Ras 相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族成員5 對(duì)頭頸鱗癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

魯昱晟，楊文藝，馬海龍，胡鏡宙

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面頭頸腫瘤科，上海交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，國(guó)家口腔醫(yī)學(xué)中心，國(guó)家口腔疾病臨床研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200011

頭頸癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率排名第七位的腫瘤［1］，其中以頭頸鱗狀細(xì)胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）最為多見(jiàn)。曾有研究估計(jì)，2020 年美國(guó)新增頭頸癌5.33 萬(wàn)例，死亡1.08 萬(wàn)例［2］。盡管有包括手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療在內(nèi)的多種治療方案，患者預(yù)后仍然不夠理想，5年生存率約為65%［2］，超過(guò)50%的晚期患者在治療3年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移［3］。因此，尋找調(diào)控HNSCC 侵襲轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物是亟待完善的工作。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一，常見(jiàn)的標(biāo)志分子包括上皮型鈣黏蛋白（epithelial cadherin，Ecadherin）等下調(diào)以及鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail 等上調(diào)。Ras 相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族成員（Ras association domain family，RASSF）是Ras 蛋白的效應(yīng)分子，通過(guò)Ras 相關(guān)結(jié)構(gòu)域與之結(jié)合。研究顯示RASSF 蛋白在多種腫瘤中表觀(guān)遺傳沉默［4］，且往往與腫瘤的惡性特征相關(guān)聯(lián)［5］。RASSF5 是RASSF 蛋白中唯一同時(shí)具有Ras 相關(guān)結(jié)構(gòu)域和SARAH（Sav-RASSF-Hippo）結(jié)構(gòu)域的成員，其編碼基因位于1q32.1，常因啟動(dòng)子發(fā)生甲基化而表達(dá)受到抑制。在骨肉瘤中，RASSF5的低表達(dá)水平與腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［6］。而在肝細(xì)胞癌中，RASSF5表達(dá)水平降低與血管浸潤(rùn)和腫瘤包膜不完整等因素相關(guān)［7］。在HNSCC 中，RASSF5因高甲基化而表達(dá)受限，推測(cè)RASSF5可能也參與HNSCC 的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程［8］。本研究通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探討RASSF5對(duì)HNSCC 細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，以期為HNSCC的治療提供新的潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

高糖DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone 公司， 美國(guó)），NcmColor 彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)、青霉素-鏈霉素（100×）、超敏增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescent，ECL）試劑和0.25%胰蛋白酶消化液（新賽美生物科技有限公司，中國(guó)），過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗（Jackson ImmunoResearch 公司，美國(guó)），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（Cell Signaling Technology，美國(guó)），糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）抗體、N 端第9位絲氨酸（serine，Ser） 殘基發(fā)生磷酸化的GSK-3β（phosphorylated GSK-3β，p-GSK-3β） 抗體［p-GSK-3β（Ser9）抗體］、E-cadherin 抗體和Snail 抗體（Abcam 公司，美國(guó)），RASSF5抗體（愛(ài)博泰克生物科技有限公司，中國(guó)），RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑混合物、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠試劑盒和蛋白質(zhì)上樣緩沖液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國(guó)），TRIzol 試劑（Invitrogen 公司，美國(guó)），反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction，qPCR）試劑盒（Takara公司，日本）。

Quick Drop 超微量分光光度計(jì)（Molecular Devices 公司，美國(guó)），振蕩搖床混合器（KB-5010 型，海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司，中國(guó)），熱循環(huán)基因擴(kuò)增PCR 儀（T100 型，Bio-Rad 公司，美國(guó)），電熱恒溫水槽（DK-8AX 型，上海精其儀器有限公司，中國(guó)），倒置顯微鏡系統(tǒng)（Axio Vert A1 型，Carl Zeiss 公司，德國(guó)），臺(tái)式離心機(jī)（Allegra X-12 型，貝克曼庫(kù)爾特有限公司，美國(guó)），化學(xué)發(fā)光成像儀（Tanon-5200 型，上海天能科技有限公司，中國(guó)），實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（LightCycler96 型，Roche公司，美國(guó)）

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及病毒轉(zhuǎn)染

HNSCC 細(xì)胞系Cal27 來(lái)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American Type Culture Collection，ATCC）；HN30 由美國(guó)馬里蘭大學(xué)提供。細(xì)胞在5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，以含10%胎牛血清和1×青霉素-鏈霉素雙抗的高糖DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。RASSF5過(guò)表達(dá)慢病毒（lentivirus overexpressingRASSF5，LVRASSF5） 及慢病毒空表達(dá)載體（LV vector）的構(gòu)建包裝由吉滿(mǎn)生物科技（上海）有限公司協(xié)助完成。根據(jù)RASSF5基因序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增獲得RASSF5基因片段，并構(gòu)建到CMV-MCSPGK-Puro（PGMLV-PA6）載體上的XhoⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)之間；上游引物序列為5'-TACCGGACTCAGATC TCGAGCCACCATGGCCATGGCGTCCCCGG-3'，下游引物序列為5'-TATCTAGATCCGGTGGATCCTTACCCAGG TTTGCCCTGGGATTCTCTTAAGG-3'。將Cal27 及HN30細(xì)胞分別接種于6孔板，控制培養(yǎng)密度至50%。在培養(yǎng)基中加入LVRASSF5或LV vector 慢病毒原液，控制感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為50；搖勻后加入濃度為5 μg/mL的聚凝胺。感染24 h后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；感染48 h 后將細(xì)胞傳代，控制細(xì)胞鋪展面積為培養(yǎng)皿面積的40%，并在完全培養(yǎng)基中加入嘌呤霉素（2.5 μg/mL）以篩選感染成功后具有嘌呤霉素抗性的細(xì)胞。

1.3 總RNA提取及qPCR

在貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞中加入適量TRIzol，室溫裂解5 min并收集至Eppendorf（EP）管，加入體積為T(mén)RIzol體積1/5的氯仿后顛倒混勻。12 000×g低溫離心15 min后收集上清液，加入等體積異丙醇后混勻。繼續(xù)12 000×g低溫離心15 min，棄上清液并加入75%乙醇。7 500×g低溫離心5 min 后棄上清液，加入無(wú)水乙醇重復(fù)前一步驟。移除乙醇并自然干燥RNA 沉淀，及時(shí)溶解于焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水并測(cè)定RNA 濃度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑Takara PrimeScript?RT Master Mix 將RNA反轉(zhuǎn)錄為40 μL體系cDNA。按兩步法，每孔以2 μL cDNA為模板，0.8 μL 上、下游引物（預(yù)稀釋成10 μmol/L），10 μL TB Green?Premix Ex Taq?Ⅱ（Tli RNaseH Plus）和6.4 μL 無(wú)核酸酶（RNase free）水組成20 μL 反應(yīng)體系，在羅氏LightCycler?96 系統(tǒng)進(jìn)行qPCR 反應(yīng)。引物序列如下：GAPDH正向引物5'-ACAACTTTGGTATCGTG GAAGG-3'，反向引物5'-GCCATCACGCCACAGTTTC-3'；RASSF5正向引物5'-GGGCATGAAACTGAGTGAAG A-3'，反向引物5'-TGGCATCATAGATGGACTGGG-3'。

1.4 總蛋白提取及Western blotting

待細(xì)胞增長(zhǎng)至培養(yǎng)皿面積80%左右，裂解和收集蛋白，12 000×g、4 ℃離心10 min，保留上清液。將蛋白稀釋至統(tǒng)一濃度，加入1/4 體積蛋白質(zhì)上樣緩沖液并加熱變性，以20 μg 的蛋白質(zhì)量上樣于4%～20% SDS-PAGE 凝膠，恒壓電泳至彩色預(yù)染蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品分離至適當(dāng)位置。隨后采用濕轉(zhuǎn)法，300 mA 恒流條件將凝膠內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至甲醇激活的聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，5%脫脂牛奶室溫封閉非特異性抗原1 h。裁剪含目的蛋白質(zhì)條帶并4 ℃孵育相應(yīng)抗體過(guò)夜。TBST 洗膜3 次，每次10 min，室溫孵育過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗1 h，前述步驟洗膜。加入超敏ECL 化學(xué)發(fā)光液，在化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)中顯影成像并掃描。通過(guò)Image J 軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)

將轉(zhuǎn)染LVRASSF5或者LV vector 的Cal27 和HN30 細(xì)胞，按轉(zhuǎn)染病毒不同分為4 組，分別接種于滅菌6 孔板，在新鮮的完全培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至鋪滿(mǎn)皿底。隨后在使用滅菌的移液槍頭在皿底細(xì)胞表面劃痕。經(jīng)PBS 輕輕洗滌后改用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。劃痕后0 h 為起點(diǎn)，間隔12 h 倒置顯微鏡下明場(chǎng)拍照觀(guān)察（40倍視野），以劃痕兩側(cè)細(xì)胞相互接觸作為觀(guān)察終點(diǎn)。通過(guò)Image J 軟件對(duì)各觀(guān)察時(shí)間點(diǎn)的劃痕面積進(jìn)行分析。

1.6 Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中，將轉(zhuǎn)染LVRASSF5或LV vector的Cal27和HN30細(xì)胞按照病毒類(lèi)型分為4組。細(xì)胞消化離心后制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液輕輕吹打后吸取100 μL 細(xì)胞懸液加入普通Transwell小室。下室加入600 μL 含10% FBS 的高糖DMEM 培養(yǎng)基。在Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置相同分組，將細(xì)胞懸液加入鋪有基質(zhì)膠的Transwell 小室，其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。36 h（遷移實(shí)驗(yàn)）或72 h（侵襲實(shí)驗(yàn)）后輕輕吸走上下室培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛固定30 min，隨后用結(jié)晶紫染色。棉簽擦去上室細(xì)胞，并在顯微鏡下觀(guān)察小室下方膜上的染色細(xì)胞。隨機(jī)選取5 個(gè)視野，使用Image J 軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。

1.7 裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型

10只6周齡雄性BALB/c裸小鼠購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK（滬）2018-0006），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK（滬） 2016-0016。研究獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理編號(hào)HKDL2018132。擴(kuò)增轉(zhuǎn)染LVRASSF5和LV vector的Cal27細(xì)胞，消化收集細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個(gè)/mL。將裸鼠分為2 組，每組5 只，經(jīng)尾靜脈分別緩慢注射轉(zhuǎn)染LVRASSF5或LV vector 的Cal27 細(xì)胞懸液100 μL。8 周后，將實(shí)驗(yàn)鼠于麻醉狀態(tài)下實(shí)施安樂(lè)死。打開(kāi)小鼠胸腔，小心解剖并取出肺部，清洗后置于波恩染色液染色，記錄肺部瘤結(jié)節(jié)數(shù)量。

1.8 生物信息學(xué)分析

利用GEPIA 平臺(tái)，基于TCGA 數(shù)據(jù)進(jìn)行HNSCC 的RASSF5表達(dá)圖譜分析和生存分析，并進(jìn)行RASSF5表達(dá)與E-cadherin 編碼基因——鈣黏蛋白1 基因（cadherin 1，CDH1）表達(dá)的相關(guān)性分析。TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)HNSCC 的RASSF5表達(dá)圖譜分析策略：基因選擇RASSF5，選擇TCGA HNSCC 數(shù)據(jù)庫(kù)（519 例），對(duì)應(yīng)TCGA 正常組織數(shù)據(jù)（44 例），差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）設(shè)為1.5，P值臨界值設(shè)為0.001，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為單因素方差分析（oneway ANOVA）。生存分析策略：選擇TCGA HNSCC 數(shù)據(jù)庫(kù)（519 例），生存方法分別選擇總體生存期（overall survival，OS） 和無(wú)病生存期（disease free survival，DFS），RASSF5 高表達(dá)或低表達(dá)隊(duì)列分割閾值分別設(shè)置為75%和25%。RASSF5與CDH1基因表達(dá)相關(guān)性分析策略：選擇TCGA HNSCC 數(shù)據(jù)庫(kù)（519 例）和對(duì)應(yīng)TCGA正常組織數(shù)據(jù)（44 例），Pearson 相關(guān)系數(shù)分析RASSF5與CDH1基因表達(dá)的相關(guān)性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS Statistic 22 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料采用±s表示，通過(guò)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。生存分析采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線(xiàn)，使用Log-rank 檢驗(yàn)不同生存曲線(xiàn)的生存率。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RASSF5表達(dá)水平與HNSCC患者預(yù)后的相關(guān)性

HNSCC 的RASSF5表達(dá)圖譜分析顯示腫瘤組織中RASSF5表達(dá)水平顯著低于正常組織（FC＞1.5，P＜0.001，圖1A）。生存分析顯示，RASSF5低表達(dá)患者的DFS 低于RASSF5高水平患者（Log-rankP=0.005）；RASSF5低表達(dá)患者的OS 低于RASSF5高水平患者（Log-rankP=0.004，圖1B）。

圖1 在HNSCC中RASSF5基因表達(dá)水平以及生存分析Fig 1 Gene expression of RASSF5 in HNSCC and the related survival analysis

2.2 RASSF5對(duì)HNSCC細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

為研究RASSF5是否能影響HNSCC 細(xì)胞遷移及侵襲，首先向Cal27 及HN30 細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染LVRASSF5和LV vector。經(jīng)qPCR 檢測(cè)證實(shí)，Cal27 和HN30 細(xì)胞在轉(zhuǎn)染LVRASSF5后，其RASSF5mRNA 表達(dá)水平相比對(duì)照組顯著提高，分別達(dá)（44.8±0.8） 倍和（60.6±0.6） 倍（圖2A）。通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)分別測(cè)試RASSF5對(duì)遷移能力的影響。以起始劃痕面積為1，HN30在24 h 到達(dá)觀(guān)測(cè)終點(diǎn)，LV vector 組和LVRASSF5組劃痕面積與0 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004，P=0.001），并且LVRASSF5組在觀(guān)察終點(diǎn)的相對(duì)劃痕面積也顯著高于LV vector 組（P=0.003，圖2B）。Cal27 遷移速度較慢，在36 h 到達(dá)觀(guān)測(cè)終點(diǎn)，LV vector 組和LVRASSF5組細(xì)胞劃痕面積與0 h 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001，P=0.016），LVRASSF5組在觀(guān)察終點(diǎn)的相對(duì)劃痕面積顯著高于對(duì)照組（P=0.015，圖2C）。Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)RASSF5的HN30細(xì)胞和Cal27細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)（36 h）穿出小室膜的細(xì)胞數(shù)量均低于相應(yīng)對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001，P=0.005；圖2D），提示過(guò)表達(dá)RASSF5對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移能力具有抑制作用。進(jìn)一步通過(guò)預(yù)鋪基質(zhì)膠的Transwell 小室進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，探究RASSF5對(duì)HNSCC 細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)RASSF5的HN30 細(xì)胞和Cal27 細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)（72 h）穿出小室膜的細(xì)胞數(shù)量均低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001，P=0.001；圖2E），提示過(guò)表達(dá)RASSF5可抑制Cal27及HN30的侵襲能力。

圖2 RASSF5對(duì)Cal27和HN30遷移和侵襲能力的影響Fig 2 Effect of RASSF5 on the ability of cell migration and invasion

2.3 過(guò)表達(dá)RASSF5對(duì)EMT相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響

通過(guò)GEPIA2 平臺(tái)檢索HNSCC 的TCGA 樣本庫(kù)，分析RASSF5和CDH1基因表達(dá)相關(guān)性。Pearson相關(guān)系數(shù)分析提示RASSF5與CDH1基因表達(dá)呈正相關(guān)（R=0.260，P=0.000；圖3A）。Western blotting 分析過(guò)表達(dá)RASSF5后Cal27 和HN30 細(xì)胞中EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)水平改變，結(jié)果顯示RASSF5表達(dá)上調(diào)后CDH1表達(dá)產(chǎn)物E-cadherin蛋白表達(dá)水平增加，p-GSK-3β/GSK-3β 比值和Snail 表達(dá)水平均下調(diào)（圖3B、C）。

2.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證RASSF5抑制腫瘤轉(zhuǎn)移

為了進(jìn)一步檢測(cè)RASSF5對(duì)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，本研究分別構(gòu)建Cal27 過(guò)表達(dá)RASSF5組和對(duì)照組裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型，通過(guò)肺部瘤結(jié)節(jié)數(shù)量評(píng)估腫瘤轉(zhuǎn)移。結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)RASSF5組的裸鼠肺部轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)少于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.049，圖4）。

圖3 過(guò)表達(dá)RASSF5對(duì)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig 3 Effects of RASSF5 overexpression on protein expression of EMT-related proteins

圖4 RASSF5對(duì)Cal27細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移的影響Fig 4 Effect of RASSF5 on lung metastasis of Cal27 cells

3 討論

本研究通過(guò)GEPIA2平臺(tái)分析TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)在HNSCC 中RASSF5基因表達(dá)呈低水平，且低表達(dá)RASSF5的患者有著較差的OS 和DFS。以往的文獻(xiàn)報(bào)道RASSF5基因表達(dá)水平在多種腫瘤中下降，其中包括HNSCC［8］、胃賁門(mén)腺癌［9］和小兒肝母細(xì)胞瘤［10］等。此外，RASSF5的低表達(dá)水平還與包括食管鱗癌［11］在內(nèi)的腫瘤患者不良預(yù)后相關(guān)。

本研究選用了2 種常用的HNSCC 細(xì)胞系Cal27 和HN30，通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell 遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染RASSF5過(guò)表達(dá)慢病毒使細(xì)胞獲得高水平的RASSF5后，Cal27 和HN30 的遷移和侵襲能力明顯受到抑制，提示RASSF5可能參與調(diào)控HNSCC 的侵襲轉(zhuǎn)移能力。EMT是上皮細(xì)胞經(jīng)過(guò)特定轉(zhuǎn)化程序后獲得間充質(zhì)細(xì)胞表型的過(guò)程，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中獲得惡性表型（尤其是浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移）的重要機(jī)制之一。經(jīng)過(guò)EMT 的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出上皮細(xì)胞表型丟失，典型的特征為E-cadherin表達(dá)水平下降。本研究通過(guò)GEPIA2 庫(kù)分析顯示RASSF5和CDH1的基因表達(dá)在HNSCC 中呈正相關(guān)，而Western blotting 結(jié)果也表明過(guò)表達(dá)RASSF5后，E-cadherin 蛋白的表達(dá)水平也隨之提高。

在腫瘤發(fā)展過(guò)程中，E-cadherin 表達(dá)下調(diào)主要由轉(zhuǎn)錄抑制導(dǎo)致，參與的轉(zhuǎn)錄因子包括鋅指蛋白Snail/Slug 家族和堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）E12/E47 因子等［12］。Snail 是一種含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。有研究［13］顯示Snail 能特異性地結(jié)合編碼E-cadherin基因CDH1的啟動(dòng)子區(qū)域“CAGGTG”序列（E-box），同時(shí)募集組蛋白去乙?；? （histone deacetylase 1，HDAC1）、HDAC2和甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2對(duì)組蛋白3上的第27 位賴(lài)氨酸（histone H3 lysine 27，H3K27）和組蛋白3上的第9 位賴(lài)氨酸（histone H3 lysine 9，H3K9）進(jìn)行甲基化和去乙?；揎?，繼而抑制CDH1轉(zhuǎn)錄。Snail 上具有2 個(gè)保守的富含絲氨酸（serine，S）的模體（motif），為GSK-3β的作用位點(diǎn)［14］。GSK-3β磷酸化motif 1可促進(jìn)Snail泛素化降解過(guò)程，而磷酸化motif 2則可調(diào)節(jié)Snail的胞內(nèi)定位從胞核向胞質(zhì)變化［12］。GSK-3β 的活性受到不同的磷酸化方式調(diào)控，其中GSK-3β 的N 端第9 位Ser 殘基發(fā)生磷酸化起到抑制其活性的作用［15-16］。為此本研究從蛋白水平檢測(cè)Snail、p-GSK-3β （Ser9） 及GSK-3β，發(fā)現(xiàn)RASSF5上調(diào)與Snail 表達(dá)水平降低有關(guān)，同時(shí)p-GSK-3β（Ser9）水平顯著下降，而GSK-3β 總蛋白水平無(wú)明顯變化。因此，RASSF5可能通過(guò)抑制GSK-3β 的Ser9 磷酸化失活途徑，促進(jìn)了Snail 泛素化降解，繼而降低對(duì)E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制。

除了對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制作用外，近年來(lái)還有研究報(bào)道RASSF5可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［17］和衰老［18］，提示RASSF5可能在多方面起到腫瘤抑制作用。而Li 等［19］報(bào)道的Tet 甲基胞嘧啶雙加氧酶1（ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase 1，TET1） 靶向RASSF5啟動(dòng)子區(qū)域以及Sun 等［20］報(bào)道的特異性去甲基酶含Jumonji 結(jié)構(gòu)域蛋白3（Jumonji domain-containing 3，Jmjd3）降低RASSF5啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白3 上的第27 位賴(lài)氨酸的三甲基化（trimethylation on histone H3 lysine 27，H3K27me3）等，均可調(diào)控RASSF5表達(dá)升高，為靶向RASSF5位點(diǎn)的研究提供一定思路。

綜上所述，本研究通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RASSF5抑制HNSCC 細(xì)胞遷移和侵襲能力，其機(jī)制可能為RASSF5通過(guò)GSK-3β/Snail 通路抑制EMT 進(jìn)而抑制侵襲轉(zhuǎn)移。該研究有望為HNSCC的治療提供新的潛在靶點(diǎn)。

參·考·文·獻(xiàn)

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