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    葉酸缺乏對L02細(xì)胞增殖、凋亡及紡錘體組裝檢查點(diǎn)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    2021-07-01 10:11:30任歡歡徐洪寶王忠邁王春景廖亞平
    關(guān)鍵詞:明顯增加檢查點(diǎn)葉酸

    任歡歡,楊 瑜,徐洪寶,王忠邁,程 宗,梁 猛,王春景,廖亞平

    紡錘體組裝檢查點(diǎn)(spindle assembly checkpoint,SAC)是細(xì)胞周期調(diào)控中的眾多檢查點(diǎn)之一,有助于維持細(xì)胞有絲分裂期間基因組穩(wěn)定性,SAC結(jié)構(gòu)功能異常是導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定性與非整倍體的重要原因之一,Mad2、Bub1、BubR1是SAC中的關(guān)鍵組分。

    葉酸是一碳代謝循環(huán)中重要的甲基供體,在DNA合成、穩(wěn)定性及修復(fù)中起關(guān)鍵作用。其缺乏會導(dǎo)致DNA損傷、染色體和基因組不穩(wěn)定等。葉酸缺乏會對損壞SAC網(wǎng)絡(luò),從而致使細(xì)胞發(fā)生有絲分裂異常與非整倍性[1],但是非整倍體發(fā)生的機(jī)制尚不明確且葉酸缺乏對SAC影響的報(bào)道較少。本研究通過探索不同濃度葉酸對L02細(xì)胞增殖、凋亡及Mad2、Bub1、BubR1 mRNA及蛋白水平的影響,并討論可能的作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞及試劑 L02細(xì)胞(武漢普諾賽細(xì)胞庫);無葉酸RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司);葉酸粉末(Sigma公司);Annexin V-FITC/PI試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液、PMSF(江蘇碧云天生物有限公司);Mad2、Bub1、BubR1抗體(美國Bethyl公司);β-actin抗體(Cell Signaling Technology 公司);辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體(武漢博士德生物工程有限公司);熒光定量PCR試劑盒(Takara公司);Mad2、Bub1、BubR1引物(上海生工生物有限公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞分組及處理 將L02細(xì)胞培養(yǎng)于含5%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。將細(xì)胞分為正常對照組和不同濃度葉酸組(分別給予200 nmol/L、20 nmol/L和0 nmol/L葉酸處理2周)。

    1.2.2 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài) 倒置顯微鏡下觀察不同濃度葉酸培養(yǎng)2周后的L02細(xì)胞形態(tài)。

    1.2.3 CCK8法檢測細(xì)胞活性 將培養(yǎng)第12天的L02細(xì)胞按3.0×103個/孔接種于96孔板,各組3孔,過夜貼壁后,每孔加入10 μL CCK8試劑后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h,并于450 mm處檢測吸光度(OD)值。

    1.2.4 細(xì)胞周期試劑盒檢測細(xì)胞周期 將培養(yǎng)2周的L02細(xì)胞以5×105個/mL接種于6孔板中,收集細(xì)胞;按照說明書進(jìn)行PI染色,流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

    1.2.5 Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測細(xì)胞凋亡 將培養(yǎng)2周的L02細(xì)胞以5×105個/mL接種于6孔板中,收集細(xì)胞;按照說明書進(jìn)行Annexin V-FITC/PI進(jìn)行染色,流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

    1.2.6 qRT-PCR檢測Mad2、Bub1、BubR1 mRNA的表達(dá)量 收集各組細(xì)胞,TRIzol法提取細(xì)胞總RNA,按照Takara的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,PCR擴(kuò)增Mad2、Bub1、BubR1。根據(jù)GenBank上公布的人類Mad2、Bub1、BubR1序列,應(yīng)用Primer Primer5軟件設(shè)計(jì)引物,由上海生工生物工程公司合成(見表1)。同一標(biāo)本β-actin作為內(nèi)參照,采用2-△△CT法進(jìn)行相對定量分析。qRT-PCR的反應(yīng)條件:95 ℃ 15 s,60 ℃ 34 s,72 ℃ 30 s,40個循環(huán)。

    表1 引物序列

    1.2.7 Western blotting檢測Mad2、Bub1、BubR1的蛋白表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞,用RIPA裂解液進(jìn)行裂解,BCA蛋白定量后調(diào)整蛋白濃度,取適量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電轉(zhuǎn)到PVDF膜,用5%脫脂牛奶封閉室溫封閉2 h。室溫孵育一抗Mad2、Bub1和BubR1(1∶1 000稀釋)1 h,洗膜3次,室溫孵育相應(yīng)二抗1 h,細(xì)洗膜3次。ECL顯色后置于凝膠成像儀中曝光,Image J進(jìn)行灰度值分析。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1 葉酸對L02細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 與正常對照組相比,20 nmol/L與0 nmol/L葉酸培養(yǎng)2周后,細(xì)胞體積增大、形態(tài)不規(guī)則,0 nmol/L葉酸組現(xiàn)象更加顯著(見圖1)。

    2.2 葉酸對L02細(xì)胞增殖活性的影響 與正常對照組相比,200 nmol/L、20 nmol/L組與0 nmol/L細(xì)胞活性明顯降低(P<0.01);與200 nmol/L相比,20 nmol/L與0 nmol/L組細(xì)胞活性明顯降低(P<0.01)(見表2)。

    表2 不同濃度葉酸培養(yǎng)2周后對細(xì)胞增殖能力(OD450值)的影響

    2.3 葉酸對L02細(xì)胞周期的影響 與正常對照組相比,200 nmol/L組細(xì)胞G1/G0期、S期均值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);20 nmol/L組和0 nmol/L組細(xì)胞G1/G0期明顯降低(P<0.01)、S期明顯升高(P<0.01)。與200 nmol/L相比,20 nmol/L組和0 nmol/L組細(xì)胞G1/G0期明顯降低(P<0.01)、S期明顯升高(P<0.01)。與20 nmol/L組相比,0 nmol/L組S期明顯增加、G1/G0期明顯減少(P<0.01)(見表3)。

    表3 不同濃度葉酸培養(yǎng)2周后對細(xì)胞周期的影響

    2.4 葉酸對L02細(xì)胞凋亡的影響 與正常對照組相比,200 nmol/L組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);20 nmol/L組細(xì)胞發(fā)生凋亡(P<0.05),0 nmol/L組細(xì)胞明顯發(fā)生凋亡(P<0.01)。與200 nmol/L相比,20 nmol/L組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),0 nmol/L組凋亡率明顯增加(P<0.01)。與20 nmol/L組相比,0 nmol/L組凋亡率明顯增加(P<0.01)(見圖2、表4)。

    表4 不同濃度葉酸培養(yǎng)2周后對細(xì)胞凋亡的影響

    2.5 葉酸對L02細(xì)胞Mad2、Bub1、BubR1 mRNA的表達(dá)量的影響 與正常對照組相比,葉酸濃度為200 nmol/L時,Bub1 mRNA的表達(dá)量增加(P<0.05),Mad2和BubR1 mRNA的表達(dá)量明顯增加(P<0.01);葉酸濃度為20 nmol/L及0 nmol/L時,Mad2、Bub1、BubR1 mRNA的表達(dá)量均明顯增加(P<0.01)(見表5)。

    表5 不同濃度葉酸培養(yǎng)2周后對SAC相關(guān)基因表達(dá)的影響

    2.6 葉酸對L02細(xì)胞Mad2、Bub1、BubR1蛋白表達(dá)的影響 與正常對照組相比,200 nmol/L組Bub1蛋白表達(dá)量增加(P<0.05),20 nmol/L、0 nmol/L組Bub1 蛋白表達(dá)量明顯增加(P<0.01);200 nmol/L、20 nmol/L和0 nmol/L組Mad2和 BubR1蛋白表達(dá)量均明顯增加(P<0.01)(見圖3、表6)。

    表6 不同濃度葉酸培養(yǎng)2周后對SAC相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    3 討論

    相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究顯示[2]葉酸濃度為120 nmol/L時便可維持人淋巴細(xì)胞基因組結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,因此本實(shí)驗(yàn)選取略高于基因組穩(wěn)定的葉酸濃度即200 nmol/L、20 nmol/L、0 nmol/L作為實(shí)驗(yàn)組。CCK8結(jié)果顯示葉酸濃度為200 nmol/L、20 nmol/L、0 nmol/L時葉酸增殖受到了明顯抑制,細(xì)胞周期與凋亡結(jié)果顯示,葉酸濃度為200 nmol/L時,L02細(xì)胞G1/G0期、S期及凋亡率均值與正常對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。葉酸濃度為20 nmol/L、0 nmol/L 細(xì)胞發(fā)生S期阻滯,凋亡數(shù)量增多,且葉酸濃度越低S期阻滯越明顯、細(xì)胞凋亡數(shù)量越多。COURTEMANCHE等[3]的研究顯示葉酸缺乏可以降低細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)凋亡和細(xì)胞周期阻滯,本研究與上述研究結(jié)果相符合。LIANG等[4-5]研究表明葉酸缺乏誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G1/G0期阻滯,從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡,在G1/G0期阻滯與凋亡之間建立了聯(lián)系。HUANG等[6]研究結(jié)果顯示在葉酸缺乏的培養(yǎng)基中HepG2細(xì)胞葉酸濃度較低,細(xì)胞在S期積累隨后發(fā)生G2/M期阻滯,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。低葉酸缺誘導(dǎo)的DNA的損傷程度具有凋亡反應(yīng),這是葉酸缺乏引起細(xì)胞凋亡的原因之一。本研究中,當(dāng)葉酸濃度為20 nmol/L、0 nmol/L時細(xì)胞發(fā)生S期阻滯,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究與上述研究結(jié)果有所不同,本研究結(jié)果顯示葉酸缺乏時細(xì)胞發(fā)生S期阻滯,我們認(rèn)為差生差異的原因可能是由于所用細(xì)胞系、培養(yǎng)細(xì)胞時間不同造成的。

    SAC作為細(xì)胞周期檢查點(diǎn)對于維持細(xì)胞周期正常進(jìn)行至關(guān)重要,Bub1參與染色體排列,Mad2和BubR1通過結(jié)合底物CDC20,阻止CDC20激活A(yù)PC/C以達(dá)到抑制APC/C的效果,防止細(xì)胞提前進(jìn)入后期。SAC作為細(xì)胞周期的監(jiān)控機(jī)制,其某些成分的異常表達(dá)會使SAC功能發(fā)生改變,導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定和非整倍體。對果蠅和小鼠的研究均證實(shí)了SAC在維持染色體穩(wěn)定方面的重要性[7-11],在SAC發(fā)生突變的細(xì)胞中,有絲分裂錯誤的發(fā)生率很高,導(dǎo)致非整倍體細(xì)胞的比例急劇增加[11-12]。在一項(xiàng)宮頸癌研究中[13]發(fā)現(xiàn),下調(diào)Mad2和BubR1可以促進(jìn)SiHa細(xì)胞增長,增強(qiáng)細(xì)胞侵襲和遷移能力,抑制細(xì)胞凋亡,降低藥物治療作用[13]。并且下調(diào)Mad2可以通過調(diào)控磷酸化survivin的活化,調(diào)控胃癌細(xì)胞周期,增加增殖,提高胃癌細(xì)胞的耐藥性[14]。另一項(xiàng)對乳腺癌研究[15]中,與KrasG12D或Her2同時在成年小鼠乳腺中過表達(dá)有絲分裂檢查點(diǎn)蛋白Mad2,會導(dǎo)致有絲分裂檢查點(diǎn)過度激活,過早的Mad2表達(dá)會導(dǎo)致強(qiáng)烈的有絲分裂停止和細(xì)胞死亡增加。用特異性的小干擾RNA敲低紡錘體檢查點(diǎn)蛋白BubR1或Mad2,可顯著減少6,7-二甲氧基-3-(3-甲氧基苯基)異喹啉-1-胺(CWJ-082)誘導(dǎo)的有絲分裂細(xì)胞積累和凋亡[16]。印度的一項(xiàng)藥物研究[17]也顯示,過表達(dá)的Mad2通過恢復(fù)適當(dāng)?shù)暮笃趩雍途S持更多的細(xì)胞存活,部分地挽救了藥物的有害作用。在肝細(xì)胞性癌組織和細(xì)胞中,miR-490-5p的過表達(dá)或Bub1的過表達(dá)抑制了肝細(xì)胞性癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲,增加了凋亡率[18]。缺少Bub1的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞不能使其染色體對齊或維持SAC功能[19]。本研究結(jié)果顯示,葉酸濃度為200 nmol/L、20 nmol/L和0 nmol/L時Mad2、Bub1、BubR1 mRNA的表達(dá)量明顯增加,Western blotting檢測也顯示在蛋白水平上Mad2、Bub1、BubR1表達(dá)量明顯增加。

    結(jié)合上述研究和實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們得出這樣一個結(jié)論:對于SAC來說葉酸濃度為200 nmol/L已經(jīng)達(dá)到一種缺乏狀態(tài),Mad2、Bub1、BubR1的高表達(dá)用于增加SAC的活性,可以維持細(xì)胞有絲分裂進(jìn)行,避免細(xì)胞發(fā)生凋亡。當(dāng)葉酸極度缺乏時(20 nmol/L和0 nmol/L),SAC功能活性受到了嚴(yán)重?fù)p害,Mad2、Bub1、BubR1的高表達(dá)不足以維持其正?;钚?,有絲分裂出現(xiàn)異常,可能導(dǎo)致非整倍體及染色體不穩(wěn)定的發(fā)生,使得細(xì)胞增殖受到抑制,細(xì)胞周期發(fā)生阻滯,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。綜上所述,本研究結(jié)果顯示,對于L02細(xì)胞來說葉酸濃度為200 nmol/L時已經(jīng)達(dá)到一種缺乏狀態(tài),葉酸缺乏時SAC功能異常,可能是阻礙細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡的原因。

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