南京椴天然居群的表型性狀多樣性及變異分析

嚴(yán)靈君， 黃 犀， 岳遠(yuǎn)灝， 湯詩杰， 王歡利

〔江蘇省中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園) 江蘇省植物資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 南京210014〕

南京椴(TiliamiquelianaMaxim.)隸屬于椴樹科(Tiliaceae)椴樹屬(TiliaLinn.)，為落葉大喬木，株高可達(dá)20 m[1-2]。南京椴的主干挺拔、枝繁葉茂、花香馥郁，既是優(yōu)良的行道和材用樹種，也是良好的編織和造紙材料及蜜源植物；其花、葉中含有類黃酮、內(nèi)酯類和芳香油等成分，具有治療呼吸和消化疾病的藥用功效[3-5]。南京椴天然居群主要分布于江蘇、浙江、安徽和江西等地，相對集中或散生于落葉或常綠闊葉林中[3]，是江蘇省重要的鄉(xiāng)土樹種。研究結(jié)果[6-8]表明：南京椴天然居群處于生長衰退期，自然更新缺乏、生境破壞嚴(yán)重，個體數(shù)量不斷減少，加之現(xiàn)有天然居群的遺傳背景和多樣性水平不清晰，南京椴種質(zhì)資源的保護(hù)及遺傳改良受到制約，因此，對南京椴種質(zhì)資源進(jìn)行收集和保護(hù)對其可持續(xù)應(yīng)用具有重要的意義[9]。

植物的表型性狀由遺傳因子決定，但同時具有環(huán)境可塑性，反映了植物對環(huán)境因子的適應(yīng)程度。經(jīng)過長期的自然選擇，植物表型性狀發(fā)生不可逆的改變，并能穩(wěn)定地遺傳給后代，因此，對表型性狀變異的研究是探究植物遺傳多樣性的重要途徑之一。目前，對南京椴的相關(guān)研究主要集中在群落結(jié)構(gòu)[6-8]、生態(tài)學(xué)[10]、個體生長規(guī)律[11]以及繁殖技術(shù)[12-15]等方面，但關(guān)于其種群表型性狀多樣性和遺傳關(guān)系尚缺乏全面且深入的探究。

鑒于此，作者以南京椴的5個天然居群為研究對象，對葉片、種子和果序的11個表型性狀進(jìn)行測定，并在此基礎(chǔ)上采用方差分析、相關(guān)性分析、主成分分析和聚類分析等多種分析方法，揭示南京椴天然居群的表型性狀多樣性特征和變異規(guī)律，同時在一定程度上解析南京椴的遺傳多樣性水平和變異狀況，為南京椴種質(zhì)資源的保護(hù)、評價及遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

在江蘇省和安徽省南京椴的自然分布區(qū)選擇5個天然居群供試。供試居群分別位于江蘇省南京市牛首山、江蘇省鎮(zhèn)江市寶華山、安徽省滁州市瑯琊山、安徽省安慶市鷂落坪和安徽省宿州市皇藏峪。各樣地的基本概況見表1。

表1 供試南京椴5個天然居群的生境概況

在每個居群中選取10株生長正常、無嚴(yán)重缺陷、無病蟲害的南京椴個體作為樣株，樣株樹齡15～30 a、樹高10 m以上、胸徑18 cm以上，樣株間距30 m以上。于2018年8月至10月采集樣株樹冠中上部南向葉片和結(jié)果小枝，用于各項(xiàng)表型性狀的測定。

1.2 方法

從南京椴的葉片、種子和果序的形態(tài)指標(biāo)中選擇11個表型性狀，并參照童躍偉等[16]的方法，使用游標(biāo)卡尺(精度0.01 mm)對各表型性狀進(jìn)行精確測量。其中，葉片表型性狀包括葉柄長(葉柄基部至葉片基部的長度)、葉片長(葉片基部至頂端的長度)和葉片寬(葉片最寬處的寬度)；種子表型性狀包括種柄長(種柄基部至種子基部的長度)、種子橫徑(種子橫軸長度)和種子縱徑(種子縱軸長度)；果序表型性狀包括苞片柄長(苞片柄基部至苞片基部的長度)、苞片長(苞片基部至頂端的長度)、苞片寬(苞片最寬處的寬度)、苞果合生長度(苞片上果序著生點(diǎn)至苞片柄頂部的長度)和果序柄長(果序柄基部至果序基部的長度)。

每個居群10株樣株，采集各樣株樹冠中上部南向枝條5支，在枝條中上部隨機(jī)采集完整的葉片、種子、苞片及果序樣本各30個，每個樣本各表型性狀分別測量3次，結(jié)果取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

采用EXCEL 2010軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理；并采用R3.3.3軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用箱式圖進(jìn)行離群值的檢測，對分組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢測。

分別對各表型性狀的均值和標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行計算和單因素方差分析，并采用Fisher最小顯著性差異法(LSD)對5個天然居群11個表型性狀均值進(jìn)行多重比較。

分別計算各表型性狀的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，采用變異系數(shù)(CV)分析各表型性狀的離散程度[17]；采用Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H′)分析5個天然居群表型性狀的多樣性程度[18]；參考蘇澤春等[19]的方法對各表型性狀進(jìn)行巢式方差分析，并計算表型分化系數(shù)；采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析各表型性狀的相關(guān)性，同時采用corr.test函數(shù)對相關(guān)系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)；采用rda函數(shù)進(jìn)行表型性狀的主成分分析；將數(shù)據(jù)進(jìn)行Z-score標(biāo)準(zhǔn)化處理，并采用Ward法對5個天然居群進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 南京椴天然居群表型性狀的差異性和多樣性分析

南京椴5個天然居群的葉片、種子和果序表型性狀的差異、變異系數(shù)和Shannon-Wiener多樣性指數(shù)的比較見表2，各表型性狀的方差分析結(jié)果見表3，各表型性狀的方差分量和表型分化系數(shù)見表4。

表2 南京椴5個天然居群葉片、種子和果序表型性狀的差異、變異系數(shù)和Shannon-Wiener多樣性指數(shù)的比較1)

表3 南京椴居群間和居群內(nèi)葉片、種子和果序表型性狀的方差分析結(jié)果

表4 南京椴天然居群葉片、種子和果序表型性狀的方差分量和表型分化系數(shù)

2.1.1 表型性狀的差異 由表2可見：南京椴的葉柄長、葉片長、葉片寬、種柄長、種子橫徑、種子縱徑、苞片柄長、苞片長、苞片寬、苞果合生長度和果序柄長的均值依次為42.23、86.36、75.22、9.72、8.61、9.46、1.75、107.46、17.82、53.34和37.51 mm，不同居群間各表型性狀均存在不同程度的差異。

在3個葉片表型性狀中，安徽省宿州市皇藏峪(P5)居群的葉柄長(52.51 mm)最大，顯著(P<0.05)大于安徽省滁州市瑯琊山(P3)、江蘇省鎮(zhèn)江市寶華山(P2)和江蘇省南京市牛首山(P1)3個居群；安徽省安慶市鷂落坪(P4)居群的葉片長(102.15 mm)和葉片寬(91.72 mm)均最大，且總體與其他4個居群差異顯著；P1居群的葉柄長(30.48 mm)、葉片長(65.84 mm)和葉片寬(53.81 mm)均最小，且與其他4個居群差異顯著。

在3個種子表型性狀中，P4居群的種柄長(14.00 mm)最大，且與其他4個居群差異顯著；P5居群的種子橫徑(9.40 mm)和種子縱徑(10.60 mm)均最大，與P2居群無顯著差異，但二者的種子橫徑和種子縱徑均顯著大于其他3個居群。

在5個果序表型性狀中，P3居群的苞片柄長(2.70 mm)最大，與P1居群無顯著差異，但二者的苞片柄長均顯著大于其他3個居群；P5居群的苞片長(127.73 mm)、苞果合生長度(63.32 mm)和果序柄長(44.35 mm)均最大，且總體上與其他4個居群差異顯著；P5、P4和P3居群的苞片寬分別為20.67、20.04和20.53 mm，三者無顯著差異，但均顯著大于P2和P1居群。

方差分析結(jié)果(表3)顯示：南京椴的11個表型性狀的差異在居群間均達(dá)極顯著(P<0.01)水平；但在居群內(nèi)僅葉片長這一表型性狀的差異達(dá)極顯著水平，葉片寬、苞片長和苞片寬3個表型性狀的差異達(dá)顯著水平，其他7個表型性狀在居群內(nèi)均無顯著差異。

2.1.2 表型性狀的變異性 由11個表型性狀的變異系數(shù)(表2)可見：南京椴天然居群11個表型性狀的變異系數(shù)(CV)存在較大差異，其中，種子橫徑的CV值最小，僅為10.80%；苞片柄長的CV值最大，達(dá)到70.29%，且總體上看，葉柄長、種柄長和苞片柄長的變異系數(shù)在各自對應(yīng)的器官表型性狀中均最大。

在3個葉片表型性狀中，葉柄長的CV值(28.06%)最大，葉片長的CV值(19.64%)最小。在3個種子表型性狀中，種柄長的CV值(30.04%)最大，種子橫徑的CV值(10.80%)最小。在5個果序表型性狀中，苞片柄長的CV值(70.29%)最大，苞片長的CV值(17.13%)最小，果序柄長、苞片寬和苞果合生長度的CV值均在24%以下。

總體上看，在南京椴天然居群的11個表型性狀中，僅種子橫徑和種子縱徑的CV值小于15%，其他9個表型性狀的CV值均在15%以上，說明南京椴天然居群表型性狀的變異較為豐富，但種子表型性狀的變異程度小于其他器官。

2.1.3 表型性狀的多樣性 由Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(表2)可見：南京椴5個天然居群11個表型性狀的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H′)存在一定差異，其中，種柄長的H′值(1.74)最小，葉片寬和果序柄長的H′值(2.10)最大，且總體上葉片性狀的H′較大且變化幅度較小。

在3個葉片表型性狀中，葉片寬的H′值(2.10)最大，葉柄長的H′值(2.04)最小。在3個種子表型性狀中，種子橫徑的H′值(2.03)最大，種柄長的H′值(1.74)最小。在5個果序表型性狀中，果序柄長的H′值(2.10)最大，苞片寬、苞片長和苞果合生長度的H′值均在2.05及以上，而苞片柄長的H′值(1.80)最低。說明供試南京椴天然居群的種子表型性狀的多樣性較低，葉片和果序的表型性狀多樣性較高。

2.1.4 表型性狀的變異來源 由表4可見：在南京椴天然居群11個表型性狀的居群間方差分量百分比的均值(43.50%)明顯大于居群內(nèi)方差分量百分比的均值(14.16%)。各表型性狀的居群間表型分化系數(shù)為66.12%～86.09%，均值為75.44%；其中，僅果序柄長的表型分化系數(shù)為66.12%，其他表型性狀的表型分化系數(shù)均在70%以上。說明居群間的變異是供試南京椴表型性狀變異的主要來源。

2.2 南京椴天然居群表型性狀的相關(guān)性分析

南京椴天然居群的葉片、種子和果序表型性狀間的相關(guān)系數(shù)見表5。

表5 南京椴天然居群的葉片、種子和果序表型性狀間的相關(guān)系數(shù)1)

由表5可見：3個葉片表型性狀(葉柄長、葉片長和葉片寬)間均呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)；而在3個種子表型性狀中，僅種子橫徑與種子縱徑呈極顯著正相關(guān)；在5個果序表型性狀中，苞片長、苞片寬、苞果合生長度和果序柄長4個表型性狀間呈極顯著正相關(guān)。而在供試的11個表型性狀中，葉柄長僅與種子橫徑無顯著相關(guān)性，葉片長僅與種子橫徑和種子縱徑無顯著相關(guān)性，且種子的3個表型性狀與多數(shù)果序表型性狀間均無顯著相關(guān)性；另外，苞片柄長與3個葉片表型性狀呈顯著(P<0.05)或極顯著負(fù)相關(guān)，與所有種子表型性狀和果序表型性狀均無顯著相關(guān)性。

總體上看，種子表型性狀與葉片和果序表型性狀間大多無顯著相關(guān)性，而葉片表型性狀與果序表型性狀間大多具有極顯著或顯著相關(guān)性。

2.3 南京椴天然居群表型性狀的主成分分析

對南京椴天然居群11個表型性狀進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見表6。結(jié)果顯示：前5個主成分的累計貢獻(xiàn)率達(dá)82.96%，表明前5個主成分可基本反映南京椴表型性狀的大部分信息。

第1主成分的貢獻(xiàn)率為36.35%，以葉柄長、葉片長、葉片寬、苞片長、苞片寬、苞果合生長度和果序柄長特征向量的絕對值較大，均在1.0以上；第2主成分的貢獻(xiàn)率為16.58%，以葉片寬、苞片長和苞果合生長度特征向量的絕對值較大，均在1.0以上，說明第1和第2主成分主要反映南京椴葉片和苞片等器官的特征。第3主成分的貢獻(xiàn)率為15.21%，以種子縱徑和種子橫徑特征向量的絕對值較大，均在1.5以上，說明該主成分主要反映南京椴種子的特征。第4主成分的貢獻(xiàn)率為8.22%，以苞片柄長特征向量的絕對值較大(大于1.5)，說明該主成分主要反映南京椴苞片柄的特征。第5主成分的貢獻(xiàn)率為6.60%，以果序柄長特征向量的絕對值較大(大于1.0)，說明該主成分主要反映南京椴果序柄的特征。

2.4 南京椴天然居群的聚類分析

基于葉片、種子和果序11個表型性狀對南京椴5個天然居群進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖1。

P1： 江蘇省南京市牛首山Niushou Mountain of Nanjing City in Jiangsu Province； P2： 江蘇省鎮(zhèn)江市寶華山Baohua Mountain of Zhenjiang City in Jiangsu Province； P3： 安徽省滁州市瑯琊山Langya Mountain of Chuzhou City in Anhui Province； P4： 安徽省安慶市鷂落坪Yaoluoping of Anqing City in Anhui Province； P5： 安徽省宿州市皇藏峪Huangcangyu of Suzhou City in Anhui Province.

在歐氏距離6.0處，供試的5個天然居群可分為3組，其中，江蘇省鎮(zhèn)江市寶華山(P2)、安徽省滁州市瑯琊山(P3)和江蘇省南京市牛首山(P1)3個居群聚在一起，為組Ⅰ；安徽省宿州市皇藏峪(P5)和安徽省安慶市鷂落坪(P4)居群各自單獨(dú)成組，分別為組Ⅱ和組Ⅲ。在歐氏距離1.0處，組Ⅰ又可分為2個亞組，其中，P2和P3居群聚為亞組Ⅰa，P1居群單獨(dú)成亞組Ⅰb。從表型性狀看，P2和P3居群的葉柄長、葉片長、葉片寬、種柄長、種子橫徑、種子縱徑以及果序柄長的測定值均較為相近；P1居群的葉柄長、葉片長、葉片寬和種柄長均明顯小于P2和P3居群；P4和P5居群的葉片表型性狀(葉柄長、葉片長和葉片寬)以及種柄長均明顯大于其他居群。

供試南京椴5個居群的聚類分析結(jié)果與各居群的地理距離有一定關(guān)系。江蘇省南京市牛首山、江蘇省鎮(zhèn)江市寶華山和安徽省滁州市瑯琊山3個居群的地理距離較近，在聚類圖上聚為一組；而安徽省安慶市鷂落坪和安徽省宿州市皇藏峪2個居群與上述3個居群的地理距離較遠(yuǎn)，在聚類圖中各自成組。

3 討論和結(jié)論

植物的表型性狀既具有變異性又具有穩(wěn)定性，受其自身的遺傳組成和外部環(huán)境兩方面的影響，可在一定程度上直觀地反映物種的遺傳多樣性[20-21]。南京椴5個天然居群的葉片、種子和果序的表型性狀在居群內(nèi)和居群間均存在一定的差異，其中，居群間11個表型性狀的差異達(dá)到極顯著水平，而在居群內(nèi)僅葉片長、葉片寬、苞片長和苞片寬存在極顯著或顯著差異，且11個表型性狀的居群間表型分化系數(shù)均值為75.44%，表明南京椴天然居群的表型性狀變異較大，且變異主要來自居群間；而湯詩杰等[22-23]基于ISSR和RAPD遺傳標(biāo)記對南京椴天然居群的遺傳變異狀況進(jìn)行了分析，認(rèn)為居群內(nèi)變異是南京椴遺傳分化的主要來源。南京椴的表型性狀分析與遺傳標(biāo)記分析的結(jié)果存在差異，這一現(xiàn)象說明表型性狀不僅由遺傳因子決定，同時還存在一定的可塑性，尤其是營養(yǎng)器官的形態(tài)，受不同區(qū)域內(nèi)土壤、水分和植被類型等因子影響，是植物適應(yīng)環(huán)境因子的一種表現(xiàn)。

南京椴11個表型性狀的變異系數(shù)為10.80%～70.29%，表明南京椴表型性狀的變異豐富；且除種子橫徑和種子縱徑外，其他表型性狀的變異系數(shù)均在15%以上，表明與營養(yǎng)器官相比，種子等繁殖器官受環(huán)境變化的影響較小，性狀的穩(wěn)定性相對較強(qiáng)。11個表型性狀的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)為1.74～2.10，表明南京椴的表型性狀具有豐富的多樣性；其中，果柄長和葉片寬的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)最高，種柄長的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)最低，與各自變異系數(shù)的分析結(jié)果存在一定差異。形成這種差異的原因可能與這2類數(shù)據(jù)蘊(yùn)涵的意義不同有關(guān)。變異系數(shù)反映了表型性狀數(shù)據(jù)的離散程度；而Shannon-Wiener多樣性指數(shù)則是對表型性狀豐富度和均勻度的綜合評價，表型性狀越豐富且分布越均勻，多樣性指數(shù)越高[24]。

相關(guān)性分析結(jié)果表明：南京椴的葉片、種子和果序3類器官的各表型性狀間存在不同程度的相關(guān)性，葉片和果序表型性狀與種子橫徑和縱徑總體無顯著相關(guān)性，但葉片表型性狀與果序表型性狀大多呈極顯著或顯著相關(guān)性，說明同類器官的表型性狀存在一定的相關(guān)性，但不同類器官間的表型性狀關(guān)聯(lián)度不高，特別是種子表型性狀與其他2類器官多數(shù)表型性狀均無顯著相關(guān)性，而葉片表型性狀與果序表型性狀(特別是苞片表型性狀)大多存在一定的相關(guān)性，這與苞片(變態(tài)葉)與葉片的器官屬性一致有關(guān)。

對南京椴表型性狀的主成分分析結(jié)果表明：前5個主成分的累計貢獻(xiàn)值達(dá)82.96%，其中第1、第2、第4和第5主成分主要反映南京椴葉片和果序的特征，第3主成分主要反映其種子的特征。前5個主成分中絕對值較大的表型性狀均為反映南京椴表型性狀差異的主要因子，也是南京椴多樣性保護(hù)和選育研究中的主要觀測性狀。聚類分析結(jié)果表明：在歐氏距離6.0處，可將供試的5個南京椴天然居群分為3組，其中，地理分布較近的P1、P2和P3居群聚為一組，這3個居群分別分布于江蘇省南京市牛首山、江蘇省鎮(zhèn)江市寶華山和安徽省滁州市瑯琊山，而地理距離相對較遠(yuǎn)的P4和P5居群則各自獨(dú)立成組，這2個居群分別分布于安徽省安慶市鷂落坪和安徽省宿州市皇藏峪，表明基于表型性狀的聚類結(jié)果與各居群的地理分布基本一致。而湯詩杰等[22-23]基于分子標(biāo)記對南京椴天然居群進(jìn)行的聚類分析結(jié)果并未表現(xiàn)出居群遺傳因子和地理分布的一致性。植物的表型特征不僅由其基因型決定，也受環(huán)境壓力的影響[25]，這是導(dǎo)致南京椴居群遺傳分化與表型分化規(guī)律不一致的原因之一。

綜上所述，南京椴天然居群的表型性狀變異豐富，不同居群的種子及葉片等器官的形態(tài)存在豐富的多樣性；居群間的表型分化是其變異的主要來源。植物的表型性狀存在一定的環(huán)境可塑性，是其適應(yīng)環(huán)境因子的一種表現(xiàn)。植物的天然居群保持較高的遺傳多樣性水平有利于其居群的發(fā)展[26]，因此，在南京椴種質(zhì)資源的保護(hù)過程中，可選取表型差異較大的個體進(jìn)行重點(diǎn)保護(hù)，通過對表型性狀的聚類分組闡明不同居群表型性狀的差異，并依據(jù)育種目標(biāo)篩選出適宜的育種材料。

本研究選取的5個天然居群主要分布于江蘇省和安徽省，地理位置相近且生境條件相似，獲得的研究數(shù)據(jù)不能充分解析環(huán)境因子對表型性狀的影響，因而，后續(xù)可進(jìn)一步根據(jù)南京椴的分布區(qū)域擴(kuò)大取樣范圍，通過分析不同分布區(qū)的氣候和土壤因子與表型性狀的相關(guān)性，解析其表型性狀的遺傳穩(wěn)定性和環(huán)境可塑性。此外，本研究僅對南京椴的葉片、種子和果序等器官的表型性狀進(jìn)行了1年定點(diǎn)測量，存在表型性狀較少、觀察和測量連續(xù)性和重復(fù)性不足等問題，因而，后續(xù)可以通過連年取樣或建立同質(zhì)園實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)大樣本數(shù)量并增加不同組織和器官表型性狀的數(shù)量，以期更全面地反映南京椴天然居群的表型特征差異。在今后的研究中，還可以對南京椴分布區(qū)域的環(huán)境因子進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，結(jié)合不同居群的表型特征建立相關(guān)矩陣，進(jìn)一步闡述表型特征對環(huán)境因子的響應(yīng)；同時，采用分子生物學(xué)技術(shù)深入系統(tǒng)地揭示南京椴天然居群的遺傳變異規(guī)律，以期推動南京椴天然居群的遺傳多樣性研究及其野生資源的保護(hù)、評價和利用。