特異性識別K1莢膜大腸桿菌的噬菌體PNJ1809-36生物學(xué)特性及全基因組分析

鞏倩雯，李一昊，曾 頏，于沛欣，錢新杰，王瑜欣，戴建君，湯 芳

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 教育部動物健康與食品安全國際聯(lián)合實驗室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部細(xì)菌學(xué)重點實驗室， 南京 210095)

大腸桿菌(Escherichiacoli)為埃希菌屬(Escherichia)代表菌，它包括動物或人共生菌株和致病性菌株，致病性菌株又分為腸道致病菌株和腸道外致病菌株[1]。腸道致病性菌株有產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌等，可以引起人和動物的腸炎和腹瀉[2]，某些血清型甚至?xí)?dǎo)致死亡[3]。腸道外致病性菌株能引起人或動物的腸道外感染，如引起人或動物的尿路感染[4]，新生兒腦膜炎及敗血癥以及禽的呼吸系統(tǒng)疾病從而導(dǎo)致禽的急性死亡。致病性大腸桿菌給人和動物健康造成危害，也給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的損失。

大腸桿菌有4種表面抗原：O、K、H和F抗原，分別為脂多糖抗原、莢膜多糖抗原、鞭毛抗原和菌毛抗原。4種表面抗原是對大腸桿菌進(jìn)行分型的基礎(chǔ)，也是重要的毒力因子。K抗原是大腸桿菌重要的毒力因子之一[5]，可能存在于莢膜、被膜或菌毛中。目前已發(fā)現(xiàn)的K抗原有80多種，其中K1莢膜抗原備受關(guān)注。引起新生兒細(xì)菌性腦膜炎的腸道外致病性大腸桿菌大多有K1莢膜，它能夠穿過血腦屏障致病，而K1莢膜則是主要致病因子[6]。具有K1莢膜的大腸桿菌能夠抵抗補(bǔ)體殺菌作用，增強(qiáng)其在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的存活，從而減弱巨噬細(xì)胞對細(xì)菌的吞噬能力[7-8]。Mellata等[9]構(gòu)建了K1基因缺失株，發(fā)現(xiàn)缺失株的增殖能力大大降低。目前，針對細(xì)菌性腦膜炎已經(jīng)有治療方案，但經(jīng)治療后也會伴有神經(jīng)后遺癥及發(fā)育異常[10]。盡管使用了先進(jìn)的抗生素，但與大腸桿菌K1引起的腦膜炎相關(guān)的疾病發(fā)病率和死亡率在過去幾十年中并沒有下降[11-12]。另外，由于近年來耐藥性大腸桿菌K1菌株的數(shù)量激增，死亡率可能會進(jìn)一步增加[13]。

近年來，噬菌體治療被認(rèn)為是能夠緩解細(xì)菌多重耐藥的有效方案之一。噬菌體具有分布廣泛、種類多樣、宿主特異性強(qiáng)等特點，可作為治療細(xì)菌感染的新型生物制劑。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種具有多糖專一性的噬菌體，可以特異性降解細(xì)菌胞外多糖，從而使細(xì)菌毒力下降。K1專一性噬菌體可以特異性降解K1莢膜的多聚唾液酸，從而使細(xì)菌毒力減弱[14]。同時，這些噬菌體可用于大腸桿菌的分型[15]。本研究分離得到可裂解K1莢膜大腸桿菌的噬菌體PNJ1809-36，并對其進(jìn)行生物學(xué)特性和全基因組分析，期望為臨床疾病治療和細(xì)菌防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)菌及樣品 大腸桿菌DE058及其他用于宿主譜檢測的大腸桿菌(表1)均為本實驗室保存。用于分離噬菌體的樣品為采集自青龍山養(yǎng)殖場的雞糞。

1.1.2 實驗儀器及試劑 參照《分子克隆實驗指南》第3版[16]配制LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基以及SM緩沖液。LB培養(yǎng)基所用試劑購自北京索萊寶科技有限公司；NaCl、MgSO4·7H2O購自市科密歐化學(xué)試劑有限公司；酶標(biāo)儀為TECAN NanoQuant PlateTM；電子透射顯微鏡為日立H7650。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體分離和純化 參考Jamalludeen等[17]的方法對采集的雞糞樣品進(jìn)行噬菌體分離與純化：用棉簽蘸取適量雞糞，放入含有SM液的EP管中4 ℃浸泡過夜。將該樣品5 000g離心10 min，隨后將上清用0.45 μm的濾器過濾，所得濾液在涂有大腸桿菌的平板上點樣，然后將平板置于37 ℃溫箱培養(yǎng)過夜，次日觀察平板上是否有空斑。如有空斑出現(xiàn)，則用雙層平板法對噬菌體進(jìn)行純化：將宿主菌與該濾液各取100 μL混合，37 ℃靜置10 min后，將該混合液加入含0.5%瓊脂的LB半固體培養(yǎng)基中，混合均勻后鋪在LB固體平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜，次日觀察噬菌斑。隨后用一次性無菌槍頭吸取單個空斑，放入含有SM液的EP管中4 ℃ 浸泡過夜，使其中的噬菌體充分釋放。將該SM液與宿主菌各取100 μL混合，再用雙層平板法培養(yǎng)噬菌體，重復(fù)該過程5次，直至平板上形成清晰、透明、大小一致的噬菌斑。取5 mL SM液加入該平板，4 ℃浸泡過夜，次日收集平板上的SM液，5 000g離心10 min，上清用0.22 μm濾器過濾，所得濾液即為純化的噬菌體，將其保存在4 ℃條件下備用。

1.2.2 電鏡觀察 將保存的噬菌體用雙層平板法富集并過濾，用2%的磷鎢酸(PTA)進(jìn)行負(fù)染，使用透射電子顯微鏡觀察噬菌體的形態(tài)。

1.2.3 宿主譜分析 使用雙層平板法進(jìn)行宿主譜分析。取100 μL培養(yǎng)至對數(shù)期的108株E.coli待檢菌培養(yǎng)液與100 μL噬菌體或PBS混合后鋪雙層瓊脂平板，PBS作為陰性對照。待平板晾干后，將其置于37 ℃ 溫箱培養(yǎng)5～6 h，記錄結(jié)果。

1.2.4 K1莢膜型大腸桿菌的鑒定 對用于宿主譜鑒定的細(xì)菌進(jìn)行K1莢膜的鑒定。以F(上游引物)：5′-CATCCAGACGATAAGCATGAGCA-3′，R(下游引物)：5′-GCGCATTTGCTGATACTGTTG-3′為鑒定K1莢膜的特異性引物[18]，使用PCR方法對宿主譜中的細(xì)菌進(jìn)行K1型莢膜鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物長度約為270 bp。PCR反應(yīng)體系包括12.5 μL GreenTaqMix(Vazyme)，上、下游引物各1 μL，超純水 8.5 μL，菌液模板2 μL。PCR擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。取7 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定目的條帶。

1.2.5 最佳感染復(fù)數(shù)的檢測 參照Carey-Smith等[19]的方法進(jìn)行噬菌體的感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)的檢測。將細(xì)菌培養(yǎng)至濃度約為3×108CFU·mL-1，用LB液體培養(yǎng)基稀釋10倍。取不同稀釋濃度的噬菌體和濃度為3×107CFU·mL-1的宿主菌各200 μL，按照感染復(fù)數(shù)分別為0.001、0.01、0.1、1、10和100的比例混合，37 ℃，180 r·min-1震蕩培養(yǎng)5 h，10 000g離心8 min， 收集上清并用0.22 μm濾器過濾。將濾液進(jìn)行梯度稀釋后，用雙層平板法測定噬菌體效價，效價最高的感染復(fù)數(shù)即為最佳感染復(fù)數(shù)(optimal multiplicity of infection)。

1.2.6 一步生長曲線測定 參照Ellis等[20]的方法測定噬菌體PNJ1809-36的一步生長曲線。取噬菌體和細(xì)菌各1 mL按照最佳MOI混合，37 ℃靜置10 min，然后10 000g離心10 min，并用2 mL LB液體培養(yǎng)基洗滌沉淀2次，以去除沒有吸附在細(xì)菌上的噬菌體，隨后用預(yù)熱好的5 mL LB液體培養(yǎng)基重懸沉淀，迅速置于37 ℃搖床震蕩培養(yǎng)。將置于37 ℃搖床震蕩開始的時間記為T0，每隔5 min或10 min取樣1次，分別在T0、T5、T10、T15、T20、T30、T40、T50、T60、T70、T80、T90、T100、T110、T120各取混合液100 μL，用雙層平板法測定噬菌體效價。試驗重復(fù)3次。試驗結(jié)果以時間為橫坐標(biāo)，噬菌體的滴度為縱坐標(biāo)，繪制一步生長曲線。

1.2.7 溫度及酸堿敏感性測定 參照文獻(xiàn)[21]描述的方法進(jìn)行噬菌體溫度及酸堿敏感性測定。向每個1.5 mL EP管中加入1 mL噬菌體后，將其分別置于40、50、60、70、80 ℃的金屬浴中進(jìn)行孵育。在30和60 min各取出100 μL噬菌體，稀釋后用雙層平板法檢測效價。每組重復(fù)3次。用HCl和NaOH調(diào)節(jié)SM液的pH至3～12，分別取900 μL不同pH的SM液加入1.5 mL EP管中，再向每管中加入100 μL噬菌體，37 ℃培養(yǎng)1 h，用雙層平板法檢測噬菌體的效價，每組重復(fù)3次。

1.2.8 體外裂解曲線測定 取500 μL濃度為3× 108CFU·mL-1的宿主菌用液體LB洗滌3次，用10倍體積的LB重懸。按照最佳MOI將細(xì)菌和噬菌體各取100 μL混勻，加入96孔板中，每孔200 μL， 重復(fù)5孔。取重懸后的菌液和液體LB各100 μL混勻加入96孔板中，每孔200 μL，重復(fù)5孔， 作為菌液對照。將200 μL LB加入96孔板中，重復(fù)5孔作為空白對照。將酶標(biāo)儀參數(shù)設(shè)置為恒溫37 ℃，180 r·min-1震蕩，持續(xù)15 h，每30 min檢測1次OD600nm，用所得數(shù)值繪制體外裂解曲線。

1.2.9 全基因組測序及生物信息學(xué)分析 使用苯酚-氯仿法[22]提取噬菌體的基因組DNA，用雙蒸水溶解后，-20 ℃保存。將噬菌體DNA送至北京化工大學(xué)進(jìn)行全基因組測序，采用Illumina Hiseq測序平臺，TruSeqTMDNA Sample Prep Kit構(gòu)建DNA文庫。使用Newbler V3.0軟件(Roche 454)和CLC軟件(CLC Bio)組裝拼接噬菌體的完整基因組序列。基因組序列拼裝結(jié)果由北京化工大學(xué)提供。利用NCBI在線工具BLASTp(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)對噬菌體基因組開放閱讀框(ORF)作功能注釋，并利用GC view Sever繪制噬菌體的全基因組圖譜。以噬菌體的RNA連接酶和全基因組為基準(zhǔn)，使用MEGA-X繪制噬菌體的系統(tǒng)發(fā)育樹，利用Maximum Likelihood最大似然法進(jìn)行同源進(jìn)化分析。

2 結(jié) 果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

以K1莢膜大腸桿菌DE058為宿主菌，用雙層平板法進(jìn)行噬菌體分離。經(jīng)反復(fù)純化后，得到以DE058為宿主菌的噬菌體PNJ1809-36。在雙層瓊脂上產(chǎn)生的噬菌斑大小均一，邊緣整齊，斑清澈透亮(圖1A)。經(jīng)過負(fù)染后，進(jìn)行電鏡觀察，該噬菌體的頭部直徑為80 nm，為正多面體；具有可以收縮的尾部，長度大約100 nm，底板上有較多的短尾絲(圖1B)，表明PNJ1809-36為肌尾科噬菌體。

A. PNJ1809-36形成的噬菌斑形態(tài)；B. PNJ1809-36負(fù)染后的電鏡圖(比例尺為20 nm)

2.2 宿主譜分析

對實驗室保存的108株大腸桿菌使用雙層平板法測定噬菌體PNJ1809-36的裂解譜。其中21株菌可以被裂解(表1)，經(jīng)PCR鑒定這些菌株均為K1莢膜菌株。圖2列舉了部分PCR鑒定結(jié)果，其中泳道1、5、9、19在270 bp處出現(xiàn)條帶，鑒定為K1莢膜型大腸桿菌。該試驗結(jié)果表明，該噬菌體對K1型大腸桿菌具有廣譜抗菌活性。

M. DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～23.檢測K1莢膜的基因條帶；-.陰性對照

表1 噬菌體PNJ1809-36宿主譜

2.3 一步生長曲線

一步生長曲線測定結(jié)果顯示(圖3 A)，前10 min噬菌體效價無明顯變化，10～50 min噬菌體的效價急劇升高，然后趨于穩(wěn)定。即噬菌體PNJ1809-36的潛伏期為10 min，爆發(fā)期為40 min。爆發(fā)期時噬菌體效價最高可達(dá)1.84×108PFU·mL-1。由“爆發(fā)量=噬菌體末期數(shù)量/初期細(xì)菌數(shù)量”可知，噬菌體PNJ1809-36的爆發(fā)量為122。

2.4 最佳MOI

如圖3 B所示，將噬菌體和細(xì)菌按照不同的MOI混合后測定噬菌體的滴度，比較在不同的MOI情況下產(chǎn)生噬菌體的數(shù)量。在MOI為0.01時，噬菌體的滴度最高，因此PNJ1809-36與DE058宿主菌的最佳MOI為0.01。

2.5 熱穩(wěn)定性及酸堿耐受性

通過對噬菌體PNJ1809-36的熱穩(wěn)定性檢測可知(圖3 C)，在40 ℃時，噬菌體的效價比較穩(wěn)定；50 ℃ 孵育30 min時，噬菌體存活率為94.34%，孵育60 min時，存活率為67.65%；60 ℃時，噬菌體存活率明顯下降，孵育時間為30 min時，存活率僅為0.2%，孵育時間為60 min時，存活率為0；70和80 ℃ 時，孵育30和60 min噬菌體存活率均為0，表明60 ℃以上30 min可使噬菌體幾乎完全滅活。

(續(xù)表1 Continued)

圖3D表示噬菌體PNJ1809-36對于不同酸堿度的耐受情況。在pH為3～11，PNJ1809-36均可存活；pH為6時，噬菌體的活性最高；pH為2或12時， PNJ1809-36完全失活。

2.6 體外裂解曲線

將噬菌體PNJ1809-36和宿主菌以最佳MOI混合培養(yǎng)，持續(xù)觀察15 h，結(jié)果如圖3 E所示，在前6 h內(nèi)，噬菌體PNJ1809-36可完全抑制宿主菌DE058的生長；而未加噬菌體的宿主菌則保持持續(xù)增長，大約在12 h后進(jìn)入平臺期；空白對照則未見細(xì)菌生長，表明該體系沒有被污染。

A.噬菌體PNJ1809-36一步生長曲線；B.最佳 MOI檢測；C.溫度敏感性檢測；D.酸堿度耐受性檢測；E.噬菌體體外裂解曲線

2.7 全基因組測序及分析

噬菌體PNJ1809-36基因組為線性的雙鏈DNA，已將該基因組上傳至GenBank(Accession number：MT944117)。經(jīng)分析可知，其基因組長度為152 343 bp；GC含量為39.11%；A、T、G、C含量分別為30.76%、30.13%、19.27%、19.83%。根據(jù)基因功能預(yù)測，該基因組共有277個開放閱讀(ORF)，11個tRNA基因。277個ORF中，僅有36個注釋了可能存在的功能(表2)，包括與噬菌體的結(jié)構(gòu)和包裝相關(guān)的基因、DNA復(fù)制過程中的相關(guān)酶、裂解宿主相關(guān)基因以及噬菌體的尾部纖維基因，無噬菌體整合酶基因。剩余的87% ORF均為未知功能的蛋白。

表2 噬菌體PNJ1809-36部分ORFs預(yù)測

使用GC view Server[23]繪制了全基因組圖譜(圖4)，并用不同的顏色進(jìn)行標(biāo)注。粉色代表假定蛋白，藍(lán)色為噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白，黃色標(biāo)注基因與噬菌體復(fù)制和包裝有關(guān)，紅色為尾部纖維蛋白。由于該噬菌體的大多數(shù)基因與其他噬菌體的同源性較低，因此存在大量的未知功能的假定蛋白，可見該噬菌體基因異質(zhì)性較強(qiáng)，有待繼續(xù)研究和驗證。

粉色為假定蛋白；藍(lán)色為噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白；黃色為DNA復(fù)制和外殼包裝有關(guān)蛋白；紅色為噬菌體尾部蛋白；黑色代表GC含量；綠色和紫色代表正、負(fù)平均GC偏差

2.8 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

為了解噬菌體PNJ1809-36與其他噬菌體之間的進(jìn)化關(guān)系，選擇相對保守的且具有進(jìn)化意義的基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，例如頭部蛋白、末端酶大亞基[24]、RNA聚合酶[25]、RNA連接酶[26]以及全基因組等。本研究以RNA連接酶為基準(zhǔn)，采用MEGA-X軟件中的Maximum Likelihood繪制同源進(jìn)化樹(圖5)。分析結(jié)果顯示，噬菌體PNJ1809-36與噬菌體vB EcoM-Ro121c4YLVW(2019年分離)、噬菌體nepoznato(2019年分離)親緣性較近，這兩株噬菌體基因組中均含有與K1莢膜降解相關(guān)的蛋白，Korf等[27]建議將這類噬菌體歸于肌尾科噬菌體中的新屬，并將該新屬命名為“Phapecoctavirus”。

分支點上的數(shù)字. 可信度，數(shù)值越接近100，可信度越強(qiáng)；標(biāo)尺.代表遺傳距離；黑色三角.PNJ1809-36

3 討 論

隨著細(xì)菌耐藥現(xiàn)象的持續(xù)惡化，尋找新的抗生素替代品乃當(dāng)務(wù)之急。而噬菌體作為一種細(xì)菌病毒，具有特異性分解某些細(xì)菌的能力，在克服耐藥領(lǐng)域具備一定的潛力。本研究分離得到的大腸桿菌噬菌體PNJ1809-36是一株肌尾科噬菌體，透射電鏡下可以發(fā)現(xiàn)其頭部大小約為80 nm且呈正多面體，具有可以收縮的尾部，大約100 nm。它可以在雙層瓊脂上形成大小均一、透亮的噬菌斑。一步生長曲線顯示該噬菌體PNJ1809-36的潛伏期為10 min，爆發(fā)期持續(xù)40 min，裂解量為122，說明其吸附宿主菌所需時間較短，復(fù)制子代效率較高。最佳MOI為0.01，表明噬菌體在裂解細(xì)菌時所需數(shù)量較少，在實際應(yīng)用中較低的MOI會降低純化及應(yīng)用成本。其溫度和酸堿耐受性顯示，在40 ℃以下活性完全不會被抑制，60 ℃以上被滅活。pH為6的弱酸性條件下活性最好。這提示該噬菌體可能適用于體內(nèi)細(xì)菌感染的治療。體外裂解曲線顯示了在最佳MOI的比例下，噬菌體可以在6 h內(nèi)持續(xù)抑制細(xì)菌的生長，給使用該噬菌體進(jìn)行治療時的給藥時間提供了參考。在噬菌體的基因組分析中沒有發(fā)現(xiàn)噬菌體整合酶基因，結(jié)合其培養(yǎng)特征，可以證明該噬菌體為烈性噬菌體。

PNJ1809-36對20株K1莢膜大腸桿菌均有裂解作用，這提示噬菌體PNJ1809-36可能是一個K1莢膜特異性的噬菌體。具有K1莢膜的大腸桿菌能夠引起新生兒腦膜炎，尤其是近幾年隨著耐藥性K1菌株的出現(xiàn)，情況變得嚴(yán)峻。針對K1莢膜菌株的噬菌體能夠降解K1莢膜，使細(xì)菌毒力下降，在治療K1菌株引起的疾病上具有潛力。

噬菌體PNJ3809-36與nepoznato親緣性非常高，提示PNJ1809-36可能和近期發(fā)現(xiàn)的噬菌體同屬于能夠分解K1莢膜且具有可收縮尾部的肌尾科噬菌體。且Lavigne等[28]提到，這些噬菌體應(yīng)當(dāng)屬于新的肌尾科系統(tǒng)發(fā)育分支。莢膜特異性噬菌體是一種特殊的能夠降解胞外多糖的噬菌體。根據(jù)莢膜類型的不同，對應(yīng)的噬菌體也進(jìn)行了分類[15]。研究最多的是針對K1莢膜的噬菌體。K1莢膜是一種單一的多聚唾液酸[29]。在早期發(fā)現(xiàn)的針對K1莢膜的噬菌體多為短尾噬菌體：如K1E[30]、K1F[31]等。后來發(fā)現(xiàn)了長尾噬菌體63D[32]也能夠特異性分解K1莢膜。近十年又發(fā)現(xiàn)了與早期發(fā)現(xiàn)的這些噬菌體同源性較低的新的降解K1莢膜的噬菌體，如沙門菌噬菌體 PVP-SE1[33](2011年分離)、大腸桿菌噬菌體phAPEC8[34](2010年分離)、ESCO5、ESCO13[35](2017年分離)、nepoznato(2019年分離)等。

噬菌體宿主特異性主要取決于其尾部蛋白與細(xì)菌表面受體的結(jié)合，宿主菌的外膜蛋白、莢膜、菌毛或鞭毛上都存在特異性的受體，這些受體以蛋白質(zhì)、多糖或脂多糖形式存在。在本研究中，噬菌體PNJ1809-36的受體為K1莢膜，是一種胞外多糖，其成分為多聚唾液酸[36]。據(jù)報道裂解K1莢膜型大腸桿菌的噬菌體存在一種尾部蛋白，即內(nèi)切唾液酸酶，能夠?qū)⒍嗑弁僖核岱纸獬?，8唾液酸單體，從而降解K1莢膜[37]。通過基因比對發(fā)現(xiàn)，PNJ1809-36基因組中ORF261與K1莢膜特異性噬菌體的內(nèi)切唾液酸酶的氨基酸相似性為74%[34]，由此可推測ORF261可能具有內(nèi)切唾液酸酶的功能，后續(xù)我們會進(jìn)一步驗證該酶的功能。

4 結(jié) 論

噬菌體PNJ1809-36是1株特異性高，裂解能力強(qiáng)的噬菌體。它具有能夠針對性裂解K1莢膜大腸桿菌的特性，提示該噬菌體具有防控K1莢膜大腸桿菌感染的潛力。