白楊素對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌Bax和Bcl-2表達的影響

羅斌 田芳芳 田俊斌 呂俊林 馬磊 呂建瑞

摘要 目的：研究白楊素對心肌缺血再灌注損傷（MI/RI）大鼠的作用，同時觀察其對心肌凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達的影響。方法：SPF級SD大鼠60只適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，按體質(zhì)量大小依次分為假手術(shù)組、模型組、陽性藥物雷米普利組、白楊素低、中和高劑量組，每組10例，療程2周，后采用可逆左冠狀動脈前降支結(jié)扎法建立MI/RI模型，假手術(shù)組只穿線但不結(jié)扎。手術(shù)后收集血液檢測血清肌酸激酶同功酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）、白細胞介素（Interleukin，IL）-6、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量，TTC法評估心肌梗死面積，HE染色觀察心肌病理學(xué)，Western Blot檢測心肌Bax和Bcl-2蛋白表達特點。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組心肌梗死面積明顯增加（P<0.05），心肌纖維斷裂，與模型組比較，白楊素3個劑量組和雷米普利組心肌梗死面積降低（P<0.05），心肌細胞形態(tài)改善;與假手術(shù)組比較，模型組血清CK-MB、LDH、IL-6和MDA增加（P<0.05），SOD降低（P<0.05），與模型組比較，白楊素3個劑量組和雷米普利組CK-MB、LDH、IL-6和MDA降低（P<0.05），SOD升高（P<0.05）;與假手術(shù)組比較，模型組心肌Bax蛋白表達明顯增加（P<0.05），Bcl-2表達降低（P<0.05），與模型組比較，白楊素3個劑量組和雷米普利組Bax蛋白表達降低（P<0.05），Bcl-2上調(diào)（P<0.05）。結(jié)論：白楊素對MI/RI大鼠血清心肌酶CK-MB和LDH，炎性因子IL-6，氧化和抗氧化指標MDA和SOD均有調(diào)節(jié)作用，同時可降低心肌梗死面積，其作用機制可能與白楊素能夠調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞 白楊素;大鼠;心肌缺血再灌注;心肌細胞;凋亡

Effect of Chrysin on Bax and Bcl-2 in Rats with Myocardial Ischemia Reperfusion Injury

Luo Bin1，Tian Fangfang2，Tian Junbin1，LYU Junlin1，MA Lei1，LYU Jianrui1

（1 The Second Affiliated Hospital of Xi′an Jiaotong University，Xi′an 710004，China; 2 Department of Anesthesiology，Tangdu Hospital，Second Affiliated Air Force Military Medical University，Xi′an 710038，China）

Abstract Objective：To study the therapeutic effects of chrysin on MI/RI rats，and to observe the proteins expression of Bax and Bcl-2.Methods：According to weight，A total of 60 SD rats after adaptive feeding for 2 weeks were divided into a sham operation group，a model group，a positive drug ramipril group，chrysin low，medium and high dose groups，n=10.The course of treatment was 2 weeks.Later，the MI/RI model was established by reversible left anterior descending coronary artery ligation.The sham operation group only threaded but not ligated.Later，the MI/RI model was established by reversible left anterior descending coronary artery ligation.The sham operation group only threaded but not ligated.After the operation，blood was collected for serum creatine kinase isoenzyme（CK-MB），lactate dehydrogenase（LDH），interleukin（IL）-6，superoxide dismutase（SOD）and malondialdehyde（MDA）content.TTC method was used to evaluate myocardial infarction area，HE staining was used to observe myocardial pathology.Western Blot was used to detect myocardial Bax and Bcl-2 protein expression characteristics.Results：Compared with the sham group，the infarct size in the model group was increased（P<0.05），the myocardial fibers were broken，compared with the model group，the myocardial infarct size was improved in the 3 dose groups of Chrysin and Ramipril group（P<0.05）.Cardiomyocyte morphology improved; compared with the sham group，serum CK-MB，LDH，IL-6 and MDA increased in the model group（P<0.05），SOD decreased（P<0.05）.com

pared with the model group，CK-MB，LDH，IL-6 and MDA in the 3 doses of chrysin and ramipril group decreased（P<0.05），and SOD decreased（P<0.05）; Compared with the sham operation group，the expression of Bax protein in the myocardium of the model group was significantly increased（P<0.05），and the expression of Bcl-2 was decreased（P<0.05）.com

pared with the model group，the three-dose group of chrysin and expression Bax protein in Puri group was reduced（P<0.05），and Bcl-2 was up-regulated（P<0.05）.Conclusion：Chrysin has a regulatory effect on serum myocardial enzymes CK-MB and LDH，inflammatory factor IL-6，oxidation and antioxidant indicators MDA and SOD in MI/RI rats，and can reduce the area of myocardial infarction.Its mechanism of action may be related to that of chrysin regulating Bcl-2 and Bax protein expression.

Keywords Chrysin; Rat; Myocardial ischemia-reperfusion injury（MI/RI）; Cardiomyocyte; Apoptosis

中圖分類號：R242;R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.01.014

心肌缺血再灌注損傷（Myocardial Ischemia-reperfusion Injury，MI/RI）是冠心病死亡的主要原因，患者突發(fā)急性心肌梗死后，可誘發(fā)心肌細胞大量死亡，進而誘發(fā)心肌細胞增生、凋亡以及膠原疤痕等一系列病理反應(yīng)[1]。一般而言，在早期心肌重塑過程中心臟有一定能力能夠維持自身結(jié)構(gòu)完整和心功能正常，但患者發(fā)生持續(xù)性心肌梗死后會導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)改變和心功能異常，這也是導(dǎo)致患者死亡的根本因素[2-3]。目前在臨床中并沒有特效藥物可抑制或逆轉(zhuǎn)心肌結(jié)構(gòu)重塑，因此延緩心肌重塑是當前研究熱點[4]。白楊素是黃酮類化合物的一種，其在蜂膠中含量較高，近年來研究發(fā)現(xiàn)，白楊素具有多種藥理活性，具有抗病毒、殺菌、抗癌、消炎等多種功效[5-6]，關(guān)于其對心肌保護也有研究報道，如肖慧玉等[7]采用白楊素治療機械性創(chuàng)傷（MT）繼發(fā)性心肌損傷大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白楊素對其具有明顯的保護作用，此外還有研究觀察了白楊素對早期糖尿病大鼠心肌損傷的保護作用[8]。但在總結(jié)文獻時發(fā)現(xiàn)，目前的研究還沒有白楊素對MI/RI的相關(guān)研究報道，為此本研究采用經(jīng)典造模法成功復(fù)制MI/RI大鼠模型，從細胞凋亡途徑蛋白Bax和Bcl-2觀察其對心肌細胞是否有保護作用，以為MI/RI的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性健康SPF級SD大鼠60只，體質(zhì)量180～220 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供（合格證號：SCXK（陜）2014-002），大鼠在購買后飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，飼養(yǎng)條件為每籠10只，溫度21～26 ℃，濕度40%～60%，每天照明時間12 h。大鼠均有專業(yè)人員負責飼養(yǎng)，日常自由進食和飲水。

1.1.2 藥物 白楊素（上海純優(yōu)生物科技有限公司，批號：180724），雷米普利（昆山龍燈瑞迪制藥有限公司，批號：180716）。

1.1.3 試劑與儀器 血清肌酸激酶同功酶（Creatine Kinase Isoenzymes，CK-MB）、乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）和白細胞介素（Interleukin，IL）-6試劑盒（武漢博士德生物科技公司，貨號：CSB-E14403r，CSB-E11324r，CSB-E04640r），超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）試劑盒（南京建成生工工程研究所，貨號：A001-3-2，A003-1-2），Bcl-2、Bax和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase，GAPDH）抗體（Abcam公司，美國，貨號：EPR17509，E63，6C5），偏氟乙烯[Poly（Vinylidene Fluoride），PVDF]（邁博瑞生物膜技術(shù)有限公司，貨號：IPVH00010），總蛋白提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號：BC3711），BCA蛋白定量試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司，貨號：C503021）。

高速冷凍離心機（湖南邁克爾實驗儀器有限公司，型號：DL-6MB型），酶標儀（海酶聯(lián)生物科技有限公司，型號：ML-dr3518G型），分光光度計（冠森生物科技上海公司，型號：723型），切片機（徠卡生物，德國，型號：RM2235型），超低溫冰箱（青島海爾，型號：DW-86L388型），蛋白電泳系統(tǒng)（伯樂公司，美國，型號：Y.Mini-PROTEAN Tetra型）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 所有大鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后按照體質(zhì)量大小依次分組，分為假手術(shù)組、模型組、陽性藥物雷米普利組、白楊素低劑量觀察組、白楊素中劑量觀察組和白楊素高劑量組，每組10只。

心肌缺血再灌注損傷（Myocardial Ischemia-reperfusion Injury，MI/RI）模型構(gòu)建參照文獻[9]進行，采用戊巴比妥鈉麻醉后將其固定于解剖版，連接呼吸機，設(shè)定呼吸頻率為80次/min、潮氣量為15 mL/kg、呼吸比為1∶1，碘伏消毒后找到左側(cè)胸壁第3～4肋骨，切開后暴露心臟，剝離心包膜后于左心耳下緣2～3 mm處結(jié)扎，后進行常規(guī)缺血再灌注損傷手術(shù)，假手術(shù)組只給予穿線但不結(jié)扎。造模成功的標志為心尖顏色發(fā)白，同時心電圖有明顯ST段抬高。

1.2.2 給藥方法 假手術(shù)組給予1.0 mL/kg生理鹽水胃治療，模型組給予1.0 mL/kg生理鹽水胃治療，陽性藥物雷米普利組給予1.0 mg/kg雷米普利灌胃治療，白楊素低劑量觀察組給予10 mg/kg白楊素灌胃治療，白楊素中劑量觀察組給予20 mg/kg白楊素灌胃治療，白楊素高劑量組給予40 mg/kg白楊素灌胃治療，連續(xù)給藥2周后進行后續(xù)實驗。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 標本采集 腹主動脈取血法收集大鼠血液（約2 mL左右），血液取出后4 000 r/min離心，離心半徑4 cm，10 min后提取血清，血清收集后置入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。取出心臟組織，將其橫切成3部分，其中一部分置于超低溫冰箱中保存?zhèn)溆茫徊糠种劣诮M織固定液中用于相關(guān)病理學(xué)的檢測，另一部分用于測定心肌梗死面積。

1.2.3.2 心肌梗死面積的測定 將心肌組織凍干后切成1 mm左右的薄片，置入1%的TTC溶液中，37 ℃條件下避光孵育15 min，后比較分析梗死面積（正常區(qū)為紅色，梗死區(qū)為灰白色）。梗死面積為梗死區(qū)總面積/缺血區(qū)總面積×100%。

1.2.3.3 生化指標的測定 采用酶標儀測定血清CK-MB、CK-MB、IL-6和SOD，采用分光光度計測定MDA，測定時按照試劑盒提供的說明書進行。

1.2.3.4 形態(tài)學(xué)觀察 從組織固定液中取出心肌組織，將其按照文獻[10]報道，自來水過夜沖洗后常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精伊紅染色，后采用帶有照相功能的光學(xué)顯微鏡采集圖像即可。

1.2.3.5 蛋白表達的檢測 取出肝臟組織，按照試劑盒提供的說明書提取總蛋白，蛋白提取后BCA法對其定量并調(diào)平，然后每組各取50 μg行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳完成后轉(zhuǎn)移至甲醇活化后的PVDF膜，后依次經(jīng)5%的脫脂牛奶封閉、一抗過夜孵育（Bcl-2抗體濃度為1∶3 000、Bax為1∶3 000，GAPDH為1∶5 000），二抗孵育（1∶5 000）、ECL滴加后凝膠成像系統(tǒng)收集圖像即可即可。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，其中計數(shù)資料以（%）表示，采用χ2檢驗，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌組織梗死面積比較 與假手術(shù)組比較，模型組心肌梗死面積明顯增加（P<0.05），與模型組比較，白楊素3個劑量組和雷米普利組心肌梗死面積明顯降低（P<0.05），其中白楊素高劑量組基本和雷米普利組相一致。見圖1。

2.2 CK-MB和LDH比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中CK-MB和LDH明顯升高（P<0.05），與模型組比較，白楊素3個劑量組和雷米普利組明顯降低（P<0.05），此外白楊素高劑量組和雷米普利組沒有差異。見表1。

2.3 血清IL-6、SOD和MDA濃度 與假手術(shù)組比較，模型組血清IL-6和MDA均明顯升高（P<0.05），SOD明顯降低（P<0.05），與模型組比較，白楊素3個劑量組和雷米普利組IL-6和MDA明顯降低（P<0.05），SOD明顯升高（P<0.05），此外白楊素3個劑量組和雷米普利組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

2.4 病理學(xué)結(jié)果 假手術(shù)組心肌纖維排列整齊，纖維無斷裂，模型組則出現(xiàn)典型的心肌纖維斷裂和水腫，與模型組比較，白楊素3個劑量組和雷米普利組均有明顯改善。見圖2。

2.5 Bcl-2與Bax蛋白表達水平 與假手術(shù)組比較，模型組心肌組織中Bax蛋白表達明顯升高（P<0.05），而Bcl-2則明顯降低（P<0.05），與模型組比較，白楊素3個劑量組和雷米普利組Bax均明顯降低（P<0.05），Bcl-2表達明顯升高（P<0.05），但白楊素3個劑量組和雷米普利組各組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3。

3 討論

近年來通過藥物干預(yù)再灌注給心肌帶來的損傷是國內(nèi)外研究熱點[11]。本研究采用經(jīng)典造模法構(gòu)建MI/RI大鼠模型，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清CK-MB和LDH明顯升高，這提示所構(gòu)建的MI/RI大鼠具有明顯心肌酶譜表達異常，同時心肌組織病理學(xué)可見，與假手術(shù)組比較，模型組心肌有明顯心肌纖維斷裂，此外，與假手術(shù)組比較，模型組心肌梗死面積增加，這提示本研究所構(gòu)建的MI/RI大鼠有明顯心肌損害。

楊梅素在蜂膠中含量較高，是蜂膠總黃酮的主要成分。近年來關(guān)于蜂膠總黃酮在MI/RI中有大量研究，如早在2005年，國內(nèi)學(xué)者楊明等[12]研究顯示蜂膠總黃酮對心肌缺血再灌注損傷具有明顯的保護作用，此外隋殿軍等[13]也進行了相似的研究。但蜂膠總黃酮的成分較多，包括金合歡素、毛地黃黃酮、黃良姜精、蘭肉桂酸、阿魏酸、白楊素、橙皮甙、槲皮素、柑桔黃素、蘆丁等[14-15]，因此研究其不同成分的主要作用，對蜂膠的藥理價值開發(fā)具有積極的意義，為此本次研究選取了白楊素，以觀察其對MI/RI是否有調(diào)節(jié)作用，并從細胞凋亡途徑研究其作用機制。

目前的研究顯示，參與心肌細胞凋亡的主要基因有Bc1-2、p21、p53及caspase家族蛋白等[16-19]。本次研究重點研究Bcl-2家族基因，在Bcl-2家族基因中，Bc1-2主要功能為抑制細胞凋亡，Bax為促進細胞凋亡，二者協(xié)同作用，通過控制其含量高低以控制細胞是否凋亡[20]。本研究發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織Bax蛋白表達升高，Bcl-2表達明顯降低，白楊素和雷米普利組治療后，Bax表達均降低，Bcl-2表達升高，這提示白楊素對MI/RI大鼠心肌細胞凋亡有明顯的抑制作用。

4 結(jié)論

綜上所述，本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白楊素對心肌缺血再灌注損傷具有明顯的治療作用，其可以改善MI/RI大鼠心肌酶譜，降低炎性反應(yīng)，提高抗氧化能力，這與其可降低Bax蛋白表達，同時升高Bcl-2蛋白表達有關(guān)。

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（2020-01-22收稿 責任編輯：徐穎）

基金項目：陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃課題（2018JM7087）

作者簡介：羅斌（1984.07—），男，碩士研究生，住院醫(yī)師，研究方向：心腦缺血再灌注損傷與保護研究，E-mail：robinlb03@163.com

通信作者：呂建瑞（1968.12—），男，本科，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：心腦缺血再灌注損傷與保護，E-mail：ljr2011@139.com