不同產(chǎn)地沙氏鹿茸草全株中黃酮類和苯乙醇苷類成分含量的比較

李峰卿， 劉素貞， 唐 艷， 周新華， 曾滿生

(中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)實驗中心， 江西 分宜 336600)

沙氏鹿茸草(MonochasmasavatieriFranch. ex Maxim.)的干燥全草可藥用，具有抑菌、抗炎和抗病毒等功效[1-2]。目前，已從沙氏鹿茸草中分離出黃酮類(木犀草素)、苯乙醇苷類(類葉升麻苷、異類葉升麻苷和torenoside B等)、酚酸類和三萜類化合物[3-5]，其中，苯乙醇苷類是其全草的代表性化學(xué)成分，對治療呼吸道感染或肺炎有意義[6]；類葉升麻苷，具有抗骨質(zhì)疏松、抗炎和抗衰老等藥理活性[7-9]；木犀草素是主要的黃酮類成分之一，具有抗氧化、抗菌、抗炎和抗腫瘤等藥理作用[10]。藥用植物的活性成分含量除與其本身的遺傳因子有關(guān)外，還受生境條件顯著影響[11]。因此，了解不同產(chǎn)地沙氏鹿茸草全株中有效成分含量的差異有助于評價其藥材質(zhì)量。

作者以來源于不同產(chǎn)地的沙氏鹿茸草全株為材料，對其黃酮類和苯乙醇苷類成分的含量進(jìn)行了測定，以期為沙氏鹿茸草藥材的質(zhì)量控制提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試野生沙氏鹿茸草多年生成年全株于2019年5月分別采自浙江的蓮都和龍泉，福建寧化，湖南茶陵以及江西的修水、樂平、信豐、安福和分宜9個產(chǎn)地，經(jīng)江西省林業(yè)科學(xué)研究院朱培林研究員鑒定為沙氏鹿茸草。以10株為1個樣品，每產(chǎn)地采集3個樣品，共27個樣品。將全株洗凈，于70 ℃烘干至恒質(zhì)量，粉碎后過篩(40目)，于干燥條件下保存、備用。

主要儀器和試劑：Waters 1525-2998高效液相色譜儀(美國Waters公司)，Waters C18反相色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，VGT-2227QTD超聲波提取儀(蘇州江東精密儀器有限公司)，UV1800紫外可見分光光度計(日本Shimadzu公司)。類葉升麻苷(批號61276-17-3)、異類葉升麻苷(批號61303-13-7)、木犀草素(批號491-70-3)標(biāo)準(zhǔn)品均購自上海源葉生物科技有限公司，純度均大于98%；乙腈和甲醇為色譜純(德國Merck公司)，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 總黃酮含量測定 參考肖作為等[12]的方法并略作修改，制備蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并計算總黃酮含量。按料液比1∶100(m∶V)的比例在樣品粉末中加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇，于60 ℃下震蕩提取60 min。取540 μL提取液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%NaNO2溶液30 μL，反應(yīng)6 min；加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%Al(NO3)3溶液30 μL，反應(yīng)5 min；加入1 mol·L-1NaOH溶液400 μL，靜置15 min；于波長510 nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)y、蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y=5.028 2x+0.000 7(R2=0.999 6)，線性范圍25.44～152.64 μg·mL-1。

1.2.2 總苯乙醇苷含量測定 由于類葉升麻苷在沙氏鹿茸草全株中含量較高，故選其為苯乙醇苷類成分的對照品。精密稱取類葉升麻苷對照品適量，用適量甲醇溶解并配制成0.352 mg·mL-1類葉升麻苷對照品母液；分別精密吸取對照品母液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 mL，用甲醇分別定容至10 mL，于波長330 nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)y、類葉升麻苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y=29.894 3x-0.020 4(R2=0.999 5)，線性范圍3.25～176.00 μg·mL-1。

稱取樣品粉末約0.2 g(精確至0.000 1 g)，準(zhǔn)確加入體積分?jǐn)?shù)70%甲醇25 mL，稱量，超聲(250 W)提取40 min；冷卻后用體積分?jǐn)?shù)70%甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，并用0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液為樣品溶液。按上述類葉升麻苷對照品測定方法于波長330 nm處測定吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品溶液中總苯乙醇苷的濃度。

1.2.3 類葉升麻苷、異類葉升麻苷和木犀草素含量測定 按照1.2.2中方法分別制備對照品和樣品溶液，分別得到0.218 mg·mL-1類葉升麻苷、0.236 mg·mL-1異類葉升麻苷和0.220 mg·mL-1木犀草素對照品母液。精密吸取各對照品母液2 mL，混合后用甲醇進(jìn)行5、10、25、50和100倍梯度稀釋，配制成系列濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用于HPLC分析。

色譜條件：采用Waters C18反相色譜柱，流動相A為甲醇、流動相B為質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.4%磷酸水溶液，流速 1.0 mL·min-1，檢測波長330 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。分別精密吸取各標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液，按照上述色譜條件測定。以峰面積為縱坐標(biāo)y、對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。類葉升麻苷線性回歸方程為y=4.397 5×103x+1.688 2×104(R2=0.999 8)，線性范圍2.18～218.00 μg·mL-1；異類葉升麻苷線性回歸方程為y=9.580 4×103x+1.507 5×104(R2=0.999 6)，線性范圍2.36～236.00 μg·mL-1；木犀草素線性回歸方程為y=8.742 6×103x+3.502 3×104(R2=0.999 8)，線性范圍2.20～220.00 μg·mL-1。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線并依據(jù)峰面積換算樣品中3個成分的含量。

1.2.4 方法學(xué)考察 對上述HPLC方法進(jìn)行方法學(xué)考察，精密度考察中類葉升麻苷、異類葉升麻苷和木犀草素峰面積的RSD值依次為0.50%、2.82%和1.38%，重復(fù)性考察中3個成分峰面積的RSD值依次為0.86%、2.20%和1.56%，穩(wěn)定性考察中3個成分峰面積的RSD值依次為0.38%、0.51%和1.09%，表明儀器的精密度、方法的重復(fù)性和供試品溶液的穩(wěn)定性均良好。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

利用SPSS 22.0軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行產(chǎn)地間的方差分析，并采用Duncan’s新復(fù)極差法對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果和分析

不同產(chǎn)地沙氏鹿茸草全株中黃酮類和苯乙醇苷類成分的含量見表1。

表1 不同產(chǎn)地沙氏鹿茸草全株中主要活性成分的含量

由表1可見：不同產(chǎn)地沙氏鹿茸草全株中總黃酮和木犀草素的含量分別為26.96～133.74和0.83～4.03 mg·g-1。其中，江西的樂平、分宜和安福的樣品中總黃酮含量均位居前3位，分別為133.74、121.32和97.49 mg·g-1；而湖南茶陵的樣品中總黃酮含量最低(含量為26.96 mg·g-1)，前三者分別為后者的4.96、4.50和3.62倍。木犀草素含量以江西安福的樣品中最高(4.03 mg·g-1)，以浙江麗水的樣品中最低(0.83 mg·g-1)，前者是后者的4.86倍。

由表1還可見：不同產(chǎn)地沙氏鹿茸草全株中總苯乙醇苷、類葉升麻苷和異類葉升麻苷的含量分別為19.23～63.93、0.34～15.98和0.17～5.41 mg·g-1。其中，總苯乙醇苷、類葉升麻苷和異類葉升麻苷含量均以江西樂平的樣品中最高，以湖南茶陵的樣品中最低，前者的總苯乙醇苷、類葉升麻苷和異類葉升麻苷含量分別為后者的3.32、47.00和31.82倍。

方差分析結(jié)果表明：不同產(chǎn)地沙氏鹿茸草全株中總黃酮、木犀草素、總苯乙醇苷、類葉升麻苷和異類葉升麻苷的含量均存在極顯著差異?？傮w上看，江西樂平、安福和分宜的樣品中總黃酮和總苯乙醇苷含量顯著高于其他產(chǎn)地的樣品，且木犀草素、類葉升麻苷和異類葉升麻苷的含量也較高。

3 討論和結(jié)論

本研究中，沙氏鹿茸草全株中總黃酮含量(26.96～133.74 mg·g-1)明顯高于楊蓓芬等[13]的測定結(jié)果，這種現(xiàn)象除與樣品的種類、提取方法和采收時間等因子的差異有關(guān)外，還與生長條件不同有關(guān)。張舒婷等[14]的研究結(jié)果顯示：在不同產(chǎn)地鹿茸草(M.sheareriMaxim. ex Franch. et Savat.)中，浙江寧波和江西豐城的鹿茸草中木犀草素含量較高；而本研究中，江西的安福和分宜的沙氏鹿茸草全株中木犀草素含量顯著高于其他產(chǎn)地，表明同一種類不同產(chǎn)地間木犀草素含量差異較大。從2個苯乙醇苷單體成分看，不同產(chǎn)地的沙氏鹿茸草全株中類葉升麻苷含量的變幅高于異類葉升麻苷，說明類葉升麻苷含量的地理變異程度高于異類葉升麻苷。

不同產(chǎn)地的沙氏鹿茸草全株中總黃酮、木犀草素以及類葉升麻苷、異類葉升麻苷和總苯乙醇苷的含量均有極顯著差異，且總體上看，江西的樂平、安福和分宜的沙氏鹿茸草全株中各成分的含量相對較多，從藥用活性成分含量角度看，這3個產(chǎn)地的沙氏鹿茸草藥用價值較高。受遺傳和環(huán)境因子的影響，藥用植物活性成分含量變化的性質(zhì)和程度各不相同，這種差異也可能與采收時間以及保存方式等有關(guān)。因此，還有待于對沙氏鹿茸草野生資源進(jìn)行全面的調(diào)研，并針對采收時間和保存方式等方面對其活性成分含量進(jìn)行更細(xì)致的比較分析，同時探討地理因子與其活性成分含量的相關(guān)性，以期篩選出優(yōu)良的沙氏鹿茸草種源。