蒙藥古日古木-13丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

康松松，楊雪苗，馮智翱，楊 丹，薄彧坤，安 明

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014040)

蒙藥古日古木-13丸，又名紅花清肝十三味丸，由紅花、麥冬、丁香、蓮子、木香、訶子、川楝子、梔子、紫檀香、水牛角濃縮粉、人工牛黃、麝香、銀朱13味藥組成，收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(蒙藥分冊)》[1]。古日古木-13丸清肝熱，在蒙藥歷史中使用較廣泛，臨床上用于治療眼科類疾病、肝臟類疾病、“亞瑪”病、心絞痛、腦梗死、腎熱癥等[2-4]。為完善藥材的有效性控制，以質(zhì)量可控為目標(biāo)，擬建立古日古木-13丸中紅花、訶子和丁香的薄層鑒別標(biāo)準(zhǔn)，測定羥基紅花黃色素A的含量，制定古日古木-13丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1儀器 GenPure UV-TOC/UF超純水機(jī)、Thermo Ultimate3000高效液相色譜儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)；BSA224S-CW萬分之一電子天平、SQP型十萬分之一電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；AS系列超聲波清洗機(jī)-220 V/50 Hz(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；TDZ5-WS多管架自動平衡離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

1.2試劑藥品 對照品羥基紅花黃色素A(180323-017)購于內(nèi)蒙古伏安瓦科技有限公司，沒食子酸(110831-201605)、丁香酚(110725-201615)和對照藥材紅花(120907-201412)、訶子(121015-201004)均購于中國食品藥品檢定研究院；古日古木-13丸(806221、901112、901113)由內(nèi)蒙古包頭市中蒙醫(yī)院制劑室提供；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

1.3方法

1.3.1薄層鑒別

1.3.1.1紅花薄層鑒別 取紅花對照藥材0.5 g、古日古木-13丸3.5 g、陰性(不含紅花的處方其余藥材)3.0 g，加80 %丙酮10 mL，超聲10 min，離心，取上清液即得。照薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn)，各取10 μL，點(diǎn)于硅膠H薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(4∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干。

1.3.1.2訶子薄層鑒別 取訶子對照藥材0.5 g、古日古木-13丸3.0g 、陰性(不含訶子的處方其余藥材)2.8 g，加甲醇10 mL，超聲30 min，離心，取上清液即得。取沒食子酸加甲醇制成8 mg/mL對照品溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn)，各取10 μL，點(diǎn)于硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶4∶0.6)展開劑，展開，取出，晾干，噴2 %三氯化鐵乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。

1.3.1.3丁香薄層鑒別 取古日古木-13丸3.0 g、陰性2.8 g，加甲醇10 mL，超聲30 min，離心，取上清液即得。取丁香酚加甲醇制成9 mg/mL對照品溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn)，各取5 μL，點(diǎn)于硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴5 %香草醛硫酸溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。

1.3.2含量測定

1.3.2.1色譜條件 (1)色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；(2)流動相：甲醇-乙腈-0.7 %磷酸水溶液(26:2:72)；流速1.0 mL/min；檢測波長403.0 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2.2對照品溶液 精密稱定羥基紅花黃色素A對照品適量，加25 %甲醇制成109.4 μg/mL的對照品溶液。

1.3.2.3供試品溶液 取古日古木-13丸約2.8 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25 %的甲醇50 mL，密塞，稱重，超聲處理40 min，放冷，補(bǔ)重，5 000 r/min離心10 min，取續(xù)濾液即得。

2 結(jié)果

2.1薄層鑒別

2.1.1紅花薄層鑒別 在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，樣品顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無干擾。見圖1。

圖1 古日古木-13丸中紅花的TLC圖譜

2.1.2訶子薄層鑒別 在與對照藥材、對照品色譜相應(yīng)位置上，樣品顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無干擾。見圖2。

圖2 古日古木-13丸中訶子的TLC圖譜

2.1.3丁香薄層鑒別 在與對照品色譜相應(yīng)位置上，樣品顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無干擾。見圖3。

圖3 古日古木-13丸中丁香的TLC圖譜

2.2含量測定

2.2.1提取效率試驗(yàn) 以25 %甲醇50 mL為溶劑，考察不同超聲提取時(shí)間對提取效率的影響。提取時(shí)間為40 min和50 min時(shí)，羥基紅花黃色素A的含量幾乎相同，為節(jié)約能源，故選擇超聲時(shí)間為40 min。見表1。

表1 提取效率試驗(yàn)

2.2.2專屬性 稱取2.8 g除紅花外其他藥材研磨成粉，置于錐形瓶，照“1.3.2.3”項(xiàng)下制備陰性對照溶液。照“1.3.2.1”項(xiàng)下，分別精密吸取3種溶液各10 μL分析，結(jié)果表明陰性對照色譜圖(見圖6)中，在與羥基紅花黃色素A對照品(見圖4)以及供試品色譜圖(見圖5)相對應(yīng)的保留時(shí)間處無色譜峰出現(xiàn)，專屬性好。

圖4 羥基紅花黃色素A對照品溶液色譜圖

圖5 供試品溶液色譜圖

圖6 陰性對照溶液色譜圖

2.2.3線性關(guān)系考察 取“1.3.2.2”項(xiàng)下對照品溶液，分別精密吸取6、8、10、12和14 μL進(jìn)樣分析，以峰面積對濃度進(jìn)行回歸分析，結(jié)果顯示，羥基紅花黃色素A的濃度分別為65.64、87.52、109.4、131.28、153.16 μg/mL時(shí)，平均峰面積為32.4845、43.5125、54.3955、65.1595、75.983，回歸方程為y=0.4965x-0.015，r2=0.9999，可見羥基紅花黃色素A在65.64～153.16 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4精密度試驗(yàn) 取“1.3.2.2”項(xiàng)下對照品溶液，按照“1.3.2.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5針，進(jìn)樣量10 μL，其峰面積的平均值為56.1818，RSD為0.083 %(n=5)，說明精密度良好。

2.2.5穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h，按照“1.3.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定，樣品中羥基紅花黃色素A的峰面積分別為51.515、51.093、51.639、51.669、51.664、51.487，RSD為0.430 %。

2.2.6重復(fù)性試驗(yàn) 取批號901112樣品6份，每份約2.8 g，精密稱定，制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，測定羥基紅花黃色素A的峰面積，結(jié)果見表2。

表2 重復(fù)性測定結(jié)果

2.2.7加樣回收率試驗(yàn) 取批號901112樣品9份，每份約1.4g ，分為3組，分別在3組具塞錐形瓶中加入羥基紅花黃色素A對照品溶液1 mL、2 mL、3 mL(約相當(dāng)于供試品含量的50 %，100 %，150 %)，再加入25 %甲醇49 mL、48 mL、47 mL，按“1.3.2.3”項(xiàng)下進(jìn)樣分析，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率測定結(jié)果

2.2.8樣品含量測定 取樣品3批(批號為：901112、806211、901113)，每批2份，另取模擬樣品3份，按正文“含量測定”項(xiàng)下的方法處理，分析測定，羥基紅花黃色素A的含量均在1.82 mg/g以上。見表4。采用同法，對模擬樣品用紅花藥材進(jìn)行了含量測定，結(jié)果見表5。

表4 樣品測定結(jié)果

表5 紅花藥材中羥基紅花黃色素A含量測定結(jié)果

按理論值折算，模擬樣品應(yīng)含羥基紅花黃色素A1.90337 mg/g，羥基紅花黃色素A轉(zhuǎn)移率=(1.89/1.90)×100 %=99.45 %。2020年版《中國藥典》一部“紅花”項(xiàng)下規(guī)定：含羥基紅花黃色素A不得少于1.0 %(相當(dāng)于10 mg/g)。含量低限=(28.6/200.4)×10×99.45 %=1.4193 mg/g?？紤]到其他影響因素，下浮10 %，本品每1 g含紅花以羥基紅花黃色素A計(jì)不得少于1.2774 mg。

3 討論

對蒙藥古日古木-13丸中紅花[5]、訶子[6]和丁香[7]建立了薄層色譜定性鑒別方法，在與對照藥材或?qū)φ掌飞V相應(yīng)位置上，樣品顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無干擾，專屬性強(qiáng)。與文獻(xiàn)相比，成功建立了紅花、訶子和丁香的薄層鑒別標(biāo)準(zhǔn)，對古日古木-13丸的薄層定性鑒別進(jìn)行了補(bǔ)充。同時(shí)建立了羥基紅花黃色素A的含量測定方法[8-10]，考察了提取時(shí)間對提取效率的影響，從環(huán)保和被測成分提取方面考慮，選擇了40 min；羥基紅花黃色素A在65.64 μg/mL～153.16 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；平均回收率為100.4 %。根據(jù)2020年版《中國藥典》一部“紅花”項(xiàng)下規(guī)定，考慮到其他因素的影響，蒙藥古日古木-13丸每1 g含紅花以羥基紅花黃色素A計(jì)不得少于1.2774 mg。建立的羥基紅花黃色素A含量測定方法專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，靈敏度高，簡便快捷。

綜上所述，成功地建立了蒙藥古日古木-13丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為產(chǎn)品質(zhì)量控制提供了依據(jù)。