雌二醇對小鼠急性心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

錢魯，李卓遠(yuǎn)，張素勤

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江 溫州 325027，1.心內(nèi)科；2.心電圖室

急性心肌梗死是冠狀動(dòng)脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死。目前能夠改善急性心肌梗死患者預(yù)后的藥物均有一定降壓作用，對于心源性休克、血壓偏低的患者有一定應(yīng)用限制。因此，如何改善急性心肌梗死患者的預(yù)后，仍是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。急性心肌梗死的基本病理生理基礎(chǔ)是心肌缺血再灌注損傷及氧化應(yīng)激。AMPK是細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激應(yīng)答的核心。MIF-AMPK信號通路是一條新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞信號通路[1-2]。缺血心臟釋放心肌巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor， MIF），MIF促進(jìn)AMPK激活，促進(jìn)下游葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)[2]和抑制游離脂肪酸分解。ISO-1為選擇性MIF抑制劑， 能選擇性地結(jié)合MIF的互變異構(gòu)酶活性位點(diǎn)，從而抑制MIF的一些生物學(xué)功能[3]。乙酰輔酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）是制約脂肪酸合成第一階段速度的限速酶。

人體內(nèi)分泌的天然雌激素為雌二醇、雌酮及雌三醇。多項(xiàng)研究表明雌二醇與MIF的表達(dá)相關(guān)[4-6]，而雌二醇在心肌缺血再灌注損傷急性期中的保護(hù)機(jī)制目前尚無定論。本研究通過探討雌二醇在心肌缺血再灌注損傷中與MIF-AMPK信號通路的相互作用，為急性心肌梗死的治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 一抗試劑包括MIF、AMPK、p-AMPK、ACC、p-ACC單克隆抗體均購自美國CST公司。雄性C57BL/6小鼠購自上海吉輝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號：SCXK（滬）2017-0012。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：按照隨機(jī)數(shù)字表法將6～8周齡的雄性C57BL/6小鼠分為6組，每組10只：①空白組：無任何試劑處理，無缺血再灌注；②對照組：無任何試劑處理，缺血再灌注；③雌二醇溶媒（中鏈甘油三酯）組（溶媒1）：在再灌注前30 min腹腔注射2 mg/mL中鏈甘油三酯（與雌二醇組等量）；④ISO-1溶媒組（溶媒2）：在再灌注前30 min腹腔注射DMSO（與雌二醇+ISO-1組等量）；⑤雌二醇組：在再灌注前30 min腹腔注射雌二醇1 mg/kg；⑥雌二醇+ISO-1組：在再灌注前30 min腹腔注射雌二醇1 mg/kg及ISO-1 10 mg/kg。

1.2.2 心肌缺血再灌注模型[2]：用異氟烷吸入麻醉后，小鼠氣管插管，用小鼠呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣，用加熱板維持小鼠體溫37 ℃，開胸，在左心耳下方2 mm處用7-0尼龍線結(jié)扎前降支40 min（后期心臟B超檢查及TTC染色）或10 min（后期取心臟行Western blot實(shí)驗(yàn)）后松開縫線再灌注，逐層關(guān)閉胸腔，移除小動(dòng)物呼吸機(jī)，置于電熱毯保溫。

1.2.3 心臟功能檢測[2]：前降支結(jié)扎40 min后松開縫線再灌注48 h。通過經(jīng)胸心臟超聲檢測左室射血分?jǐn)?shù)（ejection fractions，EF）、左室短軸縮短率（fraction shortening，F(xiàn)S）。左室FS=（左心室舒張末期內(nèi)徑-左心室收縮末期內(nèi)徑）/左心室舒張末期內(nèi)徑×100%。左室EF=（左室舒張末容積-左室收縮末容積）/左室舒張末容積×100%。通過TTC染色檢測梗死面積。心肌梗死面積百分率=梗死區(qū)（infarct size，INF）/缺血危險(xiǎn)區(qū)（ratio of the area at risk，AAR）×100%。

1.2.4 心肌MIF蛋白、AMPK及ACC磷酸化程度檢測：前降支結(jié)扎10 min后松開縫線再灌注10 min，Western blot檢測心肌MIF蛋白、AMPK及ACC活化程度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雌二醇保護(hù)缺血再灌注急性期心臟收縮功能，使用ISO-1后保護(hù)作用明顯減弱 雌二醇組小鼠EF較對照組明顯改善（P＜0.01），F(xiàn)S也有所改善（P＜0.01）。ISO-1拮抗MIF作用后雌二醇+ISO-1組的EF較雌二醇組有所下降（P＜0.01），F(xiàn)S也明顯下降（P＜ 0.01）。見圖1。

圖1 心臟超聲檢測各組小鼠左室EF和FS

2.2 雌二醇減少缺血再灌注急性期心肌梗死面積，應(yīng)用ISO-1后梗死面積增大 雌二醇組心肌梗死面積較對照組明顯減低（P＜0.001），ISO-1抑制MIF作用后梗死面積較雌二醇組增加（P＜0.05），與對照組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.242）。見圖2。

圖2 雌二醇對缺血再灌注急性期心肌梗死面積的影響

2.3 雌二醇保護(hù)心肌梗死后心功能的機(jī)制 雌二醇組MIF相對表達(dá)量較對照組高（P＜0.001），雌二醇組p-AMPK及p-ACC相對表達(dá)量均較對照組高（P＜0.01），而IS0-1作用后p-AMPK及p-ACC相對表達(dá)量明顯減少（P＜0.05）。見圖3。

圖3 雌激素及ISO-1對MIF及其下游AMPK、ACC信號通路的作用

3 討論

流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)冠心病的患者主要為中老年男性及絕經(jīng)后女性。年輕女性冠心病的發(fā)病率遠(yuǎn)小于相同年齡的男性，而這種差距在女性絕經(jīng)期后迅速縮小。在絕經(jīng)期后，女性中冠心病的發(fā)病率急劇上升[7-8]。多年來，女性這種對冠心病的“相對免疫”，被歸因?yàn)榇萍に氐谋Ｗo(hù)作用。首先，雌二醇對血脂具有調(diào)控作用。雌二醇通過上調(diào)肝臟低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）受體的表達(dá)、降低肝脂蛋白脂肪酶活性、減輕LDL的氧化修飾等途徑降低循環(huán)中LDL水平；雌二醇促進(jìn)肝分泌膽汁酸，從而使膽固醇在肝臟的排出增多，降低體內(nèi)膽固醇水平[9]。其次，雌二醇對血管內(nèi)皮細(xì)胞具有調(diào)控作用。雌激素可以促進(jìn)一氧化氮（NO）、前列環(huán)素（prostaglandin I2，PGI2）和內(nèi)皮來源超極化因子（endothelium derived hyperpolarizing factor， EDHF）等血管舒張因子的產(chǎn)生，抑制內(nèi)皮素-1 （endothelin-1，ET-1）的生成，減少內(nèi)皮細(xì)胞活性氧的生成，從而改善血管內(nèi)皮功能；并可以促進(jìn)內(nèi)皮的完整性，減少其對促動(dòng)脈粥樣硬化因子的通透性；抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)，從而減少炎癥細(xì)胞的黏附和遷移；還可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡并促進(jìn)其增殖和生存[10-11]。也有研究報(bào)道雌二醇通過ET-1的作用，對受損心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞具有強(qiáng)大的修復(fù)作用，并促進(jìn)心肌梗死后心功能的改善[12]。研究顯示小鼠心肌缺血再灌注后使用雌二醇對心臟表現(xiàn)出保護(hù)作用，其機(jī)制可能為增加線粒體Cx43的含量和磷酸化水平[13]、上調(diào)生物鐘基因Per2[14]、增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞歸巢及血管生成能力[15]。另有研究表明，雌二醇通過抑制外周免疫細(xì)胞分泌MIF，從而抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)皮膚外傷的愈合[6，16]。在子宮內(nèi)膜異位癥患者中，血清雌二醇水平升高與子宮內(nèi)膜MIF表達(dá)上調(diào)相關(guān)[4]，并且MIF的表達(dá)能夠被雌二醇受體拮抗劑氟維司群阻斷，被雌二醇選擇性激動(dòng)劑上調(diào)[5]。但目前，雌二醇在心肌缺血再灌注急性期的作用與MIF-AMPK信號系統(tǒng)的關(guān)系未見相關(guān)研究。

在本研究中，雌二醇作用下缺血再灌注損傷后心肌梗死面積較對照組減小，心臟超聲檢查提示左室EF及FS較對照組升高，表明雌二醇處理對急性缺血再灌注損傷后心臟功能具有保護(hù)作用。

心肌缺血再灌注損傷及氧化應(yīng)激是急性心肌梗死的核心病理生理過程。AMPK是細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激應(yīng)答的核心，它能夠調(diào)控能量代謝以促進(jìn)ATP的合成。在心臟中缺血缺氧導(dǎo)致ATP耗竭、AMP累積，后者激活A(yù)MPK，從而恢復(fù)ATP的產(chǎn)生。AMPK信號通路能夠促進(jìn)葡萄糖和脂肪酸的吸收、儲存和代謝。MIF是一種同源三聚體蛋白質(zhì)，能夠在局部抑制巨噬細(xì)胞游走，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[17]。心肌細(xì)胞在缺血條件下MIF-AMPK信號通路受損，導(dǎo)致能量代謝能力的減弱，影響對缺血性損傷的耐受能力[18]，這是缺血再灌注損傷心功能的重要機(jī)制。AMPK下游的ACC磷酸化水平是心肌能量物質(zhì)中游離脂肪酸代謝程度的重要指標(biāo)。進(jìn)一步的研究表明，在心肌梗死早期（6 h內(nèi)），外周血MIF主要來自心肌細(xì)胞分泌，與心肌細(xì)胞膜上的CD74等MIF受體結(jié)合進(jìn)入心肌細(xì)胞，通過MIF-AMPK信號系統(tǒng)，發(fā)揮調(diào)節(jié)底物代謝、抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用[19]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者血清中MIF水平較對照組高，不穩(wěn)定性心絞痛患者血清中MIF水平比穩(wěn)定性心絞痛患者高[20]。

本研究結(jié)果顯示雌二醇作用后AMPK及ACC磷酸化水平增高。這表明雌二醇作用后游離脂肪酸氧化代謝受到抑制，梗死心肌能量代謝改善，推測這是雌二醇保護(hù)急性心肌梗死后心臟功能的一種可能的機(jī)制。而雌二醇作用下心肌組織MIF表達(dá)升高，其對AMPK-ACC信號通路的激活促進(jìn)作用能被MIF抑制劑ISO-1拮抗，這表明雌二醇對AMPK及ACC的作用可能通過MIF實(shí)現(xiàn)，與MIF-AMPK信號通路相關(guān)。

綜上所述，雌二醇可能通過MIF-AMPK信號通路，改善心肌缺血再灌注急性期心肌代謝，增強(qiáng)心肌對缺血再灌注損傷的抵御能力。雌二醇作為人體本身存在的激素，短期使用無明顯降血壓作用，這對于急性心肌梗死患者可能具有良好耐受性，本研究結(jié)論可為雌二醇在心肌缺血再灌注急性期的應(yīng)用提供依據(jù)。鑒于患者長期使用雌二醇存在血栓形成、卒中、乳腺癌、焦慮樣行為等風(fēng)險(xiǎn)[21]，因此，心肌梗死急性期雌二醇應(yīng)用時(shí)限有待進(jìn)一步研究。