不同施肥處理對當歸藥材質(zhì)量的影響

彭桐 王引權(quán) 李欽 荔淑楠 魏麗娟 黨昇榮

摘要：以不施肥為對照，探究單施有機肥、施用生物有機肥加復(fù)合肥、單施復(fù)合肥，研究不同施肥處理對當歸藥材質(zhì)量的影響，為當歸栽培的合理施肥提供理論依據(jù)。參照2020年版《中華人民共和國藥典》中四部方法測定當歸水分、總灰分、酸不溶性灰分和醇溶性浸出物含量，采用甲苯法測定當歸中多糖含量;采用高效液相色譜法（HPLC）測定當歸中阿魏酸、阿魏酸松柏酯、洋川芎內(nèi)酯I等7種化學成分的含量。結(jié)果表明，單施有機肥可顯著降低當歸藥材的水分含量，提高浸出物含量;生物有機肥+復(fù)合肥處理可降低總灰分和酸不溶性灰分含量并提高浸出物含量;4種施肥處理之間當歸多糖含量并無顯著性差異;根據(jù)主成分分析結(jié)果，單施復(fù)合肥和單施有機肥可促進當歸中7種主要藥效成分含量的提高。綜合來看，本研究中當歸的最佳施肥條件為單施有機肥4 797.6 kg/hm2。

關(guān)鍵詞：施肥;當歸;質(zhì)量;HPLC;主成分分析

中圖分類號： S567.23+9.06 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）10-0126-06

當歸為傘形科植物當歸[Angelica sinensis （Oliv.） Diels.]的干燥根，有補血活血，調(diào)經(jīng)止痛和潤腸通便的功效[1]。目前臨床上使用的當歸藥材多為栽培品，甘肅省定西市岷縣、漳縣、隴南市宕昌縣等地為當歸藥材的道地產(chǎn)區(qū)[2]，占全國市場流通量的70% 以上[3]。目前，在當歸種植過程中由于連作和大量施用化肥，造成土壤板結(jié)、土壤質(zhì)量下降，土壤特性不穩(wěn)定等問題，從而影響了當歸品質(zhì)。有研究證實恰當施肥不僅能促進當歸的生長發(fā)育，提高藥材產(chǎn)量，還可改善藥材品質(zhì)[4]。鑒于此，筆者所在課題組研究設(shè)計了單施有機肥、單施復(fù)合肥、有機肥與復(fù)合肥配施3種施肥方式，以不施肥為對照，對當歸藥材的質(zhì)量影響進行試驗研究。本研究以當歸藥材中當歸多糖的含量和有機酚酸類（阿魏酸、阿魏酸松柏酯）跟苯酞類（洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯、歐當歸內(nèi)酯）7種化學成分的含量[5-6]作為評價指標。同時結(jié)合當歸的水分、總灰分、酸不溶性灰分和醇溶性浸出物的含量對當歸藥材質(zhì)量進行綜合分析比較，為確定最佳施肥方案提供科學依據(jù)。以期為當歸的生態(tài)化種植及質(zhì)量控制提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

本試驗于2019年4—11月在甘肅省定西市岷縣蒲麻鎮(zhèn)包家溝村進行，海拔約2 600 m，二陰區(qū)坡地，地塊較平坦，前茬為燕麥。試驗地于4月中旬移栽當歸前翻地。翻地后，搶墑覆膜，膜寬0.6 m，壟間距30 cm。并按地塊條件劃定小區(qū)。

1.2 試驗樣品

供試當歸種苗選用2018年合作社繁育的當歸苗，移栽時按DB62/T 2549―2014《中藥材種苗 當歸》標準挑選一級苗（莖粗3～5 mm，試驗隨機取10株當歸苗進行苗長、苗鮮質(zhì)量、莖基直徑、分叉數(shù)測定）。挑選好的當歸苗用甘肅省科學院開發(fā)的微生物菌劑浸苗15 min，晾干種苗表皮水分后移栽。供試肥料信息見表1。

1.3 儀器及試劑

高效液相色譜儀（型號：Agilent1200，美國安捷倫公司）;電子分析天平（型號：BT125D，賽多利斯科學儀器北京有限公司）;超純水系統(tǒng)（型號：Smart-N15VF，上海力康醫(yī)療設(shè)備有限公司）。

乙腈（天津市大茂化學試劑廠，批號20180618，色譜純），甲醇（天津市大茂化學試劑廠，批號20160307，色譜純），冰乙酸（天津市大茂化學試劑廠，批號20170205，色譜純）。對照品溶液均購于上海源葉生物科技有限公司，具體有阿魏酸對照品（批號H27J7L16718）、洋川芎內(nèi)酯I對照品（批號P02F9F54166）、洋川芎內(nèi)酯H對照品（批號P02F9F54165）、洋川芎內(nèi)酯A對照品（批號P23A9F68613）、正丁基苯酞對照品（批號S09J9D65229）、Z型藁本內(nèi)酯對照品（批號Y17S9L70462）、歐當歸內(nèi)酯對照品（批號P24A9S68617）、阿魏酸松柏酯對照品（批號Z24D9B78131）。

1.4 試驗設(shè)計

試驗采用單因素隨機區(qū)組設(shè)計，3次重復(fù)，每小區(qū)面積為2.4 m×12.5 m=30 m2?？傉嫉?00 m2。試驗共設(shè)4個處理，處理1：單施有機肥4 797.6 kg/hm2;處理2：生物有機肥1 799.1 kg/hm2+復(fù)合肥 1 199.4 kg/hm2;處理3：單施復(fù)合肥7 496.3 kg/hm2;處理4：不施肥（CK）。各處理小區(qū)均在播種前施肥，生育期間不施肥。

1.5 試驗方法

1.5.1 常規(guī)指標測定方法 參照2020年版《中華人民共和國藥典》四部方法中的通則0832第四法測定當歸藥材水分、通則2302測定總灰分和酸不溶性灰分含量和通則2201測定醇溶性浸出物含量。

1.5.2 多糖含量的測定 （1）對照品儲備液的制備。將葡萄糖對照品于105 ℃下烘干至完全失去水分，精密稱取干燥恒質(zhì)量后的葡萄糖對照品5.3 mg放入50 mL容量瓶中，加水搖勻定容，得葡萄糖對照品儲備液。（2）供試品溶液的制備。稱取過60目篩后的當歸樣品粉末約1 g，加入80%乙醇 100 mL 后加熱回流1 h，過濾得濾渣加100 mL蒸餾水加熱回流2 h，濾液濃縮后加80%乙醇沉淀，靜置過夜后離心，沉淀用溫水溶解后定容至100 mL容量瓶，精密量取上述溶液1 mL定容于25 mL量瓶中得供試品溶液。于干燥具塞試管中，依次加入供試品溶液1.0 mL，1.0 mL蒸餾水，2.0 mL 5%苯酚溶液，7.0 mL 濃硫酸，混勻后沸水浴加熱20 min進行顯色。顯色后的溶液需自來水水浴冷卻5 min后再測定其吸光度。

1.5.3 高效液相色譜法（HPLC）測定當歸中7種化學成分的含量 （1）色譜條件。Merk RP-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為1%乙酸（A）：乙腈（B），梯度洗脫：（0～20 min，19%B;20～60 min，19%～95%B;60～75 min，95%～100%B）;檢測波長260、280、300 nm;流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃;進樣量 20 μL。在該色譜條件下，選擇波長為280 nm時色譜峰峰形與分離度良好。（2）對照品溶液的制備。精密稱取阿魏酸對照品0.006 45 g，阿魏酸松柏酯0.003 01 g，洋川芎內(nèi)酯I 0.000 75 g，洋川芎內(nèi)酯H 0.000 72 g，洋川芎內(nèi)酯A 0.004 23 g，歐當歸內(nèi)酯0.000 96 g，分別加甲醇定容于5 mL容量瓶中作儲備液，稱取藁本內(nèi)酯0.005 43 mg，定容至加甲醇 1 mL 容量瓶內(nèi)，作為儲備液。精密移取洋川芎內(nèi)酯H儲備液0.3 mL，歐當歸內(nèi)酯0.2 mL，藁本內(nèi)酯儲備液1 mL，其余各儲備液分別移取 0.5 mL 于同一容量瓶，定容至5 mL容量瓶內(nèi)得混合對照品溶液，對照品溶液在注入液相色譜儀前需經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾。繪制標準曲線，見圖1。（3）供試品溶液的制備。精密稱取過2號篩后的當歸藥材粉末0.500 g于150 mL錐形瓶中，加入70%甲醇 20 mL 后稱質(zhì)量，將錐形瓶口密封后置于超聲儀器內(nèi)，在220 W，80 Hz條件下超聲40 min，取出后冷卻并稱質(zhì)量，70%甲醇補足質(zhì)量，抽取混勻溶液后用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得到供試品溶液。供試品溶液需在4 ℃冰箱內(nèi)儲藏。

1.6 統(tǒng)計方法

使用 Excel 2013 軟件進行數(shù)據(jù)的初步換算和處理，試驗數(shù)據(jù)采用 SPSS 21. 0軟件進行主成分分析、顯著性檢驗（P<0. 05）和Duncans多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥處理的當歸藥材水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物含量測定分析

從表2可以看出，各施肥處理下當歸藥材的水分均小于15.0%，總灰分含量小于7.0%，酸不溶性灰分含量小于2.0%，浸出物含量均超過45.0%，均達到2020年版《中華人民共和國藥典》標準。單施有機肥可顯著降低藥材水分含量，提高浸出物含量，該處理下藥材總灰分和酸不溶性灰分含量較高。生物有機肥+復(fù)合肥處理下與不施肥相比，總灰分和酸不溶性灰分含量分別降低了9.47%、35.46%。

2.2 多糖含量測定分析

2.2.1 標準曲線的制備 移取葡萄糖對照品儲備液0.2、0.4、0.6、0.7、0.8 mL，分別置于10 mL試管中進行顯色，待冷卻后在490 nm下測定其吸光度[7]，以空白溶液為對照。以吸光度（Y）對葡萄糖溶液濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程Y=68.461X+0.025 3（R2=0.9994），線性范圍為2.12～8.48 mg/L。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗 按“1.5.2”節(jié)供試品溶液的制備方法制備處理1當歸樣品進行顯色后，分別在 0、10、20、30、40、50、60 min測定吸光度，測定結(jié)果RSD為3.1%，說明供試品溶液在1 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.3 重復(fù)性試驗 取過篩后處理1當歸樣品共6份，按“1.5.2”節(jié)供試品溶液的制備方法制備供試液，顯色后測定吸光度。測定結(jié)果RSD為4.5%，說明重復(fù)性良好。

2.2.4 精密度試驗 吸取“1.5.2”節(jié)對照品溶液0.6 mL并顯色，依法連續(xù)測定6次吸光度，當歸多糖吸光度的RSD為 0.8%，表明精密度良好。

2.2.5 回收率試驗 取處理1的當歸樣品粉末共9份，每份稱定約1 g，分為3組，各組分別加入葡萄糖對照品5.0、8.0、10.0 mg，進行測定，得當歸多糖的平均回收率分別為98.37%、96.02%、98.97%，RSD為1.72%。

2.2.6 樣品測定 取各當歸樣品，制備供試品溶液并測定，結(jié)果見表3。

由表3可知，不同施肥處理下當歸多糖含量為處理2>處理4>處理1>處理3。處理2比不施肥當歸多糖含量增加了5.62%，但各處理間沒有顯著性差異。

2.3 HPLC測定當歸中7種化學成分的含量

2.3.1 線性關(guān)系考察 吸取“1.5.3”節(jié)混合對照品溶液，按照一定濃度梯度稀釋成6個不同濃度的混合標準品溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后按照“1.5.3”節(jié)色譜條件進樣測定。以峰面積為縱坐標（Y），對照品進樣濃度為橫坐標（X）進行線性回歸分析，回歸方程及線性范圍結(jié)果見表4。

2.3.2 重復(fù)性試驗 稱取6份處理1的當歸粉末，每份0.5 g，按照“1.5.3”節(jié)方法制備供試品溶液，并在色譜條件下進行測定，計算其峰面積，結(jié)果按照出峰時間先后順序阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯、歐當歸內(nèi)酯含量的RSD（n=6）依次為3.45%、3.24%、4.64%、0.62%、3.32%、3.83%、1.09%。RSD值均小于5%。說明本方法重復(fù)性良好。

2.3.3 精密度試驗 取一份混合對照品溶液，按照“1.5.3”節(jié)的色譜條件，連續(xù)不間斷進樣測定6次，考察儀器精密度。結(jié)果阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯、歐當歸內(nèi)酯的精密度RSD（n=6）分別為4.09%、1.06%、3.70%、1.82%、0.54%、0.47%、0.55%。RSD值均小于5%。說明該儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 吸取“1.5.3”節(jié)下混合對照品溶液，按照色譜條件分別在0、2、4、6、8、12、24 h測定，記錄各成分峰面積。各成分峰面積RSD（n=6）值分別為4.97%、2.93%、0.70%、0.16%、1.17%、0.09%、2.06%。RSD值均小于5%。說明該供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率測定 稱取已知含量的6份當歸粉末0.5 g，分別加入一定量的阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯、歐當歸內(nèi)酯。按“1.5.3”節(jié)方法制備供試品溶液，按照色譜條件測定，計算出7種化學成分的加樣回收率，分別是97.49%、100.31%、101.57%、98.27%、101.66%、97.01%和97.45%。RSD分別是3.77%、1.28%、0.65%、1.81%、0.32%、0.48%和0.39%，說明該測定方法的準確性較好。

2.3.6 樣品測定 由表5和圖2可知，不同施肥處理對當歸中7種藥效成分含量均有顯著影響，單施有機肥有助于當歸中阿魏酸和藁本內(nèi)酯的積累，生物有機肥+復(fù)合肥處理下當歸中阿魏酸的含量較不施肥處理增加了98.3%。與單施有機肥、生物有機肥+復(fù)合肥相比，單施復(fù)合肥對當歸中洋川芎內(nèi)酯H、阿魏酸松柏酯和歐當歸內(nèi)酯的積累有促進作用。

2.3.7 主成分分析 （1）相關(guān)性分析。運用 SPSS 21.0 統(tǒng)計分析軟件，對4個不同施肥處理當歸藥材中7種化學成分進行主成分分析，結(jié)果見表6、表7。提取標準為特征值大于1，前2個成分的累積方差貢獻率達到 95.446%，前2個成分可以代表當歸藥材中的絕大部分信息。根據(jù)表7，第1主成分的信息主要由歐當歸內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯H、阿魏酸松柏酯和洋川芎內(nèi)酯I組成，第2主成分主要由阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯組成。（2）不同施肥處理的當歸藥材有效成分含量的綜合評價。根據(jù)表8得到因子得分表達式：W1=-0.173X阿魏酸+0.168X洋川芎內(nèi)酯I+0.175X洋川芎內(nèi)酯H+0.168X阿魏酸松柏酯+0.155X洋川芎內(nèi)酯A-0.070X藁本內(nèi)酯+0.175X歐當歸內(nèi)酯;W2=0.030X阿魏酸-0.217X洋川芎內(nèi)酯I+0.093X洋川芎內(nèi)酯H+0.118X阿魏酸松柏酯+0.330X洋川芎內(nèi)酯A+0.889X藁本內(nèi)酯+0.093X歐當歸內(nèi)酯。

式中：X為各成分的含量，方差貢獻率為權(quán)重。以2個主成分對當歸藥材進行綜合評價，計算其綜合評價的函數(shù)為W=80.851F1+14.595F2，并對結(jié)果進行排序，綜合得分排序結(jié)果見表9。從當歸藥效成分積累角度看，單施復(fù)合肥的當歸質(zhì)量最好，其次為單施有機肥。不施肥和有機肥+復(fù)合肥質(zhì)量排名靠后。

3 結(jié)論與討論

3.1 不同施肥處理對當歸藥材水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物含量的影響

從表2可以看出，各施肥處理下當歸藥材的水分均小于15.0%，總灰分小于7.0%，酸不溶性灰分小于2.0%，浸出物含量均超過45.0%，均達到2020年版《中華人民共和國藥典》標準。中藥材中含水量過高會容易出現(xiàn)蟲害、霉變、潮解、走味等變質(zhì)現(xiàn)象，直接影響藥材的質(zhì)量。本試驗結(jié)果表明，當歸水分含量在處理1顯著低于其他處理。從藥材中的灰分含量可以直觀地看出藥材的純度，藥材生長環(huán)境、種植方式等會影響藥材灰分變化，本研究不同施肥處理下藥材總灰分含量均為處理2顯著低于其他處理，酸不溶性灰分含量也是處理2最低。研究證明，藥材中醇溶性浸出物含量和藥效成分含量具有一定的正相關(guān)性，浸出物可反映藥材的內(nèi)在品質(zhì)，在處理1和處理2下浸出物含量高于其他處理。由此說明，增施有機肥可降低藥材水分、灰分、酸不溶性灰分含量，提高醇溶性浸出物含量。

3.2 不同施肥處理對當歸多糖含量的影響

當歸多糖具有造血、抗腫瘤、抗氧化、增強免疫能力等豐富的生理功效[8]。本試驗結(jié)果表明，不同施肥處理下當歸多糖含量大小為處理2>處理4>處理1>處理3。但各處理之間當歸多糖含量并無顯著性差異。

3.3 利用主成分分析法評價不同施肥處理對當歸中7種化學成分含量的影響

據(jù)研究，阿魏酸、阿魏酸松柏酯、洋川芎內(nèi)酯類化合物、藁本內(nèi)酯和歐當歸內(nèi)酯在諸多方面均具有良好的藥理活性[9-11]。阿魏酸是2020 年版《中華人民共和國藥典》中當歸的指標性成分。故本研究采用HPLC同時測定當歸中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯 I、洋川芎內(nèi)酯 H、阿魏酸松柏酯、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯和歐當歸內(nèi)酯 7 種成分。以往的研究學者在中藥質(zhì)量評價時大多對指標進行逐一分析，各指標權(quán)重和成分之間的聯(lián)系并不明確，而主成分分析法恰好可以彌補上述問題[12]。主成分分析結(jié)果表明，從7種有效成分含量的角度看，單施復(fù)合肥和單施有機肥可促進當歸有效成分的提高。因為復(fù)合肥中的總養(yǎng)分較高（≥51%）且施用量較大，所以可提高當歸中藥效成分含量。若長期大量施用化肥，必然會造成土壤的肥力減弱，地力下降，土壤的理化性質(zhì)退化，以及會導(dǎo)致土壤鹽漬化、病蟲害發(fā)生嚴重等一些其他問題的出現(xiàn)。施用有機肥可使土壤養(yǎng)分含量更全面，肥效更穩(wěn)定和持久，對有效成分含量積累也有一定的促進作用。

綜上所述，不同施肥處理對當歸藥材品質(zhì)均有一定影響。本研究中，當歸的最佳施肥條件為單施有機肥4797.6 kg/hm2，由于不同施肥處理對當歸中不同藥效成分的積累能產(chǎn)生不同影響，市面上常見以阿魏酸、藁本內(nèi)酯或洋川芎內(nèi)酯為主要成分的各類藥物、護膚品等，可針對不同需求結(jié)合本研究結(jié)果按需施肥。

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