拔罐對大鼠環(huán)跳穴區(qū)皮膚組織相關神經(jīng)肽及化學物質(zhì)表達變化的影響

劉惠 徐東升 陳虹 王瑩瑩 楊金生

摘要 目的：通過使用免疫組化和共聚焦技術研究拔罐對環(huán)跳穴區(qū)皮膚組織肥大細胞（Mast Cell）、神經(jīng)肽Y（Neuropeptide Y，NPY）及5-羥色胺（5-Hydroxytryptamine，5-HT）的影響。方法：選取10只健康SD大鼠，剃除雙后肢環(huán)跳穴區(qū)毛發(fā)，充分暴露穴區(qū)皮膚組織，在左側環(huán)跳穴進行拔罐干預，拔罐后即刻灌流，并分別取正常大鼠和拔罐大鼠左側穴區(qū)皮膚組織，長寬均為1 cm。使用25%高滲糖脫水后用恒冷箱切片機制成20 μm厚的組織切片，然后分別用Mast Cell、NPY、5-HT抗體進行熒光免疫組化檢測。結果：與正常組比較，拔罐組大鼠環(huán)跳穴區(qū)皮膚組織表皮層明顯增厚，且結構不清，真皮及皮下組織血管擴張擠壓變形，Mast Cell、NPY、5-HT陽性表達明顯增強。Mast Cell和5-HT在表皮和真皮內(nèi)靠近血管和毛囊聚集，在皮下組織中大量散在分布圍繞血管形成不連續(xù)的細胞帶。NPY神經(jīng)纖維在真皮及皮下組織的分布以串珠形式為主，在真皮下層繞血管毛囊匯聚明顯。使用熒光顯微鏡分別在10倍鏡下對5-HT和Mast Cell陽性細胞進行計數(shù)，在20倍顯微鏡下NPY陽性表達纖維的長度進行統(tǒng)計，結果表明拔罐觀察組各項指標均高于正常組，2組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：拔罐能夠使環(huán)跳穴區(qū)皮膚組織中Mast Cell、NPY、5-HT的表達上調(diào)，這些神經(jīng)活性物質(zhì)的釋放可能激活相關信號傳遞通路而實現(xiàn)拔罐的效果。

關鍵詞 拔罐;肥大細胞;神經(jīng)肽Y;5-羥色胺;環(huán)跳;穴區(qū)效應;皮膚組織;實驗研究

Effect of Baguan on the Expression of Neuropeptides and Chemical Substances

in Skin Tissue of “Huantiao”（GB30） Acupoint Area

LIU Hui1，XU Dongsheng2，CHEN Hong3，WANG Yingying2，YANG Jinsheng1

（1 Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang 712046，China; 2 Institute of Acupuncture and Moxibustion，

China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China; 3 The Second Affiliated Hospital

of Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang 712046，China）

Abstract Objective：To investigate the influence of baguan on mast cell neuropeptide Y（NPY），5-Hydroxytryptamine（5-HT） in skin tissue at Huantiao（GB30）by using immunohistochemistry combined with confocal technique.Methods：A total of 10 rat was used in this experiment.Their skin tissue on hind limbs Huantiao（GB30） was exposed by shaving.Subsequently，baguan was carried out on the left side of Huantiao（GB30）.After baguan，the local skin tissue of 1 cm×1 cm on bilateral Huantiao（GB30） of rats were collected，and tissue sections of 20 μ m thickness were prepared by dehydration with 25% hypertonic sugar and sectioning in constant cooling box The Mast Cell、NPY、5-HT antibodies were used for fluorescent immunohistochemical test.Results：Compared with the normal group，the epidermal layer of the skin significantly thickened，with unclear structure，dermis and subcutaneous tissues dilated and extruded，and the positive expressions of Mast Cell，NPY and 5-HT increased significantly.Mast Cell and 5-HT aggregated in close proximity to the blood vessels and hair follicles in intra-epidermis and dermis，and are widely dispersed in subcutaneous tissue layer forming a discrete band of cells surrounding the blood vessels.NPY is distributed in the dermis and subcutaneous tissues in the beads form，and aggregated in close proximity to the blood vessels in the subdermal layer significantly.The markers of 5-HT and Mast Cell positive cells were counted under 10 times microscope，and the length of NPY positive fibers was counted under 20 times of microscope.The results showed that the indexes of baguan group were significantly higher than that of the control group.The difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Baguan plays a role in up-regulating the level of Mast Cell、NPY、5-HT in the local skin tissue at Huantiao（GB30）.These neuroactive substances may convey signals to certain pathways that contribute to the effects of baguan.

Keywords Baguan; Mast Cell; Neuropeptide Y; 5-Hydroxytryptamine; Huantiao（GB30）; Acupoint effect; Skin tissue; Experimental research

中圖分類號：R245文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.05.016

拔罐療法是在傳統(tǒng)中醫(yī)理論指導下，和其他中醫(yī)外治法一樣，以刺激經(jīng)絡循行上具有特定效用的穴位來治療疾病的一種非藥物治療方法[1]。古人最早將拔罐療法稱為“角法”，馬王堆帛書《五十二病方》中就已經(jīng)有使用拔罐療法治療疾病的記載。近年來由于拔罐適應證廣、療效好、見效快，不僅在中國廣泛運用，在國外也引起廣泛關注[3]。現(xiàn)代醫(yī)學目前對于拔罐療法機制的研究開展甚少，而且主要機制研究集中于拔罐對于腧穴局部血流量、氧分壓變化，及其對機體免疫功能影響等方面[4-5]。而對于拔罐過程中腧穴活性物質(zhì)變化的研究更是不足。本研究以SD大鼠為研究對象，采用免疫組織化學結合激光共聚焦技術，觀察正常大鼠皮膚組織和拔罐后皮膚組織中相關神經(jīng)肽及化學物質(zhì)表達的變化，為臨床拔罐治療疾病提供相應的形態(tài)學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級成年雄性健康SD大鼠10只，重量為（220±10）g，由中國中醫(yī)科學院針灸研究所實驗中心提供[實驗動物許可證號為SCKX（軍）2012-004]。整個實驗過程嚴格遵守動物倫理學和美國國立衛(wèi)生研究院的《實驗動物照料和使用指南》，按分組分籠喂養(yǎng)，加食物和水，1次/2 d，同時更換墊料，由同一實驗人員負責動物的日常管理。

1.1.2 試劑與儀器 本實驗所用試劑及儀器見表1、表2。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將10只健康SD大鼠按照隨機數(shù)字表法分為觀察組和正常組，每組5只。觀察組選取大鼠左側環(huán)跳穴進行拔罐干預，正常組除不進行拔罐干預外其他操作與觀察組相同。

1.2.2 干預方法 穴位選擇：定穴參考《實驗針灸學》[6]中大鼠常用穴位定位方法，環(huán)跳穴位于左側后肢髖關節(jié)后上緣，股骨大轉(zhuǎn)子前方凹陷中。罐具選?。簝?nèi)徑（25±2）mm的5號抽氣罐。拔罐干預過程：使用小動物呼吸機對SD大鼠進行麻醉，剔除大鼠環(huán)跳穴區(qū)及周圍毛發(fā)，充分暴露穴區(qū)皮膚組織，并將拔罐部位皮膚用生理鹽水浸濕，后使用抽氣式真空拔罐器對左側環(huán)跳穴區(qū)進行拔罐干預，留罐時間5 min，其間若氣罐出現(xiàn)松動，及時使用拔罐器補充吸力（約每30秒吸拔2次）。正常組不進行拔罐干預，其余操作和觀察組相同。見圖1。

1.2.3 試劑配制 1）0.2 mol/L磷酸緩沖液（Phosphate Buffer，PB）∶磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4·12H2O）、純水。2）0.1～0.2 MPB、純水。3）25%蔗糖溶液∶0.1 MPB、固體蔗糖。4）8%多聚甲醛∶固體多聚甲醛、純水、氫氧化鈉（NaOH）。5）4%多聚甲醛∶8%多聚甲醛、純水。6）封閉液∶3%驢血清、0.5% Triton X-100、0.1 M PB。7）稀釋液∶1%驢血清、0.5% TritonX-100、0.1 M PB。8）一抗稀釋液∶羊抗5-HT抗體（1∶500）;小鼠抗Mast Cell抗體（1∶1 000）;兔抗NPY抗體（1∶500）分別和稀釋液混合。9）二抗稀釋液：Alexa 594熒光素化的驢抗兔二次抗體（1∶500）、Alexa 594熒光素化的驢抗小鼠二次抗體（1∶500）、Alexa 594熒光素化的驢抗羊二次抗體（1∶500）分別與Alexa 488熒光素化的鬼筆環(huán)肽（Pha）（1∶1 000）、核酸特異性熒光染料（DAPI）（1∶50 000）和稀釋液混合。

1.2.4 灌流取材及固定 拔罐干預1次后，對大鼠進行稱重，使用10%烏拉坦進行腹腔麻醉，在麻醉成功的基礎上對大鼠進行灌流取材，大鼠仰面朝上置于試驗臺，做一皮膚的U形切口，快速剪開肋骨及胸腔，暴露心臟。剪開大鼠心尖部，將灌流針頭經(jīng)左心室插入升主動脈，用動脈夾固定心臟與針頭的位置，之后剪開右心耳，灌入生理鹽水至大鼠血液顏色變清亮。按照大鼠體質(zhì)量灌入體質(zhì)量±10 mL的固定液（4%多聚甲醛）灌流結束后在大鼠左后肢環(huán)跳穴區(qū)取1.0 cm×1.0 cm的皮膚組織。將組織放入固定液中后固定2 h，再換至含25%的蔗糖中，置于4 ℃冰箱沉糖脫水后備用。

1.2.5 組織切片制備 將大鼠皮膚組織進行修整，便于包埋痛同時準備陽離子載玻片并對其進行標記編號。將各組大鼠皮膚組織置于包埋槽中（期間注意大鼠皮膚方向），使用包埋劑對組織進行包埋。將包埋槽放置在恒冷箱切片機中使組織凍結，將包埋槽中的組織移至樣本托上，對皮膚組織進行矢狀切片（厚度為20 μm），將組織貼在載玻片上，然后放于4 ℃冰箱陰干。

1.2.6 檢測指標與方法 組織切片使用0.1 mol/L PB清洗，待組織膠清洗干凈后用組化筆在皮膚組織周圍畫圈。將封閉液用移液器滴加到組織切片上，室溫孵育1 h，其間配置一抗稀釋液，1 h后移去封閉液，分別滴加5-HT、Mast Cell、NPY抗體的一抗稀釋液，并將裝有組織切片的濕盒置于4 ℃冰箱中過夜。第2天使用0.1 M PB清洗3次，陰干后分別加入相應二抗稀釋液，在室溫環(huán)境下放置2 h后使用0.1M PB清洗3次，洗凈二抗后陰干組織切片。在載玻片上滴加少量50%甘油，蓋上蓋玻片后皮膚標本制作完成（加入二抗后的操作過程注意避光）。

固定好的皮膚組織使用熒光顯微鏡進行觀察和計數(shù)，使用共聚焦顯微鏡拍照。拍好的圖片使用Adobe Photoshop CS2、Adobe Illustrator CS6軟件進行標注和編輯。使用熒光顯微鏡在10倍視野下選取12個面積相同的區(qū)域進行2組皮膚標本的Mast Cell、5-HT進行計數(shù);在20倍視野下對NPY陽性表達纖維的長度進行統(tǒng)計，完成統(tǒng)計后使用GraphPad Prism 6軟件制作條形圖。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料使用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間數(shù)據(jù)比較使用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 拔罐對SD大鼠環(huán)跳穴區(qū)皮膚組織5-HT表達的影響 環(huán)跳穴區(qū)局部皮膚組織的表皮層、真皮層、皮下組織均有5-HT陽性標記，拔罐干預后皮膚組織（圖2B）與正常皮膚組織（圖2A）比較，表皮層明顯增厚，且結構不清，真皮及皮下組織血管擴張擠壓變形，同時5-HT陽性表達增多，呈明顯的血管毛囊趨向性。

2.2 拔罐對SD大鼠環(huán)跳穴區(qū)皮膚組織NPY表達的影響 NPY神經(jīng)纖維在真皮及皮下組織的分布以串珠形式為主，在真皮淺層靠近表皮的部分則以散在游離分布為主，在真皮深層圍繞血管和毛囊走行分布。與正常組織（圖4A）比較，拔罐組織（圖4B）NPY表達明顯增強，在真皮下層血管匯聚明顯。

2.3 拔罐對SD大鼠環(huán)跳穴區(qū)皮膚組織Mast Cell表達的影響 環(huán)跳穴區(qū)局部正常皮膚組織（圖6A）中Mast Cell在表皮和真皮上層鮮少分布，在真皮下層繞血管毛囊散在分布，拔罐后（圖6B）在表皮和真皮內(nèi)靠近血管和毛囊聚集，在皮下組織中大量散在分布并伴有脫顆?，F(xiàn)象，圍繞血管形成不連續(xù)的細胞帶。

3 討論

3.1 SD大鼠拔罐的參數(shù)確定 通過對國內(nèi)外相關文獻的歸類分析，發(fā)現(xiàn)目前關于拔罐基礎實驗研究的文獻較少，分析原因可能是由于對動物皮膚特點與人有一定差異性，對拔罐操作有所影響所致。查閱與拔罐實驗研究相關文獻后得出，目前用于拔罐的實驗動物主要為小型豬、兔、大鼠等，本研究選取SD大鼠，在空氣麻醉狀態(tài)下對大鼠進行拔罐干預，探索拔罐后穴區(qū)化學物質(zhì)的變化情況。在臨床、教材以及拔罐技術操作規(guī)范國家標準中拔罐的留罐時間較多界定為10～15 min，但實際操作過程中考慮到大鼠皮膚具有彈性大并缺乏與皮下組織牢固結合的特點[7]，預實驗時選擇適當力度能夠使罐體吸附住的情況下，采用不同的留罐時間3、5、10 min進行比較，結果表明留罐3 min后與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義;留罐10 min后皮下組織疏松水腫，皮下可見片狀出血，不利于進一步的形態(tài)學觀察。故本實驗選擇留罐5 min后比較2組之間的差異。

3.2 拔罐干預后Mast Cell、5-HT、NPY的變化 研究發(fā)現(xiàn)，拔罐后大鼠皮膚表皮層增厚，部分大鼠出現(xiàn)角質(zhì)層脫落，觀察時在表皮上方顯示出強熒光帶，而且穴區(qū)局部皮膚組織中的Mast Cell、5-HT、NPY表達發(fā)生明顯的變化。HT作為神經(jīng)遞質(zhì)和免疫調(diào)節(jié)因子，負責激活感覺神經(jīng)末梢，針刺、艾灸、刮痧、拔罐等操作可能會引起代償性（突觸后）改變，可能導致細胞外5-HT功效增強[8-9]，參與后續(xù)疼痛信息的傳導。NPY在皮膚中均屬于神經(jīng)肽，是主要存在于皮膚組織中的感覺神經(jīng)[10]，具有維持皮膚正常感覺和對傷害性刺激感受[11-13]的功能，且這些穴區(qū)神經(jīng)纖維和Mast Cell對體表刺激有反應，體表刺激可誘導SP、NPY和CGRP的痛覺神經(jīng)肽在皮下神經(jīng)纖維中高表達，進而激活Mast Cell。Mast Cell聚集并脫顆粒，又可釋放胰蛋白酶、5-HT和HA，共同參與痛覺過敏、神經(jīng)免疫相互作用和組織炎癥反應等[14-16]。5-HT、Mast Cell和NPY的變化，與課題組觀察刮痧刺激后產(chǎn)生的變化基本類似[17]，提示刮痧、拔罐均為體表刺激，在臨床應用時同一部位疊加使用的可行性與必要性。

本研究證實，拔罐對大鼠環(huán)跳穴區(qū)的物理性機械刺激，可導致局部皮膚組織出現(xiàn)一定程度的充血、水腫等，提示拔罐可能對局部皮膚組織產(chǎn)生良性刺激[18]，同時對Mast Cell、5-HT和NPY表達變化產(chǎn)生顯著影響，可改善局部微循環(huán)，并通過影響Mast Cell、5-HT和NPY等化學物質(zhì)的表達產(chǎn)生持續(xù)弱刺激，形成級聯(lián)反應，進而影響整體微循環(huán)，產(chǎn)生拔罐的通絡效應，達到治療疾病的效果[19]。拔罐后穴區(qū)這些化學成分的增加提示其可能參與了拔罐作用信息的傳遞過程，為我們進一步研究拔罐效應的神經(jīng)生物學機制提供科學依據(jù)。

拔罐作為一種體表刺激，可以改變大鼠局部皮膚的組織形態(tài)，拔罐時使用適度的吸附力度和留罐時間，其產(chǎn)生的皮膚組織形態(tài)改變是一種可自我修復的短暫改變，具有安全性。本研究主要以穴區(qū)皮膚化學物質(zhì)的形態(tài)學描述為主，而對其含量的分析研究相對不足。下一步研究將繼續(xù)測定其形態(tài)學的分布趨勢，同時對于拔罐穴區(qū)皮膚組織中的Mast Cell、NPY、5-HT含量的變化也將做進一步的檢測和研究。

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（2020-04-14收稿 責任編輯：芮莉莉）

基金項目：國家自然科學基金項目（81674079）;北京市自然科學基金項目（7172149）

作者簡介：劉惠（1994.07—），女，碩士研究生，研究方向：中醫(yī)外治法研究，E-mail：1837595345@qq.com

通信作者：楊金生（1964.02—），男，博士，主任醫(yī)師，研究方向：針灸標準化及中醫(yī)外治法研究，E-mail：zml@ibucm.com;王瑩瑩（1981.02—），女，博士，主任醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)外治法及針刺戒煙方案研究，E-mail：yyw261206@126.com