miRNA對(duì)低氧/缺血損傷腦神經(jīng)的保護(hù)作用研究進(jìn)展*

曹曉宇，武柯含，楊海霞，邊 帥，趙藝杰，孫 穎，阿勇嘎，張淵博，謝 偉,2，邵 國(guó)，2, 鮑牧蘭，2，巴德仁貴,2

(1.包頭醫(yī)學(xué)院內(nèi)蒙古自治區(qū)低氧轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古包頭 014040;2.包頭醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)與麻醉學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所)

低氧/缺血會(huì)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生損傷，但抑制氧自由基和炎性因子的產(chǎn)生可減輕低氧/缺血狀態(tài)對(duì)腦神經(jīng)的損傷作用, 這也是目前臨床治療相關(guān)疾病的一個(gè)重要策略。低氧/缺血預(yù)適應(yīng)(hypoxia/ischemia preconditioning,H/IPC)指機(jī)體接受短暫的低氧/缺血刺激可使組織、器官甚至生物體對(duì)隨后的嚴(yán)重低氧/缺血壓力具有適應(yīng)性的現(xiàn)象。作為機(jī)體的一種內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，低氧/缺血預(yù)適應(yīng)可以通過(guò)抑制氧自由基和炎性因子來(lái)保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。目前研究表明，低氧/缺血預(yù)適應(yīng)刺激miRNA的表達(dá)變化可能是其發(fā)揮保護(hù)作用的重要機(jī)制之一。

1 miRNA的概述、作用機(jī)制及相關(guān)功能

1.1miRNA概述 miRNA是一類非編碼的小RNA分子，約18～24個(gè)核苷酸大小，最早在線蟲中發(fā)現(xiàn)，后證實(shí)在動(dòng)植物及微生物、病毒中均有存在。研究表明，miRNA在細(xì)胞分化、增殖和凋亡等許多生物學(xué)過(guò)程中起重要作用。一般可利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR或者基于分子雜交的方法進(jìn)行檢測(cè)。

miRNA是由核內(nèi)編碼miRNA的基因轉(zhuǎn)錄出初級(jí)轉(zhuǎn)錄本pri-microRNA，pri-microRNA可在一定區(qū)域被含有特定核糖核酸酶的Dorsha和相關(guān)蛋白催化形成含有60～70個(gè)核苷酸的莖-環(huán)pri-microRNA，即pre-miRNA。pre-miRNA在細(xì)胞質(zhì)的特定區(qū)域內(nèi)被Dicer酶及其他蛋白質(zhì)催化形成成熟的microRNA，發(fā)揮其生物學(xué)功能[1]。

1.2miRNA的機(jī)制及相關(guān)功能 隨著研究的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)miRNA的作用機(jī)制復(fù)雜多樣，由最初經(jīng)典的microRNA基因沉默機(jī)制3’UTR區(qū)結(jié)合作用轉(zhuǎn)向了5’UTR區(qū)、啟動(dòng)子區(qū)和編碼區(qū)[2]。由此產(chǎn)生了“seed序列”及“種子規(guī)律”等理論方法[3]。

miRNA能對(duì)靶mRNA起到剪切、降解、抑制翻譯等作用，故miRNA在調(diào)控基因表達(dá)方面的研究不斷被深化。突出表現(xiàn)在其與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可通過(guò)檢測(cè)相關(guān)miRNA來(lái)輔助診斷及治療癌癥。研究表明miR-21可作為重要生物標(biāo)志物運(yùn)用于乳腺癌的診斷、治療及預(yù)后[4]判斷。在惡性肝腫瘤中，miRNA的表達(dá)也存在明顯差異,對(duì)惡性肝腫瘤的轉(zhuǎn)移、預(yù)后等都能起到調(diào)控作用。有研究揭示，miR-203和miR-124是肝癌診斷的新型生物標(biāo)記物，miR-21、miR-122和miR-223可同時(shí)觀察肝炎和惡性肝腫瘤的產(chǎn)生[5]。在血清學(xué)檢測(cè)中，肺癌患者的miR-486、miR-30d、miR-1、miR-499也較正常人有明顯差異，可運(yùn)用于非小細(xì)胞肺癌的診斷治療[6]。此外，血清中的miRNA與糖尿病前期及Ⅱ型糖尿病的診斷密切相關(guān)，過(guò)表達(dá)miR-133及miR-1可抑制心肌肥大[7]。

2 miRNA與低氧/缺血損傷

2.1缺血/低氧預(yù)適應(yīng) 現(xiàn)如今，國(guó)內(nèi)外對(duì)缺血、低氧和低氧預(yù)適應(yīng)都有較為全面的研究。缺血/低氧預(yù)處理可對(duì)某些疾病起到保護(hù)作用，miRNA在過(guò)程中發(fā)揮重要作用。1986年Murry將給予非致死性、短暫、輕度缺血或再灌注操作能使機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)大的抗損傷能力，再遇到致死性缺血時(shí)可有耐受力來(lái)保護(hù)器官的現(xiàn)象稱為缺血預(yù)適應(yīng)(Ischemia Preconditioning，IPC)[8]。2003年科學(xué)家又提出缺血后適應(yīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)與IPC有同樣效果[9]。低氧預(yù)適應(yīng)(Hypoxia Preconditioning，HPC)則是指給予一定低氧刺激使其獲取在致死量時(shí)的耐受性[10]。近年來(lái)，越來(lái)越多研究者提出并證實(shí)適度低氧可預(yù)防和治療由缺血導(dǎo)致的腦部疾病、由神經(jīng)損傷導(dǎo)致的退行性疾病和精神疾病。在20世紀(jì)30年代，“低氧訓(xùn)練”的概念被前蘇聯(lián)科學(xué)家Sirotinin提出，美國(guó)Johns Hopkins等人又提出“高住低訓(xùn)”的概念，即運(yùn)動(dòng)員在高海拔睡覺休息在海平面進(jìn)行訓(xùn)練，可大大提高運(yùn)動(dòng)員水平[11]。在我國(guó)，1999年呂國(guó)蔚教授也為小鼠創(chuàng)造出重復(fù)低氧環(huán)境，發(fā)現(xiàn)小鼠在低氧條件下耐受力明顯增強(qiáng)[12]。缺血/低氧預(yù)適應(yīng)兩者均為內(nèi)源性保護(hù)現(xiàn)象都可應(yīng)用于多種缺血/低氧性疾病的治療中。

2.2miRNA與缺血/低氧性疾病聯(lián)系 miRNA與急性腦梗死密切關(guān)聯(lián)。在對(duì)患者進(jìn)行遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)操作后檢測(cè)到血清中miR-21下降速度和增幅明顯增大[13]。潘振偉等研究發(fā)現(xiàn)，缺血預(yù)適應(yīng)導(dǎo)致多種miRNA的表達(dá)發(fā)生不同層次的上調(diào)或下調(diào)，從而進(jìn)一步推測(cè)miR-1和miR-133在缺血性心律失常的調(diào)節(jié)中可作為藥物靶點(diǎn)進(jìn)行治療[14]。在心肌缺血實(shí)驗(yàn)中，miR-1和miR-328在小鼠心肌缺血或再灌注模型發(fā)生明顯變化[15]。構(gòu)建心肌細(xì)胞低氧損傷模型后，發(fā)現(xiàn)在心肌細(xì)胞中miR-486可減輕低氧造成的損傷并抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮保護(hù)作用[16]。在局部腦缺血小鼠中，19種miRNA在腦內(nèi)的表達(dá)發(fā)生不同層次變化[17]。作為調(diào)控新生兒或兒童缺氧缺血性腦病(Hypoxic-Ischemic Encephalopathy，HIE)的重要分子，miRNA可作為分子標(biāo)志物判斷HIE的嚴(yán)重程度。在減輕腦水腫缺血癥狀方面，多種miRNA作為潛在的治療靶點(diǎn)發(fā)揮重要作用[18]。急性缺血性腦卒中患者miR-9和miR-124表達(dá)水平在外周血中明顯高于健康人，可作為腦損傷程度判定的生物標(biāo)記物[19]。由此表明miRNA在缺血低氧的相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用。

3 miRNA在低氧/缺血預(yù)適應(yīng)中的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制

3.1通過(guò)調(diào)節(jié)基因、蛋白進(jìn)行保護(hù) miRNA可通過(guò)調(diào)節(jié)基因、蛋白進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)。研究表明，miRNA在腦缺血再灌注損傷過(guò)程中起到一定作用，但其機(jī)制尚不明確。通過(guò)構(gòu)建大鼠腦缺血再灌注模型并給予電刺激后發(fā)現(xiàn)，miR-29c的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致重復(fù)序列包含蛋白2(Repeat-containing protein2，Birc2)和植物受體激酶(BRI-Associated Kinase1，Bak1)的mRNA在梗死區(qū)域表達(dá)減少，并且增加了梗死面積和凋亡細(xì)胞數(shù)量，惡化病情，由此推斷miR-29c可通過(guò)調(diào)控凋亡基因Birc2和Bak1來(lái)達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用[20]。在帕金森病的研究中顯示，miR-7和miR-153可調(diào)節(jié)α突觸核蛋白基因的表達(dá)，miR-181a也可通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)來(lái)起到保護(hù)神經(jīng)的作用[21]。在PC12細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)分析凋亡率和乳糖脫氫酶釋放量發(fā)現(xiàn)miR-9a-5p可抑制人叉頭框蛋白O1(Forkkhead box-O1，F(xiàn)OXO1)表達(dá)，證實(shí)在被過(guò)氧化氫損傷后的神經(jīng)細(xì)胞miR-9a-5p可起到一定保護(hù)作用[22]。針對(duì)心肌細(xì)胞構(gòu)建缺氧/復(fù)氧模型，在雙熒光素酶基因檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)miR-124-3p的靶基因是受體相互作用蛋白激酶1(Receptor-interacting protein kinases1，RIPK1)，miR-124-3p可通過(guò)調(diào)節(jié)RIPK1表達(dá)達(dá)到保護(hù)作用[23]。

miRNA不僅能通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)起到神經(jīng)保護(hù)作用，還可利用海馬神經(jīng)元通過(guò)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子達(dá)到效果。研究表明，在體外培養(yǎng)72小時(shí)的海馬神經(jīng)元，利用慢病毒轉(zhuǎn)染的手段，將miR-132轉(zhuǎn)入神經(jīng)元并用β-淀粉樣蛋白處理形成阿爾茨海默癥病理模型，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR手段測(cè)得miR-132表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)通過(guò)miR-132可改變腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)從而達(dá)到抑制神經(jīng)損傷的作用[24]。

3.2通過(guò)信號(hào)通路進(jìn)行保護(hù) miRNA可通過(guò)調(diào)節(jié)信號(hào)通路進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)。研究表明，阿爾茨海默癥模型中，發(fā)現(xiàn)GSK-3β是多種信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵元素[25]。miR-135a、miR-135b-5p可以通過(guò)下調(diào)GSK-3β進(jìn)而促進(jìn)核因子E2相關(guān)因子(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(anti-oxidative response element，ARE)信號(hào)通路起到保護(hù)神經(jīng)元作用。miR-9和miR-124可抑制Rap2a表達(dá)，導(dǎo)致GSK-3β活性降低，使神經(jīng)干細(xì)胞更新、修復(fù)損傷能力增強(qiáng)，在阿爾茨海默癥中發(fā)揮神經(jīng)協(xié)同保護(hù)作用[26]。用Aβ1-42建立阿爾茨海默癥細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)miRNA可使Aβ42導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡數(shù)量減少，GSK-3β活性增加，miR-21可在體外通過(guò)PDCD4/PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路的方式達(dá)到保護(hù)作用[27]。已有研究證實(shí)，利用miRNA可使神經(jīng)元凋亡、能改變神經(jīng)元微結(jié)構(gòu)并影響炎癥過(guò)程從而達(dá)到降低癲癇的發(fā)病率的目的[28]。miR-181a通過(guò)調(diào)控P13K/Akt/GSK3β信號(hào)通路，降低神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡率和細(xì)胞漏出率，增加NAD+數(shù)量，影響海馬神經(jīng)元發(fā)育起到抗癲癇作用[29]。采用線栓法建立MCAO大鼠模型中，檢測(cè)miR-17-5p和第10號(hào)染色體中缺失的磷酸酶及張力蛋白同源蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)的mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-17-5p可介導(dǎo)調(diào)控PTEN信號(hào)通路起到保護(hù)作用[30]。還有實(shí)驗(yàn)表明，miR-146a可通過(guò)下調(diào)Toll樣受體4(Toll-like receptor，TLR4)信號(hào)通路減少炎癥因子釋放緩解神經(jīng)性疼痛[31]。

4 展望

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究證實(shí)miRNA可在低氧/缺血腦神經(jīng)損傷中起到保護(hù)作用。miRNA作為某些疾病的生物標(biāo)志物，通過(guò)控制相關(guān)基因表達(dá)起到針對(duì)性療效?，F(xiàn)研究中，可用藥物干預(yù)miRNA治愈疾病，如益生菌可調(diào)節(jié)miRNA治療腸道疾病。并且隨著未來(lái)人口老齡化的到來(lái)，關(guān)于阿爾茨海默癥、帕金森病等神經(jīng)性老年高發(fā)疾病將越來(lái)越受到大眾的關(guān)注，研究者也在不斷探討miRNA與其相互作用，不斷攻克著醫(yī)學(xué)難關(guān)。目前，miRNA的作用機(jī)制雖已基本明確，但其在低氧/缺血預(yù)適應(yīng)方面還有待進(jìn)一步研究，所以miRNA在低氧/缺血損傷方面的探索研究將前景廣闊。