基于33個遺傳多樣性水稻材料的泛基因組分析揭示“隱藏”的基因組變異

欽 鵬，陳薇蘭，王 淏，李仕貴

（四川農(nóng)業(yè)大學水稻研究所，成都 611130）

基因組結構變異（SVs）和基因拷貝數(shù)變異（gCNVs）作為重要的遺傳變異來源，越來越多的證據(jù)表明SV和gCNV在調控動植物表型多樣性方面具有重要作用[1-2]。但基于短片段測序數(shù)據(jù)的SV和gCNV鑒定困難且不可靠[3]。即使利用長片段測序數(shù)據(jù)，仍然很難解決位于重復區(qū)域附近或非常大的SV[4]。近年來，由于高質量基因組組裝方法的快速發(fā)展，越來越多研究利用高質量組來鑒定和分析SV[5-10]。但目前相關研究僅限于少數(shù)材料，少有利用群體水平的高質量基因組來研究SV，因此植物基因組的SV和gCNV變異情況仍不清楚。水稻作為世界上最重要的糧食作物和植物研究的模式生物，到目前為止，僅有利用短片段測序數(shù)據(jù)鑒定的SV結果[11-15]，還未有群體水平上對水稻SV和gCNV全面準確的研究報道。

研究人員選取了遺傳背景具有高度代表性的33個水稻材料，包括亞洲栽培稻各亞群代表性材料和非洲栽培稻材料，以及水稻生產(chǎn)和育種上廣泛使用的優(yōu)良品種和核心親本材料。利用長片段測序和NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得了31份材料平均深度～60倍的長片段序列數(shù)據(jù)。利用高質量基因組組裝和注釋流程，獲得了31個均達到參考基因組水平的高質量基因組和基因注釋。結合已發(fā)表的兩個高質量基因組（日本晴和蜀恢498）和注釋結果，構建了一個含66 636個基因的泛基因組。通過32個材料與日本晴基因組序列的比較分析，發(fā)現(xiàn)平均每個材料相對日本晴存在24 469個SVs，通過去冗余，共獲得171 072個相對于日本晴基因組的非冗余SVs，并應用多種方法證明了鑒定到的SV具有較高的準確性。通過與已報道的SV比較分析，發(fā)現(xiàn)其中82.8%的SV未在先前基于短序列測序數(shù)據(jù)得到的SV中鑒定到。進一步對SV在基因組上分布的分析發(fā)現(xiàn)，SV在染色體上非均勻分布，存在140個SV熱點區(qū)域。

研究人員進一步利用非洲栽培稻CG14作為外群，對亞洲栽培稻群體中SV序列的祖先型進行了推斷，共對130 862個SV祖先型進行了推斷，并將明確發(fā)生在亞洲栽培稻中的SVs定義為dSVs（derivedstate SVs）。對dSV相對基因位置的分析發(fā)現(xiàn)，53.2%的dSV位于基因附近（包括基因上下游2 kbp區(qū)域），其中大多數(shù)位于基因的非編碼區(qū)且發(fā)生在較少材料中?；诨虻姆夯蚪M中～50%（32 668）的基因上下游2 kbp區(qū)域在32個亞洲栽培稻種至少有一個dSV，其中包括1 406個已經(jīng)報道的基因。這些dSVs對揭示亞洲栽培稻中自然選擇和人工馴化過程導致基因組結構性變異的方向和生物學意義具有重要作用。例如先前報道的兩個與獨腳金內酯合成相關基因SLB1和SLB2被認為是在秈稻群體中缺失與優(yōu)良性狀（分蘗增加和獨腳金萌發(fā)降低）相關而被人工選擇到[16]，本研究結合該SV的分化狀態(tài)和群體分布等分析發(fā)現(xiàn)，很可能是在粳稻中進化或馴化過程中被插入含有SLB1和SLB2基因的基因組序列，因為其可能幫助磷的吸收提高產(chǎn)量從而被保留在粳稻中。

因為筆者發(fā)現(xiàn)大多數(shù)SV位于非編碼區(qū)，研究人員進一步利用蜀恢527材料中存在與不存在SV的基因，分析了SV對基因表達量的影響。通過分析多份不同脅迫處理和不同發(fā)育時期的蜀恢527轉錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在整體表達水平上，附近存在SV的基因的表達量低于不存在SV的基因的表達量，且附近存在SV的基因的表達量對環(huán)境脅迫更敏感。利用33份材料苗期地上和地下轉錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)3 340個SV在地上或地下組織中與基因表達量顯著相關，表明SVs在水稻進化和馴化過程中對基因表達模式有著廣泛的影響。研究人員進一步分析了dSVs在亞洲栽培稻各個亞群中的分布，發(fā)現(xiàn)在可用于分析群體分布的20 965個dSV中，25.7%的dSVs被特異性地固定在一個或多個亞群中，暗示大量dSVs可能受到自然或人工選擇并保留在相應的群體中。

研究人員利用泛基因組中基因的蛋白序列比對到33個基因組序列的策略鑒定分析gCNV，發(fā)現(xiàn)大量（25 549）基因在33個材料間存在基因序列拷貝數(shù)變異（gCNV），包括2 945個非洲栽培稻CG14特異的gCNVs，22 604個栽培稻中特異的gCNVs。結合33份材料苗期的地上和地下組織轉錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，296和361個基因的拷貝數(shù)變異和表達量在之間存在顯著地相關性。這些之前研究未發(fā)現(xiàn)大量具有gCNV的基因將加速優(yōu)異自然等位變異的挖掘，比如OsVIL1在N22等7個材料中存在2個拷貝，且與表達量顯著正相關。結合OsVIL1過表達能提高穗粒數(shù)[17]，因此該2個拷貝很可能具有增加水稻穗粒數(shù)的功能。大量具有gCNV基因的鑒定也將有利于加快挖掘復雜區(qū)域中控制農(nóng)藝性狀多態(tài)性的基因組變異和應用，如之前報道的越光中早花QTL（qDTH7-3）[18]，我們發(fā)現(xiàn)OsMADS18兩個拷貝位于該區(qū)段，結合OsMADS18過表達的早花表型[19-20]推斷OsMADS18兩個拷貝很可能是控制該早花QTL的目標變異。

結合人類分析SV形成機制的流程，研究人員系統(tǒng)地分析了水稻中SV形成機制。發(fā)現(xiàn)水稻SV主要由TEI（轉座子插入）和NHEJ（非同源末端連接）兩種機制形成。但對于不同類型的SV，主要的形成機制有所不同，比如缺失和插入分別主要由NHEJ和TEI形成。結合SV邊界序列與TE注釋，研究人員發(fā)現(xiàn)73.2%的由NHEJ和NAHR（非等位同源重組）機制形成的SV的邊界都具有TE序列。同時相比全基因組LTR的比例，NHEJ和NAHR產(chǎn)生的SV斷點兩端具有更高比例的LTR。這些結果表明TE，特別是LTR能更高頻率產(chǎn)生DNA斷裂為NHEJ形成SV提供可能，以及LTR能更高頻率提供同源序列為NAHR產(chǎn)生SV提供可能。

研究人員進一步利用所鑒定到的PAV（presence and absence variation）和 variation graph toolkit流程，首次構建了水稻圖形基因組。結合674份水稻材料的二代短序列測序數(shù)據(jù)和圖形基因組共鑒定到47 952個PAV。與674份材料的SNP數(shù)據(jù)連鎖分析發(fā)現(xiàn)，17.5%的SV表現(xiàn)出與其附近SNP非常低的連鎖度，表明這些基因組變異不能被SNP代表。利用674份材料的葉片早衰表型和SNP、SV數(shù)據(jù)進行GWAS分析發(fā)現(xiàn)，最顯著相關的位點只能被SV檢測到。該SV位于Os06g13470基因啟動子區(qū)域，表達量分析結果表明該SV可能特異性在灌漿期激活Os06g13470的表達，暗示該SV很可能是控制葉片早衰的候選變異位點。這些結果表明：在研究自然變異調控農(nóng)藝性狀多態(tài)性方面，圖形基因組和SV具有SNP與線性參考基因組難以代替的作用。研究人員進一步搭建了包含基因組序列和基因組變異的數(shù)據(jù)庫RiceRC.Com。本研究內容（圖1）為水稻及其他作物功能基因組研究、優(yōu)良等位基因挖掘和功能解析、分子設計育種奠定了堅實基礎。

圖1 本研究相關的主要內容Figure 1 This topic research primary coverage