羊蜱蠅攜帶巴爾通體和斑點(diǎn)熱群立克次體PCR檢測(cè)及遺傳關(guān)系分析

向 陽(yáng)，袁東波，侯 巍，莫 茜，尹 杰，陽(yáng)愛(ài)國(guó)，郝力力*

(1. 西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041； 2. 四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，成都 610041)

羊蜱蠅(Melophagusovinus)，屬昆蟲(chóng)綱(Insecta)、雙翅目(Diptera)、虱蠅科(Hippoboscidae)、蜱蠅屬(Melophagus)[1]。羊蜱蠅是一種以吸食宿主血液為生的體外寄生蟲(chóng)，除熱帶地區(qū)外，廣泛分布于世界各地。羊蜱蠅通常寄生在綿羊體表，有報(bào)道稱羊蜱蠅的宿主范圍有擴(kuò)大趨勢(shì)，可寄生于人類以及更廣泛的家畜(綿羊、藏綿羊、山羊和犬)，野生動(dòng)物(歐洲野牛、藏羚羊、野兔和紅狐)[2-3]。藏綿羊感染羊蜱蠅后，一方面，降低生產(chǎn)性能；另一方面，作為傳播媒介可儲(chǔ)存或傳播巴爾通體、立克次體、藍(lán)舌病病毒、綿羊無(wú)漿體、錐蟲(chóng)等病原[4]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)僅在甘肅、新疆、遼寧、青海和西藏部分地區(qū)有少量報(bào)道[5]。

巴爾通體(Bartonella)是一類兼性胞內(nèi)寄生的多形態(tài)革蘭陰性菌，可感染人、牛、羊、鼠等多種哺乳動(dòng)物，世界各地均有分布。巴爾通體病作為新發(fā)人畜共患病，已被列入國(guó)家新發(fā)傳染病目錄。巴爾通體主要寄生于動(dòng)物的上皮細(xì)胞和紅細(xì)胞中，可經(jīng)跳蚤、蜱蟲(chóng)、白蛉、羊蜱蠅等吸血昆蟲(chóng)傳播[6]。斑點(diǎn)熱群立克次體(spotted fever group rickettsiae，SFGR)是一類專性胞內(nèi)寄生的多形態(tài)革蘭陰性菌，可經(jīng)蜱蟲(chóng)、螨蟲(chóng)、跳蚤等吸血昆蟲(chóng)傳播，世界各地均有分布[7]。目前，已證實(shí)自然界存在15種以上的巴爾通體和16種以上的斑點(diǎn)熱群立克次體對(duì)人有致病性，包括Bartonellamelophagi、B.henselae、B.elizabethae和B.rochalima[6]，Rickettsiaraoultii、R.slovaca、R.felis、R.aeschlimannii和R.massiliae[8]等，這些病原具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。本教研室前期曾就石渠縣牦牛源蜱感染巴爾通體和斑點(diǎn)熱群立克次體開(kāi)展分子流行病學(xué)調(diào)查，但未對(duì)石渠縣羊蜱蠅是否也攜帶這2類病原進(jìn)行調(diào)查[9-10]。因此，本研究以石渠縣藏綿羊體表寄生的羊蜱蠅為研究對(duì)象開(kāi)展調(diào)查，以期進(jìn)一步掌握巴爾通體和斑點(diǎn)熱群立克次體感染情況，為當(dāng)?shù)厝双F共患病的防控提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 羊蜱蠅采集 2018年6—8月，分別在四川省石渠縣阿日扎鎮(zhèn)、呷衣鄉(xiāng)、新榮鄉(xiāng)和長(zhǎng)沙貢馬鄉(xiāng)4個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的96只藏綿羊體表采集羊蜱蠅，樣本采集點(diǎn)見(jiàn)圖1。分別從21、25、25、25只藏綿羊體表采集到羊蜱蠅96、87、121、103只，共計(jì)407只，按照地點(diǎn)分別裝入收集管，塞入潮濕脫脂棉。將蟲(chóng)體送至西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院動(dòng)物寄生蟲(chóng)教研室，浸于75%乙醇溶液后置4 ℃冰箱內(nèi)保存待用。

圖1 石渠縣樣本采集點(diǎn)位置

1.1.2 主要試劑 組織基因組DNA提取試劑盒(EasyPure Genomic DNA Kit)、1 (TAE溶液、2 (Easy Taq PCR SuperMix、核酸染色劑、瓊脂糖和DNA Marker均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；巴爾通體陽(yáng)性對(duì)照(B.melophagi)和斑點(diǎn)熱群立克次體陽(yáng)性對(duì)照(R.slovaca)由西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院動(dòng)物寄生蟲(chóng)教研室保存，引物合成及測(cè)序均由生工生物工程(成都)有限公司完成。

1.1.3 主要儀器 體視顯微鏡(Leica S9D)，多功能生物樣品均質(zhì)器(Bertin Precellys 24)，臺(tái)式高速離心機(jī)(Eppendorf 5402型)，Bio-Rad伯樂(lè)梯度PCR擴(kuò)增儀(RTC240型)，電泳儀(DYY-6C型)，全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(Tanon-5200 Multi)。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 根據(jù)《中國(guó)經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)志》(第三十九冊(cè))[11]及《中國(guó)畜禽寄生蟲(chóng)形態(tài)分類圖譜》[12]，在體視顯微鏡下觀察羊蜱蠅形態(tài)學(xué)特征并拍照。

1.2.2 DNA提取 將羊蜱蠅從75%乙醇溶液中取出，無(wú)菌水沖洗3次。無(wú)菌濾紙吸干，沿縱向中軸線對(duì)剖，分別裝入EP管。取半只加入500 μL無(wú)菌水，置于Bertin Precellys 24研磨器進(jìn)行充分研磨，參數(shù)設(shè)置如下：每管加入陶瓷珠(直徑0.5 mm的20珠、直徑2 mm的5珠)，5 500 g研磨2次；4 000 g 研磨1次。取研磨液200 μL，根據(jù)組織基因組DNA提取試劑盒(EasyPure Genomic DNA Kit)使用說(shuō)明書提取DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ａ硗獍胫恢?80 ℃冰箱凍存。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 巴爾通體和斑點(diǎn)熱群立克次體的分子鑒定分別采用Norman[13]、Paziewska[14]、Oteo[15]、Fernndez[16]等報(bào)道的方法，引物信息見(jiàn)表1。4對(duì)引物擴(kuò)增的總體系均為25 μL：模板1 μL(2～3 ng)， 上下游引物各1 μL(10 μmol·L-1)，PCR Supermix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。每個(gè)PCR反應(yīng)均設(shè)置1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照(B.melophagi或R.slovaca)和1個(gè)陰性對(duì)照(ddH2O)。PCR的反應(yīng)程序：92 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸7 min。 取2 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠中100 V電泳30 min，所得PCR陽(yáng)性產(chǎn)物送至生工生物工程(成都)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 巴爾通體和立克次體PCR引物信息

1.2.4 序列分析及統(tǒng)計(jì)分析 將所得序列用DNA Star V.7.1.0進(jìn)行拼接與分析，在NCBI中使用BLAST對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，再應(yīng)用MEGA 6. 0軟件以鄰接法(bootstrap值為1 000)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并以Kimura 2-parameter模型計(jì)算序列間的遺傳距離。采用SPSS 20. 0(皮爾森卡方檢驗(yàn))比較不同采樣地點(diǎn)巴爾通體和立克次體感染率的差異，P≤0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 羊蜱蠅采集數(shù)量及形態(tài)觀察

在阿日扎鎮(zhèn)，86只藏綿羊中有21只感染了羊蜱蠅；在呷衣鄉(xiāng)，60只藏綿羊中有25只被感染；在新榮鄉(xiāng)，98只藏綿羊中有25只被感染；在長(zhǎng)沙貢馬鄉(xiāng)，137只藏綿羊中有25只被感染。在4個(gè)采樣點(diǎn)96只藏綿羊體表共采集到羊蜱蠅成蟲(chóng)407只，未采集到羊蜱蠅蛹及幼蟲(chóng)。羊蜱蠅的形態(tài)特征如圖2所示。

A. 雌性羊蜱蠅背面；B. 雌性羊蜱蠅腹面；C. 雄性羊蜱蠅背面；D. 雄性羊蜱蠅腹面

2.2 巴爾通體gltA、rpoB基因的PCR擴(kuò)增

以“1.2.2”中提取的羊蜱蠅組織DNA為模板，分別擴(kuò)增巴爾通體gltA、rpoB基因片段，長(zhǎng)沙貢馬鄉(xiāng)部分樣本電泳如圖3所示，片段大小分別約356、379 bp，與預(yù)期相符。

M. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 陽(yáng)性對(duì)照；2～9(左圖)、2～8(右圖). 羊蜱蠅樣本；10(左圖)、9(右圖). 陰性對(duì)照

2.3 巴爾通體gltA、rpoB基因的遺傳進(jìn)化分析

所有的巴爾通體陽(yáng)性產(chǎn)物均進(jìn)行了測(cè)序，使用DNA STAR軟件將所得巴爾通體gltA基因和rpoB基因序列進(jìn)行拼接、兩兩比對(duì)后得到1條gltA和5條rpoB的unique序列，分別上傳GenBank，得到對(duì)應(yīng)序列號(hào)(gltA：MN644897；rpoB：MN644898～MN644902)。分別選取不同種的巴爾通體和BLAST比對(duì)后相似性最高的gltA基因和rpoB基因序列等作為參考序列，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。如圖4所示，從羊蜱蠅中檢測(cè)到的MN644897與美國(guó)內(nèi)華達(dá)州分離到的B.melophagi(AY724768)聚為1支，親緣關(guān)系最近，相似性為100.0%。從羊蜱蠅中檢測(cè)出的5條unique序列(MN644898～MN644902)與分離自美國(guó)西南部的B.melophagi(EF605288)聚為1支，相似性為98.8%～100.0%。參照La Scola等[17]建立的巴爾通體判定標(biāo)準(zhǔn)(gltA≥ 96.0%、rpoB≥ 95.4%)，本研究?jī)H檢出了B.melophagi。見(jiàn)表2。

圖4 基于gltA (A)、rpoB (B) 基因巴爾通體系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.4 立克次體OmpA、OmpB基因的PCR擴(kuò)增

以“1.2.2”中提取的羊蜱蠅組織DNA為模板，分別擴(kuò)增立克次體OmpA、OmpB基因片段，長(zhǎng)沙貢馬鄉(xiāng)部分樣本電泳如圖5所示，片段大小分別約530、618 bp，與預(yù)期相符。

M. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 陽(yáng)性對(duì)照；2～10(左圖)、2～9(右圖). 羊蜱蠅樣本；11(左圖)、10(右圖). 陰性對(duì)照

2.5 立克次體OmpA、OmpB基因的遺傳進(jìn)化分析

所有的立克次體陽(yáng)性產(chǎn)物均進(jìn)行了測(cè)序，使用DNA STAR軟件將所得立克次體OmpA基因和OmpB基因序列進(jìn)行拼接、兩兩比對(duì)后得到4條OmpA和4條OmpB的unique序列，分別上傳GenBank，得到對(duì)應(yīng)序列號(hào)(OmpA：MN644903～MN644906；OmpB：MN644907～MN644910)。分別選取不同種的立克次體和BLAST比對(duì)后相似性最高的OmpA基因和OmpB基因序列等作為參考序列，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。如圖6所示，OmpA基因序列分析表明序列MN644904～MN644906與R.raoultii(JQ792162和JQ792137)親緣關(guān)系最近，相似性為99.8%～100.0%。MN644903與從韓國(guó)分離到的CandidatusR.longicornii(MG906676)以及從青海分離到的unculturedRickettsiasp.(MG228270)序列相似性分別為98.2%、100.0%。OmpB基因序列分析表明序列(MN644907～MN644908)與R.raoultii(DQ365798)序列相似性為99.3%～99.5%；序列(MN644909～MN644910)與從韓國(guó)分離的CandidatusR.longicornii(MG906675)具有99.5%～100.0%的相似性。

圖6 基于OmpA (A)、OmpB (B) 基因立克次體系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.6 巴爾通體、斑點(diǎn)熱群立克次體的PCR檢測(cè)

本試驗(yàn)中，首先使用gltA基因?qū)ρ蝌缦墧y帶的巴爾通體進(jìn)行初篩，然后使用rpoB基因篩選gltA基因陽(yáng)性樣本。在407只羊蜱蠅中，有57只檢出了巴爾通體，感染率為14.0%(57/407)。在本次調(diào)查的4個(gè)鄉(xiāng)(鎮(zhèn))中，長(zhǎng)沙貢馬鄉(xiāng)感染率最高，達(dá)16.5%，其余依次為新榮鄉(xiāng)15.7%、阿日扎鎮(zhèn)12.5%、呷衣鄉(xiāng)10.3%。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，不同鄉(xiāng)(鎮(zhèn))之間羊蜱蠅攜帶巴爾通體的感染率差異不顯著(P>0.05)，見(jiàn)表2。

OmpA是斑點(diǎn)熱群立克次體的特異性蛋白基因，參照Fournier等[18]建立的斑點(diǎn)熱群立克次體判定標(biāo)準(zhǔn)，若檢出OmpA即可直接判定為斑點(diǎn)熱群立克次體，若未檢出則需符合以下4項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)中的2項(xiàng)：OmpB相似性>85.8%、gltA相似性>92.7%、geneD相似性>82.2%、16S rRNA相似性>98.8%。該判定標(biāo)準(zhǔn)是本研究將OmpA、OmpB基因作為靶基因檢測(cè)斑點(diǎn)熱群立克次體的依據(jù)。調(diào)查結(jié)果顯示本研究中R.raoultii的感染率為11.1%(45/407)，見(jiàn)表2。在調(diào)查的4個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)中，在阿日扎鎮(zhèn)、呷衣鄉(xiāng)和長(zhǎng)沙貢馬鄉(xiāng)均檢出了R.raoultii，感染率分別為6.3%、16.1%和24.3%。結(jié)果顯示，長(zhǎng)沙貢馬鄉(xiāng)羊蜱蠅攜帶R.raoultii的感染率(表2中以“*”標(biāo)記)顯著高于阿日扎鎮(zhèn)和呷衣鄉(xiāng)羊蜱蠅攜帶R.raoultii的感染率(P<0.05)。Rickettsiasp.與CandidatusRickettsialongicornii親緣關(guān)系密切，并僅在新榮鄉(xiāng)的樣本中檢出，感染率為6.6%(8/121)。在本研究中，沒(méi)有觀察到B.melophagi、R.raoultii和Rickettsia.sp.混合感染。

表2 石渠縣羊蜱蠅攜帶巴爾通體及斑點(diǎn)熱群立克次體的感染率

3 討 論

在本研究中使用rpoB和gltA基因?qū)ρ蝌缦墧y帶的巴爾通體進(jìn)行了鑒定，首次在分子水平上證實(shí)了石渠縣藏綿羊源羊蜱蠅存在B.melophagi感染。龍露等[19]對(duì)中國(guó)巴爾通體屬系統(tǒng)發(fā)育多樣性的分析結(jié)果顯示中國(guó)至少存在包含B.melophagi在內(nèi)的11個(gè)巴爾通體可感染人類。2007年，Bemis等[20]從美國(guó)商品化脫纖維羊血中檢出了B.melophagi。2009年，Maggi等[21]從2名有動(dòng)物接觸史的病人的血液中分離出B.melophagi。近年來(lái)，在美國(guó)[22]、歐洲中部[23]和埃塞俄比亞[24]等國(guó)家和地區(qū)相繼報(bào)道了從羊蜱蠅中檢出B.melophagi。截至目前，尚未見(jiàn)石渠縣有關(guān)B.melophagi在羊蜱蠅中的報(bào)道。本研究從石渠縣的407個(gè)羊蜱蠅樣本中共檢出57例巴爾通體，陽(yáng)性率為14.0%，經(jīng)鑒定均為B.melophagi。本研究的檢測(cè)結(jié)果低于周賽賽等[25]報(bào)道的西藏綿羊體表羊蜱蠅中B.melophagi的感染率(48.0%)、何波[26]報(bào)道的新疆及甘肅部分地區(qū)綿羊體表羊蜱蠅中B.melophagi的感染率(95.0%)和Liu等[5]報(bào)道的在南疆地區(qū)綿羊體表羊蜱蠅中B.melophagi的感染率(88.6%)。

巴爾通體具有不完全的宿主特異性，如B.elizabethae、B.vinsoniisubsp.Arupensis僅在嚙齒類動(dòng)物中被檢出，B.vinsoniisubsp.Berkhoffii僅在犬科動(dòng)物中被檢出，B.alsatic僅在兔中被檢出[27-29]。本研究從藏綿羊源羊蜱蠅中檢出的巴爾通體經(jīng)鑒定均為B.melophagi，未檢出其他種的巴爾通體。2019年唐天才等[10]在石渠縣牦牛源西藏革蜱和青海血蜱中也僅檢出了B.melophagi；2019年赫秀甜等[30]在四川省松潘縣牦牛源青海血蜱中同樣也僅檢出了B.melophagi，但在當(dāng)?shù)氐母咴笸弥袡z出了B.queenslandens、B.grahamii和Bartonellasp. 3種巴爾通體，未檢出B.melophagi。這表明羊蜱蠅和蜱等吸血節(jié)肢動(dòng)物可能是B.melophagi的最適宜宿主，而高原鼠兔等嚙齒類動(dòng)物可能并非是B.melophagi的最適宜宿主。

本研究首次在分子層面上證實(shí)了藏綿羊源羊蜱蠅攜帶R.raoultii。R.raoultii于1999年首次報(bào)道于前蘇聯(lián)，隨后在蒙古國(guó)、德國(guó)、意大利等地相繼報(bào)道[31]，在中國(guó)，R.raoutlii-like bacteria首次被報(bào)道于西藏[32]。R.raoutlii已被證實(shí)可感染人：2002年，8名法國(guó)人感染R.raoutlii[7]；2012年，在中國(guó)牡丹江從2名被蜱蟲(chóng)叮咬的患者的血液中檢出了R.raoutlii[33]；2015—2016年，內(nèi)蒙古、河南和山東報(bào)道了26例人感染R.raoutlii的病例[34]。目前，R.raoultii主要是在蜱中被檢出，常見(jiàn)于蜱蟲(chóng)中的鈍眼蜱屬、血蜱屬、硬蜱屬、革蜱屬、扇頭蜱屬[35]。在本研究中，有3個(gè)鄉(xiāng)的樣本中檢出了R.raoultii，感染率為6.3%～24.3%，顯著低于本教研室報(bào)道的石渠縣麻甲鄉(xiāng)、德榮瑪鄉(xiāng)、阿日扎鎮(zhèn)及長(zhǎng)須干瑪鄉(xiāng)4個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)牦牛源蜱(西藏革蜱和青海血蜱)中R.raoutlii的感染率(42.8%～58.3%)[9]。這可能是因?yàn)橄鄬?duì)羊蜱蠅而言，R.raoutlii更適合在蜱內(nèi)生存。此外，本次調(diào)查的立克次體陽(yáng)性樣本中存在6.6%(8/121)的未定種立克次體，后期本教研室擬將對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，分離純化后應(yīng)用多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST)等方法，基于立克次體多個(gè)基因(17 kDa、rrs、OspA和groEL)在種的水平上做進(jìn)一步鑒定。

在石渠縣，羊蜱蠅可能在藏綿羊間B.melophagi和R.raoultii的傳播過(guò)程中扮演了重要的角色。飼養(yǎng)方式粗放、牧民防護(hù)意識(shí)淡薄以及獸醫(yī)專業(yè)人員缺乏等因素都可能是造成當(dāng)?shù)匮蝌缦塀.melophagi和R.raoultii高感染率的原因。因此，接下來(lái)擬開(kāi)展進(jìn)一步的研究，一是擴(kuò)大調(diào)查范圍和樣本數(shù)量，二是密切關(guān)注當(dāng)?shù)啬撩袷欠裼邪l(fā)病的報(bào)道，以確定羊蜱蠅和藏綿羊在石渠縣B.melophagi和R.raoultii傳播中的確切作用。

3 結(jié) 論

石渠縣4個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)共采集到羊蜱蠅成蟲(chóng)407只。4個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的樣品均檢出了Bartonellamelophagi，(總感染率為14.0%)；阿日扎鎮(zhèn)、呷衣鄉(xiāng)和長(zhǎng)沙貢馬鄉(xiāng)檢出了Rickettsiaraoultii(總感染率為11.1%)；新榮鄉(xiāng)檢出了Rickettsiasp. (感染率為6.6%)。未發(fā)現(xiàn)混合感染。