不同基因型及培養(yǎng)基在燕麥花藥組織培養(yǎng)中的應用

田娟 張曼 孫墨可 董玉迪 王春龍 郭來春 魏黎明 任長忠

摘要：以JA3、M44、19A647燕麥資源為試驗材料，采用花藥離體培養(yǎng)方法，將3種材料的花藥接種于C17、W14培養(yǎng)基上，研究3種基因型在2種培養(yǎng)基上反應率、出愈率、轉(zhuǎn)移率和再生率的差異，以期篩選出適合燕麥花藥培養(yǎng)的基因型和誘導培養(yǎng)基。結(jié)果表明，在3個基因型中，JA3的反應率、出愈率、轉(zhuǎn)移率都是最高的，分別達到36.29%、2695%、86.93%，只有JA3獲得了再生植株，其綠苗率為0.10%，可見JA3適合用于花藥組織培養(yǎng)，可以作為燕麥花藥培養(yǎng)的橋梁材料;C17培養(yǎng)基中的愈傷組織比較緊湊，質(zhì)量較好，W14培養(yǎng)基中的愈傷組織不易聚集長大，質(zhì)量較差，從W14培養(yǎng)基中共獲得6株白化苗，從C17培養(yǎng)基中獲得2株白化苗、2株綠苗。由研究結(jié)果可以看出，燕麥花藥愈傷組織誘導和再分化在基因型之間的差異顯著，JA3適合作為燕麥花藥培養(yǎng)的橋梁品種，相較于W14培養(yǎng)基，C17為燕麥花藥培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基。

關鍵詞：燕麥;基因型;培養(yǎng)基;花藥組織培養(yǎng);愈傷組織

中圖分類號： S339.4+1;S512.604.3 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）09-0049-04

燕麥（Avena sativa L.）是禾本科燕麥屬一年生草本植物，是世界上主要的糧食作物之一[1]，它抗旱[2]、耐寒[3]、耐鹽堿[4-5]。燕麥蛋白的氨基酸種類齊全，配比合理[6]，具有極高的營養(yǎng)、飼用價值和保健功效[7]。燕麥新品種主要采用引進選育、系統(tǒng)育種、品種間雜交等方式育成[8]?；ㄋ幣囵B(yǎng)育種是將花粉培育成單倍體植株，再經(jīng)染色體自然或人工加倍得到純合二倍體的一種育種方法，這種由染色體加倍產(chǎn)生的純合二倍體，在遺傳上非常穩(wěn)定，不發(fā)生性狀分離，因此，花培育種能夠縮短育種年限[9]。但是在實際育種中，燕麥花培育種方法應用得很少，主要是因為花藥組織培養(yǎng)的誘導率不高。誘導率不高的原因，主要是材料的基因型、培養(yǎng)基的種類和成分、預處理和培養(yǎng)條件等因素在不同程度上制約了燕麥花藥培養(yǎng)的效果[10]。由于燕麥選育受資源與技術(shù)的雙重制約，使得燕麥育種效率低下，品種更新?lián)Q代較慢，產(chǎn)業(yè)化發(fā)展滯后[11]。為了解決我國燕麥育種面臨的育種技術(shù)單一、方法陳舊、周期長、優(yōu)良品種少等問題，攻克燕麥花藥單倍體育種技術(shù)屏障勢在必行。關于燕麥花藥組織培養(yǎng)的報道已經(jīng)有很多[12-24]，本試驗選用JA3、M44、19A647燕麥品種（系）作為試驗材料，比較C17、W14這2種誘導培養(yǎng)基在燕麥花藥培養(yǎng)過程中的反應率、出愈率、轉(zhuǎn)移率和再生率差異，以期篩選出適合燕麥花藥培養(yǎng)的基因型和誘導培養(yǎng)基，為提高燕麥花藥培養(yǎng)育種效率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以編號為JA3、M44、19A647的燕麥品種（系）作為試驗對象，于2019年4月1日播種于吉林省白城市農(nóng)業(yè)科學院內(nèi)。在孕穗期采集幼穗后置于4 ℃冰箱中進行暗、冷處理7 d后取出，用75%乙醇消毒，選取小孢子為單核中晚期的小穗（小孢子時期通過醋酸楊紅染色鏡檢來確定），剝離出花藥放在直徑為3.5 cm的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中放置30個花藥，于32 ℃處理5 d后轉(zhuǎn)移到28 ℃條件下進行暗培養(yǎng)。

1.2 愈傷組織的誘導

脫分化使用C17、W14這2種培養(yǎng)基，其中C17為固體培養(yǎng)基，W14為固液雙層培養(yǎng)基。W14上層是液體培養(yǎng)基，加入100 g/L聚蔗糖400、105 g/L麥芽糖等，培養(yǎng)基的具體成分見表1。

1.3 分化和生根培養(yǎng)

將誘導的愈傷組織轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上，再生培養(yǎng)基是固體W14，另加2%蔗糖、0.3%植物凝膠，定容后調(diào)節(jié)pH值為6.0，于121 ℃滅菌20 min。將植物激素2 mg/L NAA、0.5 mg/L KT過濾消毒后加入再生培養(yǎng)基中。再生溫度設為22 ℃，采用16 h/d弱光光照。生根采用MS培養(yǎng)基[21]，輔以0.2 mg/L NAA、2%蔗糖和0.3%植物凝膠。生根溫度為 25 ℃，光照時間為16 h/d。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用WPS 2019軟件對試驗數(shù)據(jù)進行整理和統(tǒng)計分析，用IBM SPSS Statistics 19.0軟件進行單因素方差分析。

反應時間指從花藥接種到培養(yǎng)基中至花藥表面出現(xiàn)小泡的時間，出愈時間指從花藥接種到培養(yǎng)基中至出現(xiàn)愈傷組織的時間，其他計算公式如下：

反應率=反應的花藥數(shù)/接種的花藥數(shù)×100%;

出愈率=出現(xiàn)愈傷組織的花藥數(shù)/接種的花藥數(shù)×100%;

轉(zhuǎn)移率=能夠轉(zhuǎn)移的愈傷數(shù)/出現(xiàn)愈傷組織的花藥數(shù)×100%;

綠苗率=出現(xiàn)的綠苗數(shù)/接種的花藥數(shù)×100%;

白化苗率=出現(xiàn)的白化苗數(shù)/接種的花藥數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型對燕麥花藥愈傷組織誘導和再分化的影響

以JA3、M44、19A647燕麥品種（系）為材料，研究不同基因型對燕麥花藥愈傷組織誘導和再分化的影響。由表2可以看出，不同基因型燕麥的反應時間和出愈時間有所不同，但是3種基因型燕麥從反應到出愈約用1周時間，出愈時間為23～30 d不等。在相同培養(yǎng)條件下，燕麥花藥愈傷組織誘導和再分化在不同基因型之間的差異顯著。在供試的3個材料中，JA3的反應率、出愈率均最高，分別能達到36.29%、26.95%，而且JA3的轉(zhuǎn)移率能達到8693%，說明其愈傷組織活力較高，增殖速度快。在3個燕麥基因型中，只有JA3獲得了再生植株，其綠苗率為0.10%。以上結(jié)果說明，JA3適合用于花藥組織培養(yǎng)，可以作為燕麥花藥培養(yǎng)的橋梁材料。19A647的反應率、出愈率都較低，沒有能夠轉(zhuǎn)移的愈傷組織，說明19A647不適合用于花藥培養(yǎng)。

2.2 培養(yǎng)基對燕麥花藥愈傷組織誘導和再分化的影響

由表3可以看出，C17培養(yǎng)基中的花藥反應數(shù)較W14培養(yǎng)基高，并且每個基因型中反應數(shù)均超過10%。在出愈數(shù)方面，雖然W14培養(yǎng)基比C17培養(yǎng)基高，但是在轉(zhuǎn)移數(shù)方面，W14培養(yǎng)基不如C17培養(yǎng)基。由圖1可以看出，W14培養(yǎng)基出現(xiàn)的愈傷組織比較分散，不能達到轉(zhuǎn)移所需的大小。而C17培養(yǎng)基中的愈傷組織比較緊湊，容易長大，質(zhì)量比較好。從W14培養(yǎng)基中獲得了6株白化苗，從C17培養(yǎng)基中獲得了2株白化苗和2株綠苗，且每100個花藥的綠苗數(shù)達到0.06株。綜合愈傷組織質(zhì)量和獲得的綠苗數(shù)，在本研究選用JA3、M44、19A647這3個燕麥材料進行花藥組織培養(yǎng)的過程中，C17培養(yǎng)基優(yōu)于W14培養(yǎng)基。

2.3 誘導培養(yǎng)基C17、W14成分的比較

培養(yǎng)基各成分的配比與優(yōu)化直接影響了燕麥花藥培養(yǎng)的出愈率。從表1可以看出，在C17、W14的培養(yǎng)基成分中，鐵鹽、有機成分、植物激素等含量完全相同。C17、W14中大量元素的種類不同，C17中的大量元素由KNO3、NH4NO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O提供，W14中的大量元素由KNO3、NH4H2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、K2SO4提供，相較于C17，W14中的微量元素（由KI、MnSO4·4H2O、H3BO3、ZnSO4·7H2O等化合物提供）含量都有不同程度的減少。C17是固體培養(yǎng)基，碳源只來自蔗糖，W14是固液雙層培養(yǎng)基，碳源來自蔗糖、麥芽糖，W14培養(yǎng)基中增加了L-半胱氨酸、乙烯利等。

3 討論與結(jié)論

3.1 基因型

誘導花粉形成愈傷組織是誘導花粉植株的第一步，在同樣的培養(yǎng)條件下，不同品種或雜種燕麥花藥產(chǎn)生花粉愈傷組織的頻率差異極大，有的高達48.5%，但有的則不產(chǎn)生花粉愈傷組織[22]。這種差異顯然是由花藥與花粉內(nèi)部的因素引起的，供體植株的基因型是影響花藥、花粉培養(yǎng)的關鍵因素，不同基因型的植株對培養(yǎng)的反應不同。本試驗結(jié)果表明，在相同培養(yǎng)條件下，燕麥花藥愈傷組織誘導和再分化在基因型之間的差異顯著，主要表現(xiàn)為出現(xiàn)愈傷組織的時間不同以及出愈率、綠苗分化率和白化苗分化率不同等方面。本研究結(jié)果與Kiviharju等的相關研究結(jié)果[23-25]一致。本研究所選的JA3燕麥在W14培養(yǎng)基上的出愈率達到30.10%，適合作為燕麥花藥培養(yǎng)的橋梁品種。

3.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基的組成在胚胎發(fā)生中起著主要作用。燕麥花藥培養(yǎng)效率的提高，在某些程度上依賴于培養(yǎng)基成分、激素配比等。C17、W14培養(yǎng)基是廣泛用于燕麥花藥培養(yǎng)的2種培養(yǎng)基[13，26-29]，這2種培養(yǎng)基的成分與激素含量存在一定差異。本研究對比了2種培養(yǎng)基誘導愈傷組織和綠苗分化的能力，并綜合愈傷組織的質(zhì)量、獲得的綠苗數(shù)得出，C17為最佳培養(yǎng)基，與Ponitka等的研究結(jié)果[30]一致，但是與Warchol等的研究結(jié)果[31]不一致。

本試驗中培養(yǎng)基差異很大，大量元素來源不同，微量元素含量不同，并且與C17相比，W14中添加了L-半胱氨酸、乙烯利等激素，分為固液2層，在液體層中加入了麥芽糖而不是蔗糖。這些成分的改變并沒有提高燕麥花藥愈傷組織的誘導率和質(zhì)量，但是可以看出，雙層培養(yǎng)基的優(yōu)點是花藥在培養(yǎng)早期可以從活性高的液體培養(yǎng)基中汲取營養(yǎng)，從而提高花粉反應率，但是并沒有提高愈傷組織誘導率，而且由于花藥直接放在液體培養(yǎng)基上，出現(xiàn)的愈傷組織在培養(yǎng)基上來回游動，不能聚集長大，反而降低了愈傷組織質(zhì)量。由于本研究的培養(yǎng)基差異很大，究竟是大量元素、微量元素、糖源還是 L-半胱氨酸和乙烯利等激素對愈傷組織的影響，還有待進一步探討。

本試驗從多種角度發(fā)現(xiàn)，在相同培養(yǎng)條件下，不同基因型植株的再生情況差異明顯。這種差異在很大程度上由基因型自身的再生能力決定，優(yōu)化再生體系僅能在一定程度上提高某些基因型的培養(yǎng)力，但并不能從根本上改變這種差距。對于不同培養(yǎng)基而言，相同基因型植株的出愈率差別不大。

參考文獻：

[1]鄭殿升.中國燕麥的多樣性[J]. 植物遺傳資源學報，2010，11（3）：249-252.

[2]李 威. PEG脅迫下6種裸燕麥品種種子萌發(fā)期的抗旱性研究[J]. 種子，2014，33（5）：38-41.

[3]柏曉玲，周青平，陳有軍，等. 燕麥幼苗對低溫脅迫的響應[J]. 草業(yè)科學，2016，33（7）：1375-1382.

[4]姜 瑛，周 萌，吳 越，等. 不同燕麥品種耐鹽性差異及其生理機制[J]. 草業(yè)科學，2018，35（12）：2903-2914.

[5]付鸞鴻，于 崧，于立河，等. 不同基因型燕麥萌發(fā)期耐鹽堿性分析及其鑒定指標的篩選[J]. 作物雜志，2018（6）：27-35，174.

[6]許英一，王 宇，林 巍. 燕麥蛋白理化性質(zhì)研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學學報，2018，45（3）：385-388.

[7]石振興，朱瑩瑩，任貴興. 燕麥中減肥降脂的功能成分研究進展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學報，2018，9（7）：1567-1571.

[8]任長忠，崔 林，楊 才，等. 我國燕麥高效育種技術(shù)體系創(chuàng)建與應用[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導報，2016，18（1）：1-6.

[9]王 煒，葉春雷，楊隨莊，等. 花藥培養(yǎng)技術(shù)在小麥種質(zhì)資源創(chuàng)制及育種中的應用[J]. 中國種業(yè)，2018（11）：25-29.

[10]田 娟，張 曼，董玉迪，等. 燕麥花藥組織培養(yǎng)影響因子研究進展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2018，46（35）：11-13.

[11]王 娟，李蔭藩，梁秀芝，等. 北方主栽燕麥品種種質(zhì)資源形態(tài)多樣性分析[J]. 作物雜志，2017（4）：27-32.

[12]Rines H W. Oat anther culture：genotype effect on callus initiation and the production of a haploid plant[J]. Crop Science，1983，23（2）：268-272.

[13]Kiviharju E，Puolimatka M，Pehu E. Regeneration of anther-derived plants of Avena sterilis[J]. Plant Cell，Tissue & Organ Culture，1997，48（2）：147-152.

[14]Warchol M，Skrzypek E，Nowakowska A，et al. The effect of auxin and genotype on the production of Avena sativa L. doubled haploid lines[J]. Plant Growth Regulation，2016，78（2）：155-165.

[15]Kiviharju E，Pehu E. The effect of cold and heat pretreatments on anther culture response of Avena sativa and A. sterilis[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1998，54（2）：97-104.

[16]Kiviharju E M，Tauriainen A A. 2，4-dichlorophenoxyacetic acid and kinetin in anther culture of cultivated and wild oats and their interspecific crosses：plant regeneration from A. sativa L.[J]. Plant Cell Reports，1999，18（7）：582-588.

[17]Rines H W， Rieralizarazu O， Nunez V M， et al. Oat haploids from anther culture and from wide hybridizations[M]//Jain S M， Sopory S K， Veilleux R E， et al. In vitro haploid production in higher plants. Dordrecht：Kluwer， 1997，4：205-221.

[18]Jingsan S，Tiegang L，Sōndahl M R，et al. Anther culture of naked oat and the establishment of its haploid suspension cell[J]. Journal of Integrative Plant Biology，1991，33（6）：417-420.

[19]Rines H W. Oat haploids from wide hybridization[J]. Doubled Haploid Production in Crop Plants，2003：155-159.doi：10.1007/978-94-017-1293-4_24.

[20]Kiviharju E，Moisander S，Laurila J，et al. Improved green plant regeneration rates from oat anther culture and the agronomic performance of some DH lines[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2005，81（1）：1-9.

[21]Murashige T，Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures[J]. Physiologia Plantarum，1962，15（3）：473-497.

[22]楊 才，王秀英. 采用花藥單倍體育種方法育成花中21號莜麥新品種[J]. 河北北方學院學報（自然科學版），2005，21（3）：39-42.

[23]Kiviharju E，Puolimatka M，Saastamoinen M，et al. Extension of anther culture to several genotypes of cultivated oats[J]. Plant Cell Reports，2000，19（7）：674-679.

[24]S'lusarkiewicz-Jarzina A，Ponitka A. The effect of physical medium state on anther culture response in Polish cultivated oat （Avena sativa L.）[J]. Acta Biologica Cracoviensia（Series Botanica），2007，49（2）：27-31.

[25]Noga A，Skrzypek E，Warchol M，et al. Conversion of oat （Avena sativa L.） haploid embryos into plants in relation to embryo developmental stage and regeneration media[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，2016，52（6）：590-597.

[26]Kiviharju E，Puolimatka M，Saastamoinen M，et al. The effect of genotype on anther culture response of cultivated and wild oats[J]. Agricultural and Food Science in Finland，1998，7（3）：409-422.

[27]Kiviharju E，Moisander S，Tanhuanpaa P，et al. Oat anther culture and use of DH-lines for genetic mapping[J]. Methods of Molecular Biology，2017，1536：71-93.

[28]Sidhu P K，Davies P A. Regeneration of fertile green plants from oat isolated microspore culture[J]. Plant Cell Reports，2009，28（4）：571-577.

[29]Ferrie A M R，Irmen K I，Beattie A D，et al. Isolated microspore culture of oat （Avena sativa L.） for the production of doubled haploids：effect of pre-culture and post-culture conditions[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2014，116（1）：89-96.

[30]Ponitka A，S'lusarkiewicz-Jarzina A. Regeneration of oat androgenic plants in relation to induction media and culture conditions of embry-like structures[J]. Acta Societatis Botanicorum Poloniae，2009，78（3）：209-213.

[31]Warchol M，Czyczylo-Mysza I，Marcińska I，et al. Factors inducing regeneration response in oat （Avena sativa L.） anther culture[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，2019，55（5）：595-604.