單顆粒光散射顯微成像技術(shù)在生化醫(yī)藥分析中的應用

程 茹，李孟效，黃承志,2*，王 健*

(1.發(fā)光分析與分子傳感教育部重點實驗室，西南大學藥學院，重慶 400715；2.發(fā)光與實時分析系統(tǒng)重慶市重點實驗室，西南大學化學化工學院，重慶 400715)

1 單顆粒光散射探針

等離子體納米顆粒(PNPs)因優(yōu)良的局域表面等離子體共振(LSPR)性質(zhì)而被廣泛用作單顆粒光散射探針[1-3]。當納米顆粒的表面受到特定頻率的光照射，且粒徑遠小于入射光波長時，顆粒表面的自由電子會產(chǎn)生振蕩，當光子的頻率與電子在克服來自中心帶正電的核的束縛力產(chǎn)生的振動頻率一致時，便會發(fā)生LSPR，并輻射出相同頻率的電磁波，產(chǎn)生散射光。

Mie等科學家于1908年推導出金屬納米顆粒的消光光譜(公式1～2)[4]。

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式中，I為散射光強度，m是激發(fā)波長處散射顆粒的相對折光指數(shù)，V為顆粒體積,εm為顆粒周圍介質(zhì)的介電常數(shù),λ為入射光波長,ε1和ε2分別為介電常數(shù)的實部和虛部，σext是消光截面，α代表極化率。由此可得，當?shù)入x子體納米顆粒的狀態(tài)發(fā)生變化時，其LSPR性質(zhì)隨之改變。納米顆粒的材質(zhì)、粒徑、形貌、所處微環(huán)境等因素都會影響其LSPR性質(zhì)，具體分析如下：(1)納米顆粒的材質(zhì)：納米顆粒的元素組成是決定其LSPR性質(zhì)的最根本因素，不同材質(zhì)的納米顆粒，即使粒徑、形貌、微環(huán)境等都相同，其LSPR性質(zhì)也會具有很大差異，例如40 nm的銀納米顆粒(AgNPs)和金納米顆粒(AuNPs)的散射光分別為藍色和綠色(圖1A～B)[5]。(2)納米顆粒的粒徑：一般而言，光散射的顏色會隨納米顆粒的粒徑而改變，例如AuNPs的光散射隨粒徑增大而呈現(xiàn)綠色、黃色、橙色和紅色(圖1B～E)。(3)納米顆粒的形貌：納米顆粒的形貌是決定其LSPR的重要因素，直徑相同但徑向比不同的金納米棒的性質(zhì)也截然不同[6-7]。(4)納米顆粒所處的微環(huán)境：微環(huán)境的折光指數(shù)會影響介電常數(shù)，從而影響散射光譜的峰位置[8]；(5)其他影響因素：納米顆粒之間的耦合等都會影響其LSPR性質(zhì)[9]。

圖1 白光激發(fā)下不同粒徑的金銀納米顆粒溶液的散射光[5] Fig.1 The light-scattering of silver and gold nanoparticles solution when illuminated by a narrow beam of white lightA.40 nm AgNPs;B.40 nm AuNPs;C.78 nm AuNPs;D.118 nm AuNPs;E.140 nm AuNPs

2 單顆粒光散射顯微鏡

等離子體納米顆粒光散射信號的獲取依賴于單顆粒光散射顯微鏡，因其背景為黑色，又稱暗場顯微鏡(DFM)[10]。與明場顯微鏡不同的是，單顆粒光散射顯微鏡上配備暗場聚光鏡，只允許斜射的光照射到樣品上，從而激發(fā)等離子體納米顆粒使其發(fā)出散射光，因此該系統(tǒng)具有高信噪比、實時監(jiān)控的特點[11-15]。散射光經(jīng)過物鏡后一部分被導入到真彩電荷耦合器件(CCD)相機內(nèi)以獲取暗場圖像，另一部分散射光輸入光譜儀可得到單個納米顆粒的散射光譜(圖2)。由于靈敏度高、可實時動態(tài)分析[16-18]等特點，DMF已廣泛用于蛋白質(zhì)[19]、核酸[20]等生物分子的分析檢測[2,21]。

圖2 暗場光學顯微鏡工作原理示意圖[10]Fig.2 Typical dark-field microscopy and spectroscopy setup

3 常用的單顆粒光散射分析方法

由于暗場顯微鏡及其連接的光譜儀可得到等離子體納米顆粒光譜特性、光散射的顏色及顆粒的數(shù)量等相關信息，因此可以根據(jù)光譜的位移[22]、光散射強度的變化[23]、顏色的改變[8]及顆粒數(shù)量[24]等信息建立分析方法(圖3)，實現(xiàn)靶物的靈敏分析及實時動態(tài)監(jiān)控。

圖3 常用的單顆粒光散射顯微成像方法Fig.3 The common methods for single-particle light scattering microscopic imaging

3.1 基于散射光譜波長位移的分析方法

暗場光學顯微鏡可獲取納米顆粒散射光譜等多維信息，通過監(jiān)測靶物誘導的LSPR散射光譜波長移動情況，即可實現(xiàn)靶物的準確、靈敏、定量檢測。等離子體納米顆粒的LSPR性質(zhì)與納米顆粒的材質(zhì)及粒徑息息相關，當顆粒的材料及粒徑發(fā)生改變時，其單顆粒散射光信號隨之發(fā)生改變。

通過生長/刻蝕等方式改變納米顆粒的粒徑以及納米顆粒的組裝/解組裝是引起散射光譜變化的重要途徑[25]，例如直徑為60 nm的AuNPs發(fā)出綠色的散射光，其LSPR峰位于560 nm；但當AuNPs與5′-三磷酸腺苷(ATP)在HAuCl4溶液中共同孵育后，納米顆粒發(fā)生自催化生長粒徑增大，其散射光斑逐漸由綠色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色，LSPR峰紅移至635 nm，據(jù)此可實現(xiàn)ATP的檢測[22]。

圖4 基于殼層結(jié)構(gòu)變化引起的光譜位移建立分析傳感方法Fig.4 The analytical sensing method based on spectral shift caused by shell changeA.pyrophosphate detection based on the growth of copper on AuNPs surface(利用銅在金納米顆粒表面的生長檢測焦磷酸鹽)[26];B.microRNA detection based on the etching of silver shell on gold nanorods surface(基于銀包金納米棒的蝕刻超靈敏檢測microRNA)[27]

3.2 基于散射強度的分析方法

納米顆粒的光散射強度可以通過Image-Pro Plus(IPP)軟件對暗場圖片進行處理獲取，也可從散射光譜直接讀取，再進一步利用散射強度的變化建立分析方法[30]。本課題組早期利用夾心免疫反應，實現(xiàn)了免疫球蛋白(IgG)的分析(圖5A)[31]。先將一抗固定在載玻片上，IgG與一抗結(jié)合后，進一步與修飾AgNPs的二抗結(jié)合，隨著IgG濃度的增大，AgNPs的散射強度隨之增強。此外，根據(jù)等離子體共振能量轉(zhuǎn)移(PRET)引起的散射信號變化，亦可實現(xiàn)分析的目的[32]。當納米顆粒受到與之等離子體共振頻率相匹配的光源激發(fā)時，其受激電子將會躍遷到激發(fā)虛態(tài)，而當周圍存在與之匹配的能量受體時，能量將會通過非福射轉(zhuǎn)移的方式傳遞到受體分子，發(fā)生PRET，貴金屬納米顆粒的散射光猝滅，在暗場顯微鏡下表現(xiàn)為散射光強度降低。本課題組利用靜電作用將金納米海膽與氧化態(tài)的3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)分子進行有效連接，成功構(gòu)建了PRET供受體對。進一步基于酸性磷酸酶(ACP)降解抗壞血酸磷酸酯產(chǎn)生的抗壞血酸能調(diào)節(jié)PRET對的狀態(tài)，建立了高特異性檢測ACP的分析方法[12]。但該法依賴于光譜儀，每次只能掃描單個顆粒，操作復雜耗時。

圖5 基于散射強度變化的分析方法Fig.5 The analytical method based on the scattering intensityA.immunoglobulin detection based on the scattering intensity from spectra(基于散射光譜強度檢測免疫球蛋白)[31];B.microRNA detection based on the scattering imaging intensity obtained by IPP software(基于IPP處理得到的散射強度檢測microRNA)[33]

將獲取的暗場圖片用IPP軟件處理，可快速獲取批量顆粒的強度，不需要昂貴的光譜儀，方法簡單易行。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-27a誘發(fā)的鏈置換反應可釋放脂質(zhì)體裝載的葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖產(chǎn)生H2O2，并進一步與I-作用生成I2刻蝕金納米棒，該過程伴隨著LSPR散射強度的顯著降低。該方法結(jié)合鏈置換反應以及脂質(zhì)體信號放大，能夠檢測乳腺癌細胞提取液中的microRNA-27a(圖5B)[33]。2019年，本課題組利用金納米三角片(AuNPL)開發(fā)了一種動態(tài)監(jiān)測PPi的方法。由于銅離子和碘離子協(xié)同作用對于AuNPL具有刻蝕作用，導致暗場下AuNPL散射光斑的顏色從紅色逐漸變?yōu)榫G色，且散射強度降低，然而PPi與銅離子具有很強的親和力，極大地抑制了Cu2+和I-對AuNPL的刻蝕作用，通過動態(tài)監(jiān)測該反應過程中散射光斑的強度變化，可實現(xiàn)PPi的靈敏檢測[34]。

3.3 基于單顆粒顏色變化的分析方法

2011年，本課題組首次提出將RGB法用于單顆粒散射光分析[8]。RGB分析是根據(jù)顆粒中顏色在R(紅)G(綠)B(藍)的比例將單顆粒光散射信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信息從而代替散射光譜掃描。根據(jù)RGB顏色模型，任何顏色都可分解為R、G、B 3種顏色，通過計算將其轉(zhuǎn)換為0～255之間的整數(shù)值，如藍色可以用RGB=(0,0,255)表示，(255,0,0)表示紅色光散射信號，而(0,255,0)表示綠色光散射信號。基于單顆粒RGB顏色變化的定量分析擺脫了復雜耗時的光譜掃描程序以及光譜儀器昂貴的限制，更加簡單易行[35]，具有明顯的優(yōu)勢，自提出之后便得到了廣泛的應用。

納米顆粒的粒徑變化及組裝均可有效引起顏色的改變。Wang等[36]通過DNA將多個13 nm金納米顆粒連接到50 nm金納米顆粒上構(gòu)建核心-衛(wèi)星納米結(jié)構(gòu)。在加入靶microRNA和燃料DNA后，靶物microRNA直接結(jié)合到連接DNA上相應的toehold1序列，引發(fā)分支遷移反應，觸發(fā)50 nm核心金納米顆粒表面多個13 nm衛(wèi)星金納米顆粒的解離，導致核心-衛(wèi)星納米結(jié)構(gòu)的解體及光散射信號的改變。暗場圖像由DFM的彩色CCD捕獲，然后通過計算機、智能手機或云平臺進行圖像分析，可在1 min內(nèi)獲得microRNA濃度，方法快速，不依賴光譜儀(圖6A)。

RGB顏色分析法在應用時也存在一定的問題，如曝光時間影響顏色的變化[37]，納米顆粒自身的顏色背景高，不利于建立靈敏的分析方法。為解決該問題，本小組進一步發(fā)展了基于偏振光散射成像的RGB分析法。金納米棒具有橫向和縱向兩個截面，首先在縱向側(cè)面上修飾發(fā)卡H1，同時在13 nm的AuNPs表面修飾與H1互補的發(fā)卡H2，靶物miRNA-21催化H1和H2之間的雜交，使AuNPs偶聯(lián)到金納米棒(AuNRs)的側(cè)面，形成核殼衛(wèi)星結(jié)構(gòu)。然而通常情況下，無論是否存在靶物，核殼衛(wèi)星結(jié)構(gòu)在DFM下都呈現(xiàn)紅色的散射光斑，無法建立靈敏的分析方法，但在DFM光源處加入偏振片，可有效解決該問題。當偏振激發(fā)垂直于AuNRs時，由于AuNPs和AuNRs之間的橫向耦合，AuNRs的側(cè)向光散射大大增強，使 DFM圖像的顏色從綠色變?yōu)榧t色，利用IPP軟件分析核殼衛(wèi)星結(jié)構(gòu)的紅光散射百分比變化情況，實現(xiàn)了miRNA-21的靈敏檢測，并有效減弱了背景信號(圖6B)[9]。

圖6 基于RGB顏色變化建立分析方法 Fig.6 The analytical method based on RGB color changeA.principle of algorithm assisted microRNA detection imaging system(算法輔助microRNA檢測成像系統(tǒng)原理) [36];B.polarized light scattering assisted RGB color change for microRNA analysis(偏振光散射輔助的RGB顏色變化用于microRNA分析) [9]

3.4 基于暗場單顆粒計數(shù)的分析方法

暗場顯微鏡可以實時獲得納米顆粒光譜、顏色和數(shù)量等信息，通過靶物與顆粒數(shù)量之間的聯(lián)系，也可實現(xiàn)生物標志物等的定量檢測[38-40]。一方面，該法簡單高效，只需統(tǒng)計視野中納米顆粒的數(shù)量即可，擺脫了昂貴的光譜儀的限制；另一方面，該法對實驗條件要求較高，為了提高顆粒計數(shù)的準確程度，視野中不能存在雜質(zhì)，否則將影響顆粒的數(shù)量，造成統(tǒng)計數(shù)據(jù)不準確；為了避免顆粒分布不均勻引起的誤差，應盡量選取具有統(tǒng)計學意義的區(qū)域進行分析[41]。

為了提高計數(shù)分析法的效率，北京大學李娜教授課題組于2015年開發(fā)了一種基于暗場成像模式自動計數(shù)金納米顆粒的方法(圖7A)[39]。首先利用高通濾波消除干擾和脫焦的散射信號，然后根據(jù)形狀將散射圖像分為若干個子圖像，每個子圖像包含一個識別對象，將形狀和顏色判斷順序應用于每個子圖像以識別AuNPs，從而計算顆粒數(shù)量，并用空白對照和標準AuNPs圖像作為色彩校準排除基底的干擾，提高識別的準確度。該法減少了人工計數(shù)的勞動量和誤差，大大提高了計數(shù)的速度和準確度；另一方面，該法具有較高的通用性，可以擴展至其他納米顆粒。

圖7 基于計數(shù)法建立的分析方法Fig.7 The analytical method based on countingA.nucleic acid detection by combining automatic gold nanoparticle enumeration with target-induced strand-displacement(基于計數(shù)法和鏈置換反應的核酸檢測)[39];B.simultaneous detection of CEA and AFP based on sandwich immune response(于夾心免疫反應的CEA和AFP的同時檢測)[24]

這種基于暗場成像的單顆粒計數(shù)法可用于多種生物標志物的檢測。Li 課題組將磁納米顆粒上連接的金納米顆粒通過鏈置換反應釋放到溶液中，經(jīng)磁力分離后，取上清液，統(tǒng)計視野中的納米顆粒數(shù)量，建立了核酸的快速分析方法，該方法具有普適通用性[42]。清華大學Tan課題組[43]利用計數(shù)法實現(xiàn)了T4多核苷酸激酶活性的測定。Xiao課題組發(fā)展了一種基于上轉(zhuǎn)換納米粒子和金納米顆粒之間發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移的單顆粒計數(shù)法，實現(xiàn)了溶液中前列腺特異性抗原(PSA)的簡單快速分析[44]。

計數(shù)法也可應用于多靶物分析。本課題組通過抗原抗體免疫反應形成三明治復合結(jié)構(gòu)實現(xiàn)了兩種癌癥標志物的分析。先將甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)的一抗固定在載玻片上，當AFP和CEA與抗體結(jié)合后，進一步特異性識別標記修飾AuNPs的AFP二抗和修飾AgNPs的CEA二抗，通過統(tǒng)計AuNPs發(fā)出的綠色散射光斑和AgNPs的藍色散射光斑數(shù)量即可實現(xiàn)CEA和AFP的精準檢測(圖7B)[24]。

利用計數(shù)法進行單靶物識別時，不受納米顆粒尺寸及形態(tài)的限制，同時避免了昂貴的光譜儀，方法方便快速；但在進行多靶物分析時，對納米顆粒形貌及粒徑的要求較為嚴格，否則雜散的散射信號將導致難以實現(xiàn)多靶物的分別準確定量分析?？傮w而言，計數(shù)法對低密度的納米顆粒具有較高的靈敏度，但高密度的納米顆粒易引起聚集，難以準確統(tǒng)計納米顆粒的數(shù)量，不利于建立準確的計數(shù)定量分析方法。

3.5 其他單顆粒分析方法的探索

以上4種常用方法各有優(yōu)勢，但也存在著一定的問題，仍需開發(fā)新的分析方法。本課題組開發(fā)了一種新型時間分辨分析定量方法[45]。AuNRs具有優(yōu)良的等離子體共振散射特性，在暗場顯微鏡中呈穩(wěn)定而較強的紅色光散射信號。在Fe3+和硫脲的共同作用下，AuNRs的形貌逐漸由棒狀變?yōu)樗笮?，最后成為球形，該過程伴隨著散射光的變化，在暗場成像中表現(xiàn)為紅色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色再轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色。由于AuNRs腐蝕后形成的Au[CS(NH)2]2+復合物能夠與肝素鈉進一步形成絡合物，加速AuNRs的腐蝕，本小組基于肝素鈉的濃度與AuNRs散射信號由紅變綠的時間之間的關系建立了分析肝素鈉濃度的方法，該法只需記錄AuNRs由紅色變?yōu)榫G色的時間即可，無需額外的數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理，方法簡便。

4 總結(jié)與展望

暗場顯微鏡技術(shù)由于背景低、敏度高、實時監(jiān)控[17,46]、檢測樣品量少等特點，已經(jīng)被廣泛用于定量分析檢測。本綜述主要從暗場顯微成像分析技術(shù)入手，討論了該技術(shù)在單顆粒水平上利用等離子體納米探針建立的定量分析方法?；诘入x子納米顆粒LSPR散射光譜位移、散射強度變化、計數(shù)法以及單顆粒顏色變化的分析是近年來暗場顯微技術(shù)在生化分析領域中主要的定量分析方法。從定量分析的角度來說，這些方法各有優(yōu)缺點?；诩{米顆粒LSPR散射光譜位移變化的定量方法具有很高的靈敏度和準確度，但昂貴的光譜儀的聯(lián)用及繁瑣耗時的掃譜程序限制了該方法的廣泛應用；基于納米顆粒散射強度變化的方法易受多種因素的影響，除顆粒粒徑外，曝光時間等因素的影響不容忽視；單顆粒計數(shù)法簡單易行且靈敏度較高，但單顆粒計數(shù)法存在的固有缺點(如顆粒分布不均)從一定程度上降低了分析的準確程度；而高通量RGB分析方法和對散射光斑強度的定量分析利用計算機軟件進行信號處理及數(shù)據(jù)采集[47-48]，更加簡單、準確，成本更低，但由于實驗微環(huán)境等不可控因素，該方法的重現(xiàn)性較差。

盡管暗場顯微成像技術(shù)趨于成熟，但仍存在重現(xiàn)性差、準確度低、干擾因素多等問題，因此亟需針對該方法提出改進策略。可從以下幾個方面進行考慮：(1)將濾光片[49]、偏振片[9]等光學器件引入暗場顯微技術(shù)，一方面起到消除背景干擾，提高靈敏度的作用；另一方面，將一些在暗場不易區(qū)分的顆粒散射光斑區(qū)分開來，如偏振成像可有效區(qū)分金納米棒及其組裝結(jié)構(gòu)[9]。(2)將暗場光學顯微鏡與拉曼、電化學或圓二色儀等儀器聯(lián)合使用，進一步提高時空分辨率和靈敏度，拓展方法的使用范圍。(3)充分利用計算機算法[50]、編程技術(shù)、計算機軟件或數(shù)學模型處理繁瑣復雜的實驗數(shù)據(jù)，如IPP、Imaging J、主成分分析法等，提高數(shù)據(jù)處理的效率和準確度。(4)將暗場顯微技術(shù)與現(xiàn)代科技，如深度學習[51]、云計算、人工智能等結(jié)合，開發(fā)更加靈敏準確的定量分析方法。(5)外界環(huán)境對信號影響較大，需要發(fā)展一系列校正方法[37,50]，提高方法的準確性和多次成像結(jié)果的一致性和重現(xiàn)性。