin也稱骨硬化蛋白/硬骨素，作為骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞特異性表達(dá)的分泌性蛋白，早期研究中被當(dāng)做BMP抑制劑，通過調(diào)節(jié)Smad信號(hào)通路參與骨代謝形成過程。近期研究表明[3]，Sclerostin主要通過阻礙Wnt信號(hào)通路激活，而非既往認(rèn)為的抑制Smad通路調(diào)控骨代謝過程。國外有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[4]，Sclerostin基因敲除小鼠中骨量明顯增加，而過表達(dá)小鼠出現(xiàn)骨量減少、成骨細(xì)胞數(shù)量減少等趨勢。在對(duì)BMSCs細(xì)胞的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)[5]，Sclerostin不僅可以抑制BMSCs的成骨分化過程，還可以減弱BMSCs細(xì)胞增殖活性及鈣化作用，對(duì)骨形成起負(fù)性調(diào)控作用。目前已證實(shí)，經(jīng)典Wnt信號(hào)通路是調(diào)節(jié)BMSCs成骨分化的重要途徑，該途徑的激活可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化與細(xì)胞礦化現(xiàn)象發(fā)生。

“劉氏骨傷”作為無錫市非物質(zhì)文化遺產(chǎn)，主張以中醫(yī)手法為主、內(nèi)服外敷為輔，要求內(nèi)外兼治、動(dòng)靜結(jié)合[6]。多年來經(jīng)多代傳人總結(jié)、完善形成的我科經(jīng)驗(yàn)方—活血接骨方，臨床驗(yàn)證具有良好的治療效果[7-9]，但其中的作用機(jī)制仍不十分明確。祖國醫(yī)學(xué)一般將其歸屬到“骨折病”范疇，并且與瘀血關(guān)系密切[10]。有研究表明[11,12]，活血接骨類中藥湯劑可以通過拮抗環(huán)氧化酶2(COX-2)抑制劑，促進(jìn)上調(diào)BMP-2及骨鈣素(OC)基因表達(dá)并增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性，從而參與并促進(jìn)骨折早期愈合過程。“續(xù)骨活血湯”作為中醫(yī)傳承經(jīng)驗(yàn)方，主要功效活血祛瘀，止痛續(xù)骨，在治療促進(jìn)骨折愈合取得良好的臨床療效。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，通過siRNA抑制Sclerostin基因可以促進(jìn)BMSCs體外成骨分化過程[13]。在此基礎(chǔ)上，本研究依托無錫市科教強(qiáng)衛(wèi)項(xiàng)目(編號(hào)：ZDRC025)，以BMSCs為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)完整實(shí)驗(yàn)，探究在成骨誘導(dǎo)條件下，活血接骨方對(duì)BMSCs體外成骨分化過程中Sclerostin基因及Wnt信號(hào)通路的影響，揭示活血接骨方促進(jìn)骨折愈合的可能作用機(jī)制。

2 材料與方法

主要試劑和儀器：DMEM(Hyclone，美國)；胎牛血清(GlBICO，美國)；胰蛋白酶(Sigma，美國)；CCK-8試劑盒(Abcam，美國)、茜素紅(Sigma，美國)；總蛋白提取試劑盒(上海碧云天公司，中國)；一抗：Col1A2(貨號(hào)ab96723，稀釋比例1∶500)、OC(貨號(hào)ab13420，稀釋比例1∶500)、OPN(貨號(hào)ab8448，稀釋比例1∶1000)、Sclerostin(貨號(hào)ab63097，稀釋比例1∶1000)、Wnt5a(貨號(hào)ab72583，稀釋比例1∶1000)、GSK-3β(貨號(hào)ab227208，稀釋比例1∶500)、P-GSK-3β(貨號(hào)ab75745，稀釋比例1∶500)及GAPDH(貨號(hào)ab9485，稀釋比例1∶2500)均為美國Abcam公司產(chǎn)品。二抗：山羊抗兔抗體(貨號(hào)7074，稀釋比例1∶2500)和馬抗小鼠抗體(貨號(hào)7076，稀釋比例1∶2500)為美國CST公司產(chǎn)品；NanoDrop 2000(Thermo＆Scintific，美國)；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和Trizol(Invitrogen，美國)；實(shí)時(shí)PCR試劑盒(TOYOBO，中國)；實(shí)時(shí)PCR儀(RocheLightCycler480，德國)；PCR反應(yīng)體系和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas，美國)；SDSPAGE凝膠配制試劑盒和ECL發(fā)光液(上海碧云天公司，中國)。

2.1 活血接骨方含藥血清制備

活血接骨方組成：主要成分包括地鱉蟲、血竭、川芎、川斷、乳香、沒藥、白術(shù)、丁香、杜仲、骨碎補(bǔ)、黨參、當(dāng)歸、黃芪、自然銅、熟地、蘇木等藥物組成等。無錫市中醫(yī)醫(yī)院藥劑室制備，使用0.9%氯化鈉配置成終濃度為0.45 g·mL-1生藥，再經(jīng)過瓶裝、封蓋、滅活，置于4℃冰箱保存。取與中藥湯劑相同劑量的0.9%氯化鈉溶液配置成對(duì)照溶液。

活血接骨方含藥血清制備：取體重為200-250 g SD大鼠10只，依據(jù)《藥理試驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人體間的等效劑量換算》計(jì)算實(shí)際大鼠灌藥劑量，空白血清組給予等量生理鹽水。每天于8點(diǎn)、20點(diǎn)分別灌服中藥或生理鹽水1次，連續(xù)7天，第7天上午8點(diǎn)灌注全天量，灌服后1 h后于下腹主動(dòng)脈采血，經(jīng)靜置、離心、滅活補(bǔ)體、過濾除菌等步驟制得，分裝并標(biāo)記含中藥血清和空白血清，放置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 BMSCs分離與培養(yǎng)

分離：取體質(zhì)量100-150 g SD大鼠，采取頸斷法處死后75%乙醇浸泡消毒，剝離并折斷脛骨及股骨，用含雙抗PBS液(終濃度為青霉素100 U·mL-1和鏈霉100μg·mL-1)沖洗出骨髓細(xì)胞，離心去上清液、PBS重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)。

培養(yǎng)：按1×105個(gè)·cm-2密度將細(xì)胞均勻接種于MGM培養(yǎng)基，加入10%FBS、1%雙抗，37℃、5%CO2環(huán)境的恒溫箱中培養(yǎng)，3天換液1次，繼續(xù)培養(yǎng)7天后收集細(xì)胞，取部分用于實(shí)驗(yàn)，部分液氮冷藏保存。

2.3 BMSCs成骨分化誘導(dǎo)

將BMSCs按1×105個(gè)·cm-2密度接種于6孔板中，使用含MGM培養(yǎng)基的成骨誘導(dǎo)液(100 nmol·L-1地塞米松、10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉、50 mg·L-1抗壞血酸)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行試驗(yàn)。依據(jù)干預(yù)培養(yǎng)條件分為4組：對(duì)照組(含10%空白大鼠血清)、中藥組(10%含藥大鼠血清)、BMP-4組(含0.1 ug·mL-1BMP-4)，中藥+BMP-4組(10%含藥大鼠血清+0.1 ug·mL-1BMP-4)，3天換液1次，共培養(yǎng)28天。采用CCK-8檢測細(xì)胞活性；采用實(shí)時(shí)熒光PCR和Western Blot檢測成骨分化相關(guān)分子(Col1A2、OC、OPN)及Sclerostin基因的mRNA和蛋白水平表達(dá)情況；采用ALP和茜素紅染色檢測細(xì)胞礦化程度。

2.4 中藥含藥血清對(duì)Wnt信號(hào)通路的濃度依賴性研究

將BMSCs按1×105個(gè)·cm-2密度接種于六孔板培養(yǎng)皿，依據(jù)培養(yǎng)血清濃度分4組：空白對(duì)照組(含10%空白大鼠血清)、低濃度組(5%含藥血清)、中濃度組(10%含藥血清)、高濃度組(含20%含藥血清)，最終使用空白大鼠血清調(diào)配使各組最終大鼠血清終濃度為20%，3天換液1次，共培養(yǎng)7天。采用CCK-8檢測細(xì)胞活性；采用實(shí)時(shí)熒光PCR和Western Blot檢測Sclerostin基因和Wnt信號(hào)通路相關(guān)分子(Wnt5a、GSK-3β)的mRNA和蛋白水平表達(dá)情況。

2.5 主要檢測技術(shù)與方法

DNA含量分析：依照CyQUANT細(xì)胞增殖檢測試劑盒操作步驟(購自Invitrogen公司)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中激發(fā)波長為450 nm，發(fā)射波長為530 nm。

CCK-8法：依照CCK-8試劑盒操作步驟(購自Abcam公司)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用酶聯(lián)免疫檢測儀OD 450 nm處測量各孔的吸光值并計(jì)算。

實(shí)時(shí)熒光PCR法：收集細(xì)胞樣品，抽取總RNA，以2μg反轉(zhuǎn)20μL體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。檢測Sclerostin、Col1A2、OC、OPN、Wnt5a、GSK-3β的mRNA表達(dá)。將反轉(zhuǎn)的cDNA稀釋5倍，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。擴(kuò)增體系為10μL，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃5 s、60℃25 s，擴(kuò)增50個(gè)循環(huán)。溶解曲線分析：95℃5 s；溶解曲線為單一峰說明是特異性擴(kuò)增，陰性對(duì)照為ddH2O，GAPDH為內(nèi)參，每個(gè)模板做3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果使用相對(duì)定量2-△△Ct方法分析。引物序列詳見表1。

表1 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)引物序列

Western Blot法：收集細(xì)胞樣品，PBS清洗2次，按100∶1加入蛋白提取緩沖液RIPA(radioimmunoprepciption assay)和蛋白酶抑制劑PMSF(phenylmethanesulfonyl fluoride)提取蛋白，置于冰上30 min后，4°C 12000 rpm離心10 min，吸除上清，4℃?zhèn)溆?，置?20℃長期保存。BCA法檢測蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，用0.22μm孔徑的PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%BSA封閉1 h，4°C一抗孵育過夜后使用0.05%TBST充分洗滌；孵育二抗，常規(guī)ECL發(fā)光液顯色。

ALP染色、活性分析與茜素紅染色：在成骨誘導(dǎo)的第28天，使用固紫B試劑盒(購自Sigma公司)以及茜素紅染色法進(jìn)行染色，并通過倒置顯微鏡觀察拍照記錄。使用磷酸酶分析試劑盒進(jìn)行ALP定量檢測(購自上海碧云天)；使用ImageJ軟件對(duì)茜素紅染色進(jìn)行灰度檢測半定量分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用PASSStatistics 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。數(shù)值采用(±s)表示，兩獨(dú)立樣本采用t檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布且方差齊性采用方差分析，方差不齊采用秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 活血接骨方含藥血清對(duì)BMSCs體外成骨分化及Sclerostin基因的影響

CCK-8檢測結(jié)果顯示：成骨誘導(dǎo)28天后與對(duì)照組相比(0.974±0.069)，中藥組(1.239±0.108，t=2.922，P=0.043)和BMP-4組(1.386±0.043，t=7.132，P=0.002)細(xì)胞活性增強(qiáng)，且中藥+BMP-4組(1.633±0.097，t=7.796，P=0.001)細(xì)胞活性明顯增強(qiáng)。DNA含量檢測結(jié)果也顯示：相較于對(duì)照組(0.973±0.066)，中藥組(1.191±0.086，t=2.821，P=0.048)、BMP-4組(1.407±0.074，t=6.156，P=0.004)和中藥+BMP-4組(1.627±0.063，t=10.135，P=0.001)高于對(duì)照組(1.004±0.066)，提示含有活血接骨方的大鼠含藥血清可以增強(qiáng)BMSCs細(xì)胞活性，且與BMP-4兩者聯(lián)用效果更強(qiáng)(圖1)。

圖1 各組BSMCs細(xì)胞活性比較。

ALP及定量檢查結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比(0.913±0.055)，中藥組(1.221±0.105，t=2.848，P=0.022)、BMP-4組(3.193±0.209，t=14.591，P=0.001)和中藥+BMP-4組(4.961±0.426，t=13.105，P=0.001)BMSCs出現(xiàn)礦化現(xiàn)象、ALP活性增強(qiáng)。茜素紅染色及半定量檢測結(jié)果也顯示：相較于對(duì)照組(1.007±0.102)，中藥組(1.727±0.340，t=2.870，P=0.045)、BMP-4組(4.826±0.208，t=23.280，P=0.001)和中藥+BMP-4組(8.627±0.620，t=17.161，P=0.001)，提示含有活血接骨方的大鼠含藥血清可以增強(qiáng)BMSCs細(xì)胞活性，且與BMP-4兩者聯(lián)用效果更強(qiáng)(圖2)。

圖2 各組BSMCs細(xì)胞礦化程度的比較。

實(shí)時(shí)熒光PCR和Western Blot結(jié)果顯示：①與對(duì)照組相比，中藥組、BMP-4組和中藥+BMP-4組BMSCs成骨相關(guān)分子(Col1A2、OC、OPN)的mRNA和蛋白水平表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05)；②與對(duì)照組相比，中藥組Sclerostin的mRNA和蛋白水平無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，但BMP-4組和中藥+BMP-4組Sclerostin基因的表達(dá)明顯上調(diào)，且中藥+BMP-4組中Sclerostin基因的表達(dá)弱于BMP-4組(P＜0.05)，提示活血接骨方含藥血清可能通過抑制BMP-4介導(dǎo)的Sclerostin基因表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)BMSCs成骨分化過程(圖3-圖4)。

圖3 各組BSMCs中成骨相關(guān)基因與Sclerostin基因mRNA水平表達(dá)比較

圖4 各組BSMCs中成骨相關(guān)基因與Sclerostin基因蛋白表達(dá)比較

3.2 活血接骨方含藥血清對(duì)BMSCs成骨分化中Wnt信號(hào)通路的影響

使用(低濃度、中濃度、高濃度)不同濃度活血接骨方含藥血清干預(yù)BMSCs細(xì)胞7天并檢測相關(guān)指標(biāo)后發(fā)現(xiàn)：①各組細(xì)胞CCK-8結(jié)果(F=3.251，P=0.081)及DNA含量(F=1.499，P=0.287)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；②相對(duì)于空白對(duì)照組，Wnt5a的mRNA和蛋白水平表達(dá)呈現(xiàn)濃度依賴性上調(diào)(F=3.251，P=0.081)，而Sclerostin和GSK-3β的mRNA和蛋白水平呈現(xiàn)與之相反下降趨勢(P＜0.05)，且Tyr216位磷酸化激活的GSK-3β蛋白含量逐漸降低，表明GSK-3β的蛋白活性也逐漸降低，提示隨著含藥血清濃度增加，Wnt信號(hào)通路激活呈現(xiàn)濃度依賴性增強(qiáng)。(圖5-圖6、表2)

表2 各組BMSCs中Wnt信號(hào)通路相關(guān)分子及Sclerostin基因的mRNA表達(dá)(n=3,±s)

表2 各組BMSCs中Wnt信號(hào)通路相關(guān)分子及Sclerostin基因的mRNA表達(dá)(n=3,±s)

注：與對(duì)照組相比，a P＜0.05；與中藥組相比，b P＜0.05；與BMP-4組相比，c P＜0.05。

基因Wnt5a GSK-3β Sclerostin對(duì)照組1.013±0.139 1.037±0.056 1.066±0.049低濃度組1.733±0.089a 0.835±0.084a 0.902±0.065a中濃度組2.159±0.106ab 0.691±0.058ab 0.766±0.076ab高濃度組3.101±0.334abc 0.532±0.051abc 0.593±0.044abc

圖5 各組BSMC細(xì)胞活性比較。

圖6 不同濃度活血接骨方含藥血清對(duì)BMSCs中Wnt信號(hào)通路相關(guān)分子及Sclerostin基因的作用

4 討論

目前骨折的治療方法主要包括手術(shù)、藥物、電磁波、射頻等多種治療方法，但各種療效均具有自身局限性。中醫(yī)藥治療骨折由來已久，祖國醫(yī)學(xué)將骨折其歸屬到“骨折病”范疇，中醫(yī)藥治療骨折病要求辨證論治、和方圓之融，強(qiáng)調(diào)陰陽調(diào)和，具有多靶點(diǎn)、多因素、多方協(xié)同治療骨折的天然優(yōu)勢。目前針對(duì)中醫(yī)藥治療骨折多集中于加強(qiáng)骨代謝形成、促進(jìn)BMSCs成骨分化及原始骨組織形成等方面。BMSCs作為骨髓組織中具有多向分化能力的干細(xì)胞亞群，當(dāng)機(jī)體發(fā)生骨折時(shí)，細(xì)胞會(huì)趨向性遷移、聚集于骨折斷端處并促成骨分化形成骨細(xì)胞，從而形成骨痂、促進(jìn)骨折愈合。目前大量文獻(xiàn)表明，活血續(xù)骨類中藥可通過促進(jìn)BMP-2、BMP-4、BMP-6等成骨因子表達(dá)或增加其促成骨作用，從而實(shí)現(xiàn)促進(jìn)骨折愈合的作用。

“劉氏骨傷”作為無錫市非物質(zhì)文化遺產(chǎn)[6]，多年來經(jīng)多代傳人總結(jié)、完善形成的我科經(jīng)驗(yàn)方-活血接骨方(又名劉氏正骨方)，臨床使用療效確切。該方主要由地鱉蟲、血竭、川芎、川斷、乳香、沒藥、白術(shù)、丁香、杜仲、骨碎補(bǔ)、黨參、當(dāng)歸、黃芪、自然銅、熟地、蘇木等藥物組成，方中杜仲、骨碎補(bǔ)、自然銅、川斷入腎經(jīng)，補(bǔ)腎壯骨，續(xù)骨止痛；土鱉蟲性善走竄，能活血消腫續(xù)筋，熟地補(bǔ)血養(yǎng)陰，填精益髓；黨參、當(dāng)歸、黃芪補(bǔ)益氣血；血竭、川芎、乳香、沒藥均為均有活血散瘀消腫功效，諸藥合用共奏“活血祛瘀，接骨續(xù)筋”之功效。大量臨床研究表明[7-9]，活血接骨方具有良好的臨床療效，但針對(duì)其促進(jìn)骨折愈合的具體作用機(jī)制尚缺乏系統(tǒng)化、深層次的理論研究。基于上述中醫(yī)理論及現(xiàn)代研究結(jié)果，課題組為探究活血接骨方BMSCs成骨分化的影響，開展相關(guān)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)活血接骨方含藥血清可以有效提高BMSCs細(xì)胞活性，且與BMP-4聯(lián)合使用時(shí)效果更佳。ALP活性作為成骨前細(xì)胞及成骨細(xì)胞分化的早期特異性指標(biāo)，與細(xì)胞增殖程度呈正相關(guān)，是細(xì)胞發(fā)生礦化及促成骨分化的基礎(chǔ)。本研究結(jié)果中ALP染色和茜素紅染色結(jié)果也證實(shí)，活血接骨方含藥血清可以增強(qiáng)ALP活性及細(xì)胞礦化現(xiàn)象的發(fā)生。

骨代謝由多因素、多系統(tǒng)的復(fù)雜生物信息網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行調(diào)控，其中多種因子存在相互協(xié)作又相互制約的辯證關(guān)系[14]。為探究活血接骨方與對(duì)BMSCs成骨分化的影響。課題組通過文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，Sclerostin基因作為BMP抑制物，對(duì)骨的形成代謝起負(fù)調(diào)控作用。骨源性細(xì)胞表達(dá)的Sclerostin可以通過抑制BMP因子活性降低骨源性細(xì)胞或成骨細(xì)胞的增殖，阻礙成骨分化過程，在體內(nèi)受甲狀旁腺、雌激素等生物因子間接或持續(xù)性的抑制影響[15,16]。我們既往研究發(fā)現(xiàn)[17]，在人成骨細(xì)胞中BMP-4可以呈濃度依賴性促進(jìn)Sclerostin基因表達(dá)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[13]，在BMP-4體外干預(yù)下，通過siRNA沉默Sclerostin基因可以有效促進(jìn)BMSCs成骨分化及細(xì)胞礦化現(xiàn)象。本研究結(jié)果也再次證實(shí)BMP-4可以上調(diào)BMSCs中Sclerostin基因表達(dá)，但有趣的是，僅用含活血接骨方的大鼠血清進(jìn)行28天的體外干預(yù)后，細(xì)胞中Sclerostin基因表達(dá)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但與BMP-4聯(lián)合使用后可以部分抑制BMP-4介導(dǎo)的Sclerostin基因上調(diào)作用而增強(qiáng)BMP-4促成骨作用，提示含活血接骨方可能通過下調(diào)Sclerostin基因表達(dá)增強(qiáng)BMP-4的促成骨作用。

為了進(jìn)一步探究活血接骨方的調(diào)節(jié)BMSCs成骨分化的機(jī)制途徑，我們通過文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)[18]，Sclerostin主要通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制成骨細(xì)胞活性。Wnt信號(hào)通路是與生長、發(fā)育以及腫瘤發(fā)生等生命過程息息相關(guān)，主要包括經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路、非經(jīng)典Wnt/Ca2+信號(hào)通路以及PCP途徑，其中經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)骨代謝的調(diào)節(jié)具有至關(guān)重要的作用[19]。當(dāng)Wnt/β-catenin處于未激活狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中β-catenin大部分被降解復(fù)合體磷酸化降解，從而維持一個(gè)較低的水平；而出現(xiàn)激活刺激信號(hào)時(shí)，BMSCs中Wnt蛋白(Wnt5a)與輔助受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(LRP5/6)和細(xì)胞跨膜特異性受體卷曲蛋白(Frz)相結(jié)合，通過磷酸化激活并作用于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Dsh蛋白，磷酸化的Dsh蛋白抑制糖原合成激酶(GSK-3β)活性，抑制β-catenin降解復(fù)合體活性，上調(diào)細(xì)胞質(zhì)中β-catenin含量，β-catenin蛋白入核后啟動(dòng)下游多種成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和靶基因表達(dá)，促進(jìn)BMSCs成骨分化、調(diào)節(jié)骨代謝平衡[20-21]。Sclerostin作為Wnt/β-catenin信號(hào)通路的一種可溶性抑制因子，可以通過競爭性與Wnt/β-catenin信號(hào)通路中Lrp5/6中的El螺旋區(qū)域結(jié)合，從而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活、阻礙骨形成。Wnt5a作為Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵因子既參與經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，又參與非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路；不僅促進(jìn)BMSCs中成骨分化，也參與成骨細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)[22]。在此基礎(chǔ)上，國外有學(xué)者[23]通過研究Wnt/βcatenin信號(hào)通路及BMP信號(hào)通路兩者與Sclerostin之間作用后發(fā)現(xiàn)，Wnt5a和GIN(GSK-3β抑制劑)均增加BMP-4誘導(dǎo)的BMP信號(hào)，BMP-4也可以增加Wnt5a和GIN誘導(dǎo)的Wnt信號(hào)。然而，GIN的效果要強(qiáng)烈得多；隨著Wnt信號(hào)通路的增加，Sclerostin表達(dá)量呈劑量依賴性下降，而在此過程中BMP-4可以誘導(dǎo)Sclerostin表達(dá)[24]。因此，課題組通過使用不同濃度中藥血清對(duì)BMSCs進(jìn)行體外干預(yù)并檢測Sclerostin基因與Wnt信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，隨著含藥血清濃度的逐漸增高，Wnt5a表達(dá)呈現(xiàn)濃度依賴性逐漸增高趨勢，而Sclerostin基因和GSK-3β的mRNA和蛋白表達(dá)水平則呈現(xiàn)逐漸下降趨勢。GSK-3β是Wnt/β-catenin經(jīng)典信號(hào)通路的關(guān)鍵因子，是一種在高度保守的絲氨酸／蘇氨酸激酶，可以通過不同位點(diǎn)磷酸化發(fā)揮不同作用，當(dāng)Ser9位點(diǎn)磷酸化可抑制GSK-3β蛋白活性，上調(diào)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-catenin細(xì)胞內(nèi)含量，促進(jìn)下游成骨基因表達(dá)；相反，當(dāng)Tyr216位點(diǎn)磷酸化可激活GSK-3β蛋白活性，降低細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-catenin細(xì)胞內(nèi)含量，抑制下游成骨基因表達(dá)。本次研究結(jié)果中，隨著中藥血清濃度增高，BMSCs中總GSK-3β蛋白含量逐漸降低，且Tyr216位點(diǎn)處的磷酸化GSK-3β蛋白也呈現(xiàn)降低趨勢，提示活血接骨方含藥血清體外誘導(dǎo)BMSCs成骨分化過程中，可能通過抑制Sclerosti基因表達(dá)，上調(diào)Wnt5a基因表達(dá)、下調(diào)GSK-3β基因表達(dá)及Tyr216位點(diǎn)的磷酸化從而促進(jìn)Wnt/β-catenin經(jīng)典信號(hào)通路激活，誘導(dǎo)BMSCs成骨分化過程。但在長期體外干預(yù)狀態(tài)下，活血接骨方含藥血清是否一直對(duì)WnWnt/β-catenin信號(hào)通路存在持續(xù)性影響還有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，活血接骨方含藥血清可以體外促進(jìn)BMSCs成骨分化，這種促成骨作用可能與BMSCs中抑制因子Sclerostin表達(dá)，激活Wnt信號(hào)通路從而促進(jìn)成骨相關(guān)基因表達(dá)有關(guān)。采用現(xiàn)代分子生物細(xì)胞學(xué)技術(shù)，初步探討活血接骨方治療骨折可能的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥治療骨折提供新的思路與理論依據(jù)。

本研究局限：①本研究選用動(dòng)物中藥灌服法制備含藥血清進(jìn)行干預(yù)，受給藥時(shí)機(jī)、給藥方案、采血方法等因素影響，中藥復(fù)方入血成分是否為藥效的主要成分仍需進(jìn)一步深入挖掘；②僅初步探究Wnt信號(hào)通路，針對(duì)多信號(hào)通路之間交互作用，仍需進(jìn)一步研究。