• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    山蒼子精油抑制沙門(mén)菌作用機(jī)制研究

    2021-07-02 14:48:18李欣越茍玉虹申瀚君李育浩尹立子
    關(guān)鍵詞:山蒼子沙門(mén)細(xì)胞膜

    李欣越,茍玉虹,申瀚君,李育浩,王 濤,尹立子

    (四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,成都 611130)

    沙門(mén)菌屬(Salmonella)是一種在自然界廣泛分布的革蘭氏陰性細(xì)菌,可感染人和動(dòng)物引發(fā)菌血癥、敗血癥、胃腸炎等,威脅人和動(dòng)物的健康[1-2]。據(jù)美國(guó)疾病預(yù)防控制中心(CDC)統(tǒng)計(jì),沙門(mén)菌在美國(guó)每年會(huì)造成135萬(wàn)人感染,26 500人住院,400余人死亡;在全球可造成超過(guò)9 000萬(wàn)人感染和15余萬(wàn)人死亡[3]。因其廣泛存在于肉類(lèi)、乳類(lèi)、蛋類(lèi)、果蔬類(lèi)食品甚至土壤中,故由其引起的感染主要是食源性的[4]。已有研究發(fā)現(xiàn),從人體和雞肉中分離的沙門(mén)菌對(duì)四環(huán)素、氨芐西林等多種抗生素產(chǎn)生了高度耐藥性[5]。因此,尋找沙門(mén)菌的有效防治方法、維護(hù)公共衛(wèi)生已迫在眉睫。

    植物精油是從植物的果實(shí)、花、葉、根等中提取得到的揮發(fā)性芳香物質(zhì),含量低但卻有多種生物活性,近年來(lái)在食品抗菌方面的應(yīng)用研究尤其深入[6-7]。山蒼子精油(Litsea cubeba essential oil,LC-EO)呈淡黃色,由山蒼子果實(shí)中提取得到,且有強(qiáng)烈的檸檬味。山蒼子精油有廣譜抗菌作用,Liu T.等[8]和趙露露等[9]的研究表明,山蒼子精油對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等細(xì)菌都有良好的抑菌活性。戴錦銘[10]的研究表明山蒼子精油可以破壞大腸桿菌的細(xì)胞膜、影響其能量代謝、抑制其蛋白質(zhì)合成、減少胞內(nèi)DNA含量等。吳均等[11]的研究發(fā)現(xiàn),山蒼子精油可以改變金黃色葡萄球菌菌體的通透性、降低其蛋白質(zhì)的利用率。但目前山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌的抑菌機(jī)理方面的研究還很少。本研究旨在從細(xì)胞膜通透性、形態(tài)結(jié)構(gòu)、可溶性蛋白質(zhì)含量、生物被膜形成等方面探究山蒼子精油對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌的抑菌機(jī)制。為防治沙門(mén)菌引起的食物中毒、開(kāi)發(fā)以山蒼子精油為基礎(chǔ)的新型藥食同源產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 藥品和菌株

    山蒼子精油(純度≥98%,成都瑞芬思公司)用二甲亞砜(成都浩博優(yōu)公司)溶解,配制成質(zhì)量濃度為40.96 mg/mL的母液備用;鼠傷寒沙門(mén)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 14028)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.2 試劑和器材

    胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)、腦心浸出液肉湯(BHI)購(gòu)自杭州微生物試劑公司;PBS磷酸緩沖鹽粉劑、2.5%Gluta固定液、無(wú)水葡萄糖購(gòu)自成都浩博優(yōu)公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物公司;SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、4×雙色蛋白上樣緩沖液、雙色預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自成都羅寧生物公司。

    UV-2000型紫外分光光度計(jì)(UNICO,美國(guó))、ZD-85A氣浴恒溫振蕩器(金壇市科析儀器公司,中國(guó))、DDS-307電導(dǎo)率儀(上海儀電科學(xué)儀器公司,中國(guó))、全功能凝膠成像系統(tǒng)儀(Bio-Rad公司,美國(guó))。

    1.3 方法

    1.3.1 山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌生長(zhǎng)的影響

    采用二倍稀釋法測(cè)定山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌的MIC,設(shè)立只加菌液的陽(yáng)性對(duì)照組,只加山蒼子精油的陰性對(duì)照組,只加培養(yǎng)基的空白對(duì)照組,37℃恒溫培養(yǎng)16~24 h后,用肉眼進(jìn)行觀(guān)測(cè),所有透明且澄清的試管中,含最小的山蒼子精油濃度的試管所設(shè)定的濃度值,即為MIC[12]。采用平板畫(huà)線(xiàn)法測(cè)定MBC,從MIC試驗(yàn)中所有澄清的試管中吸取0.1 mL均勻涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)24 h后觀(guān)察計(jì)數(shù),以5個(gè)以下菌落的培養(yǎng)基所對(duì)應(yīng)的山蒼子精油濃度為MBC[13]。

    吸取80 μL過(guò)夜培養(yǎng)的沙門(mén)菌菌液于30 mL BHI培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),當(dāng)菌液OD600=0.3時(shí),加入山蒼子精油,并使其質(zhì)量濃度為 0、32、64、128、256 和512 μg/mL,振蕩培養(yǎng)。并在第 0、1、2、4、6、8、16、24 h測(cè)定其OD600值,繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

    1.3.2 山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌電導(dǎo)率的影響

    參考F.Bendali等[14]的方法,取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的沙門(mén)菌液1 mL接種于50 mL TSB液體培養(yǎng)基,振蕩培養(yǎng)16 h后,加入山蒼子精油使其質(zhì)量濃度等于2 MIC,對(duì)照組加入同體積的DMSO。37℃恒溫培養(yǎng),在第0、1、2、4、6和 8h時(shí),分別取5 mL菌液,4500r/min離心10 min,取適量上層澄清液體,將其按1∶40比例與5%的無(wú)菌葡萄糖溶液混合,用電導(dǎo)率儀測(cè)定混合溶液的電導(dǎo)率。

    1.3.3 山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌細(xì)胞膜電位的影響

    呂:當(dāng)然,你的《德克薩斯》的價(jià)值除了展現(xiàn)戰(zhàn)爭(zhēng)跳動(dòng)的旋律和令人窒息的危險(xiǎn),在表述戰(zhàn)爭(zhēng)的慣性恐怖感受和作戰(zhàn)的超現(xiàn)實(shí)主義方面成功外,啟示人們用另一種眼光來(lái)審視世界的,給讀者更大闡釋空間的是你對(duì)處在戰(zhàn)爭(zhēng)這一非常態(tài)下的情愛(ài)的描寫(xiě),對(duì)非常態(tài)的情愛(ài)的這種人文關(guān)懷同樣令我癡迷。特別想聽(tīng)聽(tīng)你自己是如何詮釋小說(shuō)中蘇珊與克洛特·蓋博之間的情愛(ài)的。

    參考楊磊等[15]的方法,將沙門(mén)菌于MH培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0.5~0.6后,取適量菌液,3 000 r/min離心10 min,舍棄上層澄清液體,用5 mmol/L含葡萄糖的HEPES緩沖液洗滌沉淀并將其稀釋至OD600=0.05左右。向適量稀釋后的菌液中加入0.4 mmol/L DISC3(5)工作液并使其最終濃度為 0.8 μmol/L,在室溫下避光振蕩1.5 h后,加入4 mol/L KCL工作液并使其最終濃度為100 mmol/L,在室溫下避光振蕩0.5 h。取200 μL制備的菌液,在避光處迅速加入山蒼子精油并使其最終濃度為 0、64、128、256、512 μg/mL,激發(fā)光622 nm、發(fā)射光670 nm條件下,間隔5 min,時(shí)長(zhǎng)30 min,檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

    1.3.4 山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

    將沙門(mén)菌在TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,加入山蒼子精油使其濃度等于2 MIC,對(duì)照組加入同體積的DMSO,振蕩培養(yǎng)。分別在第12、16、24 h時(shí)取適量菌液,4 500 r/min離心10 min,保留沉淀并用PBS緩沖液洗滌2次,用Gluta固定液固定,12、16 h樣品經(jīng)脫水、浸透、包埋、修塊、切片、染色處理,在顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)[16];24 h樣品經(jīng)脫水、干燥、鍍金后在掃描電鏡下觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)[17]。

    1.3.5 山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌可溶性蛋白的影響

    按探究山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響樣品制備步驟,用PBS緩沖液洗滌下層菌體沉淀3次并定容至1 mL。將定容后的菌液超聲破碎后,6 000 r/min離心10 min,取適量上層清液,用BCA蛋白試劑盒測(cè)定其中的蛋白質(zhì)含量。將上清液與蛋白上樣緩沖液按3∶1體積比混合,高溫變性后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳實(shí)驗(yàn),經(jīng)染色、脫色、成像后觀(guān)察蛋白質(zhì)電泳結(jié)果[18]。

    1.3.6 山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌生物被膜形成的影響

    向5個(gè)TSB培養(yǎng)基中加入山蒼子精油并使其濃度為 0、8、16、32、64 μg/mL,將沙門(mén)菌振蕩培養(yǎng)至OD600=0.2后,取10 μL菌懸液于96孔板中,每孔再加290 μL含蔗糖和對(duì)應(yīng)濃度山蒼子精油的TSB培養(yǎng)基,37℃靜置培養(yǎng)48~72 h。移除96孔板中混合溶液,加入10 μL 10%甲醛溶液并室溫培養(yǎng)過(guò)夜,移除甲醛溶液,加入100 μL 0.1%的結(jié)晶紫并在室溫放置30 min,移除結(jié)晶紫,用雙蒸水小心沖洗孔板,加入200 μL 33%乙酸溶液后,用酶標(biāo)儀測(cè)OD570值[19]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌生長(zhǎng)的影響

    圖1 山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響Figure 1 The growth curve of LC-EO against Salmonella

    2.2 山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌電導(dǎo)率的影響

    當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞膜通透性改變時(shí),其細(xì)胞內(nèi)的無(wú)機(jī)鹽等會(huì)滲透過(guò)細(xì)胞膜到細(xì)胞外,從而引起菌液電導(dǎo)率的增加[20]。據(jù)此原理,本實(shí)驗(yàn)對(duì)加入2 MIC濃度的山蒼子精油的鼠傷寒沙門(mén)菌液電導(dǎo)率進(jìn)行測(cè)定。據(jù)圖2,與0 h的數(shù)據(jù)相比,菌懸液培養(yǎng)1 h的電導(dǎo)率為(8.39±0.50)%(P<0.01);培養(yǎng) 2 h的電導(dǎo)率為(9.82±0.49)%(P<0.01);培養(yǎng) 8 h 的電導(dǎo)率為(8.39±0.37)%(P<0.01)。而加入 DMSO 的菌液的電導(dǎo)率基本不變。由此可看出,山蒼子精油可迅速且顯著地改變沙門(mén)菌細(xì)胞膜的通透性。

    圖2 2 MIC的山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌菌懸液電導(dǎo)率的影響Figure 2 Effect of 2 MIC LC-EO on conductivity of Salmonella suspension

    2.3 山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌細(xì)胞膜電位的影響

    當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞膜破損或發(fā)生去極化時(shí),DISC3(5)熒光探針可進(jìn)入細(xì)胞水相溶液發(fā)出可檢測(cè)熒光,引起熒光值變化[15]。據(jù)圖3,與未加入山蒼子精油的對(duì)照組相比,加有山蒼子精油的沙門(mén)菌的熒光強(qiáng)度均增大,且呈濃度依賴(lài)性。在30 min內(nèi),加有山蒼子精油的沙門(mén)菌熒光強(qiáng)度總體略呈增加趨勢(shì),而對(duì)照組率呈降低趨勢(shì)。表明山蒼子精油使沙門(mén)菌細(xì)胞膜發(fā)生了破損,改變了其通透性。

    圖3 不同濃度的山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌細(xì)胞膜電位的影響Figure 3 Effect of different mass concentration LC-EO on membrane potential of Salmonella

    2.4 山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

    據(jù)圖4,對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整、邊界清晰,胞內(nèi)染色質(zhì)和生物被膜豐富。而經(jīng)山蒼子精油處理的菌體,在透射電鏡下觀(guān)察到細(xì)胞變形,細(xì)胞膜皺縮、破損甚至溶解,從而使細(xì)胞內(nèi)容物流出,胞質(zhì)減少而染色變淺,且出現(xiàn)大量空泡化;在掃描電鏡下觀(guān)察到細(xì)胞膜塌陷,細(xì)胞發(fā)生粘連而邊界不清晰,形態(tài)結(jié)構(gòu)不完整。

    圖4 山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Figure 4 Effects of LC-EO on morphological structures of Salmonella cells

    2.5 山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌可溶性蛋白的影響

    BCA蛋白試劑盒測(cè)定結(jié)果顯示,山蒼子精油作用12、16 h后,鼠傷寒沙門(mén)菌的可溶性蛋白分別減少(41.69±0.97)%(P<0.01)、(39.05±0.92)%(P<0.01)。據(jù)圖5,經(jīng)2 MIC的山蒼子精油處理后,分子量在40 000和70 000左右的可溶性蛋白質(zhì)減少,分子量在25 000~30 000間的蛋白質(zhì)明顯減少甚至消失。由此可看出,山蒼子精油可使沙門(mén)菌的可溶性蛋白質(zhì)減少。

    圖5 山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌可溶性蛋白質(zhì)含量的影響Figure 5 Effect of LC-EO on the soluble protein contents of Salmonella

    2.6 山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌生物被膜的影響

    據(jù)圖6,與對(duì)照組相比,經(jīng)不同亞抑菌濃度的山蒼子精油處理后,8 μg/mL組的生物被膜總量減少(19.25±3.42)%(P<0.01);16 μg/mL 組的生物被膜總量減少(37.73±2.84)%(P<0.01);32 μg/mL 組的生物被膜總量減少(56.91±3.40)%(P<0.01);64 μg/mL組的生物被膜總量減少(65.91±4.41)%(P<0.01)。據(jù)此可知,經(jīng)亞抑菌濃度的山蒼子精油處理后,沙門(mén)菌生物被膜的形成均被抑制,且隨山蒼子精油濃度增高,抑制作用增強(qiáng),呈濃度依賴(lài)性。

    圖6 不同濃度的山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌生物被膜形成的影響Figure 6 Effects of different concentrations of LC-EO on biofilm formation of Salmonella

    3 討論與結(jié)論

    沙門(mén)菌感染是食源性疾病的主要原因,研究表明目前沙門(mén)菌已有較高的耐藥性[21]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),山蒼子精油對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌的MIC和MBC均為256 μg/mL,表明山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌有明顯的抑制和殺滅作用,山蒼子精油可作為沙門(mén)菌的殺菌藥,因此,以山蒼子精油為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)相關(guān)產(chǎn)品,治療沙門(mén)菌引起的感染性疾病有很大前景。

    細(xì)胞膜是細(xì)胞的屏障,受損會(huì)改變細(xì)胞的通透性,影響細(xì)胞的新陳代謝[22]。膜電位試驗(yàn)中,加有山蒼子精油的沙門(mén)菌的細(xì)胞膜電位與對(duì)照組相比均增大,表明山蒼子精油改變了沙門(mén)菌的通透性。電導(dǎo)率試驗(yàn)再次證明了這一觀(guān)點(diǎn)。這與孟玉霞等[23]的結(jié)論一致。

    蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)。何學(xué)文等[24]發(fā)現(xiàn)亞抑菌濃度的肉桂醛可使沙門(mén)菌蛋白質(zhì)條帶變淺甚至部分條帶消失。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),山蒼子精油可使沙門(mén)菌的蛋白質(zhì)含量減少,部分蛋白質(zhì)條帶變淺甚至消失,這可能是因?yàn)樯缴n子精油改變了沙門(mén)菌膜結(jié)構(gòu)的通透性和完整性,蛋白質(zhì)外流所致。

    生物被膜不僅可幫助菌體適應(yīng)環(huán)境利于生存,還可以導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性和持續(xù)性感染。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),亞抑菌濃度的山蒼子精油可明顯抑制沙門(mén)菌生物被膜的形成。崔海英等[25]的研究表明山蒼子精油可通過(guò)清除胞外聚合物來(lái)破壞MRSA生物膜的結(jié)構(gòu),抑制膜內(nèi)細(xì)菌的代謝水平,山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌生物被膜的作用機(jī)制可能如此。

    山蒼子精油來(lái)源廣泛,價(jià)格低廉,具有副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)勢(shì)。根據(jù)GB2760-86標(biāo)準(zhǔn),我國(guó)已批準(zhǔn)山蒼子精油用于食品中,因其無(wú)毒副作用,其還被廣泛用于醫(yī)藥、化工等行業(yè)[26]。因此,以山蒼子精油為原料,將其制成食品保鮮劑或藥食同源產(chǎn)品有良好前景。

    綜上所述,山蒼子精油可明顯抑制沙門(mén)菌生長(zhǎng),可通過(guò)改變沙門(mén)菌的細(xì)胞通透性、抑制生物被膜合成、減少可溶性蛋白質(zhì)含量、改變細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)來(lái)影響沙門(mén)菌的新陳代謝,從而起到抑菌和殺菌作用。為更好地開(kāi)發(fā)出山蒼子精油的相關(guān)產(chǎn)品以抑制沙門(mén)殺菌,還應(yīng)探究山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌遺傳物質(zhì)的作用,并進(jìn)行相關(guān)體內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn)。

    猜你喜歡
    山蒼子沙門(mén)細(xì)胞膜
    廣西山蒼子油提取工藝及成分分析
    一株雞白痢沙門(mén)菌噬菌體的發(fā)酵及后處理工藝研究
    山蒼子果和葉營(yíng)養(yǎng)成分比較分析
    沙門(mén)菌噬菌體溶菌酶LysSHWT1的制備及抑菌活性分析
    湖南省山蒼子6個(gè)天然居群果皮精油成分分析
    2013-2017年北京市順義區(qū)腹瀉病例中沙門(mén)菌流行特征
    藥用觀(guān)賞植物(山蒼子)在園林中的應(yīng)用
    皮膚磨削術(shù)聯(lián)合表皮細(xì)胞膜片治療穩(wěn)定期白癜風(fēng)療效觀(guān)察
    宮永寬:給生物醫(yī)用材料穿上仿細(xì)胞膜外衣
    香芹酚對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的影響
    可以在线观看的亚洲视频| 色av中文字幕| 搡老熟女国产l中国老女人| 三级国产精品欧美在线观看| 国产成年人精品一区二区| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 少妇人妻精品综合一区二区 | 欧美精品啪啪一区二区三区| 久久国产乱子伦精品免费另类| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 在线观看午夜福利视频| 国产精品久久电影中文字幕| 中文资源天堂在线| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲国产欧美人成| 精品无人区乱码1区二区| 免费在线观看日本一区| 成年女人看的毛片在线观看| 天堂动漫精品| 精品一区二区三区视频在线| 日韩中字成人| 一个人观看的视频www高清免费观看| 首页视频小说图片口味搜索| 黄色配什么色好看| 亚洲片人在线观看| 97热精品久久久久久| 亚洲av电影不卡..在线观看| 黄色日韩在线| 美女黄网站色视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 男女那种视频在线观看| 悠悠久久av| 深夜精品福利| 简卡轻食公司| 99久久99久久久精品蜜桃| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 日韩有码中文字幕| 淫妇啪啪啪对白视频| 精品不卡国产一区二区三区| 深夜精品福利| 能在线免费观看的黄片| 麻豆一二三区av精品| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 欧美丝袜亚洲另类 | 日韩欧美 国产精品| www.999成人在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产 一区 欧美 日韩| 一级黄色大片毛片| 色吧在线观看| 一级作爱视频免费观看| netflix在线观看网站| 又粗又爽又猛毛片免费看| 男女床上黄色一级片免费看| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 看片在线看免费视频| 在线观看av片永久免费下载| 国产精品女同一区二区软件 | 久久精品国产亚洲av涩爱 | 乱码一卡2卡4卡精品| av天堂中文字幕网| 十八禁网站免费在线| 麻豆国产av国片精品| 日韩大尺度精品在线看网址| av天堂在线播放| 淫秽高清视频在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 99精品在免费线老司机午夜| av天堂在线播放| 日韩欧美免费精品| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产一级毛片七仙女欲春2| 亚洲av免费在线观看| 久久性视频一级片| 麻豆一二三区av精品| 国产精品影院久久| 欧美zozozo另类| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国内揄拍国产精品人妻在线| 免费观看的影片在线观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲av免费在线观看| 最近在线观看免费完整版| 观看免费一级毛片| 中文字幕av在线有码专区| 国产伦在线观看视频一区| 国产精华一区二区三区| 亚洲国产精品成人综合色| 日韩人妻高清精品专区| 成人三级黄色视频| 97碰自拍视频| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲,欧美精品.| 露出奶头的视频| 亚洲最大成人手机在线| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产精品久久电影中文字幕| 人人妻人人看人人澡| 又紧又爽又黄一区二区| 久久久久亚洲av毛片大全| 国内揄拍国产精品人妻在线| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 性插视频无遮挡在线免费观看| xxxwww97欧美| av在线老鸭窝| 国产伦一二天堂av在线观看| 在线观看一区二区三区| 亚洲av免费高清在线观看| 免费观看精品视频网站| 日韩欧美国产一区二区入口| 91久久精品国产一区二区成人| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产高清视频在线观看网站| 欧美色欧美亚洲另类二区| 久久久久久久久久成人| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 日韩高清综合在线| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产av在哪里看| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产精品永久免费网站| 此物有八面人人有两片| 最近中文字幕高清免费大全6 | 日本一本二区三区精品| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 欧美中文日本在线观看视频| 免费av不卡在线播放| 99热只有精品国产| 国产视频内射| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 听说在线观看完整版免费高清| 91麻豆av在线| 一区二区三区激情视频| 乱人视频在线观看| 午夜久久久久精精品| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 成年人黄色毛片网站| 看片在线看免费视频| 精品人妻偷拍中文字幕| 高清日韩中文字幕在线| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 久久久成人免费电影| 又爽又黄a免费视频| 国产综合懂色| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 1000部很黄的大片| 88av欧美| 午夜福利视频1000在线观看| 日本在线视频免费播放| 99国产精品一区二区三区| 日本五十路高清| 亚洲无线在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲男人的天堂狠狠| 中文字幕av在线有码专区| 亚洲第一区二区三区不卡| 大型黄色视频在线免费观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 老司机午夜十八禁免费视频| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲在线观看片| 亚洲午夜理论影院| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 一个人看的www免费观看视频| 一级a爱片免费观看的视频| 十八禁网站免费在线| 免费观看的影片在线观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 亚洲电影在线观看av| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产精品爽爽va在线观看网站| 一本一本综合久久| 亚洲不卡免费看| 国产精品99久久久久久久久| 91字幕亚洲| 亚洲av免费在线观看| 97热精品久久久久久| 久久久国产成人精品二区| 午夜日韩欧美国产| 精品一区二区三区人妻视频| 日韩欧美三级三区| 亚洲精品久久国产高清桃花| 精品日产1卡2卡| 日韩国内少妇激情av| 亚洲专区中文字幕在线| 十八禁网站免费在线| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产精品久久久久久久久免 | 色综合婷婷激情| 99久久九九国产精品国产免费| 日韩人妻高清精品专区| 婷婷色综合大香蕉| 舔av片在线| 亚洲国产色片| 内地一区二区视频在线| 亚洲欧美日韩东京热| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲国产精品999在线| 男女之事视频高清在线观看| 日本黄色片子视频| av在线老鸭窝| 免费一级毛片在线播放高清视频| 日本熟妇午夜| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲综合色惰| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 日本黄色片子视频| 在线观看舔阴道视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 亚洲av美国av| 欧美zozozo另类| 成年免费大片在线观看| 麻豆一二三区av精品| 中文字幕av成人在线电影| 天堂动漫精品| 在线免费观看不下载黄p国产 | 亚洲三级黄色毛片| 欧美最新免费一区二区三区 | 少妇裸体淫交视频免费看高清| 日韩欧美精品免费久久 | 国产私拍福利视频在线观看| a级毛片a级免费在线| 99国产精品一区二区蜜桃av| 老司机午夜十八禁免费视频| 日日夜夜操网爽| 三级国产精品欧美在线观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 成年人黄色毛片网站| 亚洲不卡免费看| 国产熟女xx| 大型黄色视频在线免费观看| 久久中文看片网| 久久久久久大精品| 久久久久九九精品影院| 国产v大片淫在线免费观看| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲美女视频黄频| 最近中文字幕高清免费大全6 | 嫩草影院新地址| 国产成人啪精品午夜网站| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 在线观看美女被高潮喷水网站 | 一本综合久久免费| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲欧美日韩无卡精品| 两人在一起打扑克的视频| 中文资源天堂在线| 国产不卡一卡二| 国产精华一区二区三区| 国产激情偷乱视频一区二区| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲av一区综合| 美女高潮的动态| 欧美+日韩+精品| 亚洲精品成人久久久久久| 一本久久中文字幕| 级片在线观看| 不卡一级毛片| 床上黄色一级片| 国产视频内射| 伊人久久精品亚洲午夜| 一级a爱片免费观看的视频| 嫩草影院入口| 十八禁国产超污无遮挡网站| h日本视频在线播放| av欧美777| 69av精品久久久久久| 婷婷丁香在线五月| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 色在线成人网| 最近中文字幕高清免费大全6 | 色播亚洲综合网| 男人狂女人下面高潮的视频| 免费看光身美女| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 免费人成视频x8x8入口观看| 精品日产1卡2卡| 女同久久另类99精品国产91| 精品午夜福利在线看| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 精品国内亚洲2022精品成人| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产在视频线在精品| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 校园春色视频在线观看| 久久久久九九精品影院| 亚洲av不卡在线观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 欧美区成人在线视频| 欧美午夜高清在线| 好男人在线观看高清免费视频| 午夜精品一区二区三区免费看| 91久久精品电影网| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 两人在一起打扑克的视频| 成人国产综合亚洲| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲欧美清纯卡通| 麻豆一二三区av精品| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 日本a在线网址| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产精品久久久久久久电影| 色哟哟·www| 如何舔出高潮| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | 日韩欧美精品v在线| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲五月天丁香| 国产探花极品一区二区| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 天堂动漫精品| 国产色婷婷99| 日本精品一区二区三区蜜桃| 真实男女啪啪啪动态图| 国产精品一及| 亚洲不卡免费看| 色噜噜av男人的天堂激情| 首页视频小说图片口味搜索| av在线观看视频网站免费| 一个人观看的视频www高清免费观看| 久久久国产成人免费| 丝袜美腿在线中文| 九色国产91popny在线| 国产高潮美女av| 最近视频中文字幕2019在线8| 性欧美人与动物交配| 国产精品国产高清国产av| 国产精品一区二区三区四区久久| 精品人妻熟女av久视频| 国产免费男女视频| 黄片小视频在线播放| 免费在线观看亚洲国产| 黄色一级大片看看| 日韩欧美三级三区| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲电影在线观看av| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | 亚洲美女黄片视频| 嫁个100分男人电影在线观看| netflix在线观看网站| 香蕉av资源在线| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲精品在线美女| 一个人免费在线观看电影| 99热这里只有是精品在线观看 | 在线播放无遮挡| 国产爱豆传媒在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清| av国产免费在线观看| 亚洲国产色片| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 色综合站精品国产| 国产精品永久免费网站| 欧美又色又爽又黄视频| 最后的刺客免费高清国语| 中文资源天堂在线| 88av欧美| 成熟少妇高潮喷水视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 成人午夜高清在线视频| 免费观看精品视频网站| 少妇丰满av| 无人区码免费观看不卡| 亚洲电影在线观看av| 69av精品久久久久久| 18+在线观看网站| 精品午夜福利在线看| 亚洲人与动物交配视频| 日韩精品青青久久久久久| 欧美xxxx性猛交bbbb| 欧美又色又爽又黄视频| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲美女视频黄频| 男女那种视频在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 看片在线看免费视频| or卡值多少钱| 欧美精品啪啪一区二区三区| 一区二区三区免费毛片| 欧美三级亚洲精品| 国产成人aa在线观看| 久久精品人妻少妇| 桃色一区二区三区在线观看| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲精品色激情综合| 99热这里只有是精品50| 丰满的人妻完整版| 成人美女网站在线观看视频| 成人特级av手机在线观看| 91在线观看av| 嫩草影院新地址| 伦理电影大哥的女人| 日本 欧美在线| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 日本一二三区视频观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 少妇人妻精品综合一区二区 | 男人和女人高潮做爰伦理| 国产高潮美女av| 99热6这里只有精品| 亚洲乱码一区二区免费版| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲在线观看片| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产午夜精品论理片| 岛国在线免费视频观看| 在线a可以看的网站| 免费观看的影片在线观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 很黄的视频免费| 成人三级黄色视频| 又爽又黄a免费视频| 国产精品一区二区三区四区久久| 看片在线看免费视频| 有码 亚洲区| 91九色精品人成在线观看| 两个人视频免费观看高清| av天堂中文字幕网| 亚洲国产色片| 精品久久久久久,| 国产成人啪精品午夜网站| 国产精品,欧美在线| 国产色婷婷99| 深爱激情五月婷婷| av福利片在线观看| 成人性生交大片免费视频hd| 亚洲自拍偷在线| 亚洲av电影不卡..在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲中文日韩欧美视频| 岛国在线免费视频观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 无人区码免费观看不卡| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲在线自拍视频| 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲成av人片免费观看| av在线观看视频网站免费| 校园春色视频在线观看| 精品午夜福利在线看| 99热只有精品国产| 日韩大尺度精品在线看网址| 免费看美女性在线毛片视频| 又紧又爽又黄一区二区| 欧美xxxx性猛交bbbb| 最近中文字幕高清免费大全6 | 国产三级中文精品| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 美女黄网站色视频| 欧美高清成人免费视频www| 日本免费a在线| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 成年人黄色毛片网站| 久久久久亚洲av毛片大全| 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久亚洲精品不卡| 欧美另类亚洲清纯唯美| 男女下面进入的视频免费午夜| 内地一区二区视频在线| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产精品久久久久久久久免 | 亚洲欧美日韩卡通动漫| 欧美激情国产日韩精品一区| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | 99国产综合亚洲精品| 国产精品人妻久久久久久| 欧美一区二区国产精品久久精品| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲av美国av| 十八禁国产超污无遮挡网站| 国产精品免费一区二区三区在线| av黄色大香蕉| 丰满的人妻完整版| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产高清激情床上av| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 欧美bdsm另类| 国产成人啪精品午夜网站| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产精品日韩av在线免费观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 国产aⅴ精品一区二区三区波| 九九热线精品视视频播放| 亚洲色图av天堂| 国产真实乱freesex| 91av网一区二区| 国产aⅴ精品一区二区三区波| a级毛片a级免费在线| 国产黄片美女视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 美女免费视频网站| 国产高清三级在线| 我要搜黄色片| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 亚洲成人免费电影在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 久久亚洲精品不卡| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲黑人精品在线| 国产精品综合久久久久久久免费| 校园春色视频在线观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 又黄又爽又免费观看的视频| a在线观看视频网站| 永久网站在线| 毛片女人毛片| 国产精品一区二区性色av| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲电影在线观看av| 国产亚洲精品久久久com| 欧美三级亚洲精品| 久久午夜亚洲精品久久| 国内精品美女久久久久久| 日韩亚洲欧美综合| 久久热精品热| 免费在线观看亚洲国产| 精品人妻视频免费看| 欧美成人免费av一区二区三区| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 亚洲片人在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 国产成人啪精品午夜网站| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 久久久久免费精品人妻一区二区| 男女之事视频高清在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看| 久久6这里有精品| 日韩欧美 国产精品| 亚洲人成网站在线播| 精品久久久久久久久av| 99久久九九国产精品国产免费| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 在线国产一区二区在线| 午夜老司机福利剧场| 亚洲成人精品中文字幕电影| 男女那种视频在线观看| 国产高清有码在线观看视频| 午夜两性在线视频| 性欧美人与动物交配| 久久精品影院6| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 精品无人区乱码1区二区| 丰满的人妻完整版| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲欧美日韩高清专用| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 波多野结衣巨乳人妻| 性色avwww在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 嫩草影院入口| 免费看a级黄色片| 淫妇啪啪啪对白视频| 99国产精品一区二区蜜桃av| 日本免费一区二区三区高清不卡| av黄色大香蕉| 天美传媒精品一区二区| 悠悠久久av| 欧美国产日韩亚洲一区| 免费大片18禁| 色哟哟哟哟哟哟| 中文字幕免费在线视频6| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 精品不卡国产一区二区三区| 美女高潮的动态| 少妇的逼好多水| 在线a可以看的网站| 国产成人欧美在线观看| 哪里可以看免费的av片| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲一区高清亚洲精品| 有码 亚洲区| 99视频精品全部免费 在线| 老司机午夜福利在线观看视频| 一级黄色大片毛片| 欧美中文日本在线观看视频| 国产三级黄色录像| 久久香蕉精品热| 极品教师在线视频| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 午夜两性在线视频| 午夜福利成人在线免费观看| 成人特级av手机在线观看| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 亚洲人成网站在线播| 欧美性感艳星| 国产高清视频在线播放一区| 午夜久久久久精精品| 欧美成人性av电影在线观看| 99riav亚洲国产免费| 精品人妻视频免费看|