小熊貓?jiān)慈翢岵《局闔、F基因的克隆及序列分析

蔣 梅，陳 武，翟俊瓊，卜婉迪，謝逸倫，劉燦彬，單 芬*,羅滿林*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642； 2.廣州動物園 廣州市野生動物研究中心，廣州 510070)

犬瘟熱(cannine distermper, CD)由犬瘟熱病毒(canine distermper virus, CDV)感染引起的高度接觸性、致病性傳染病，呈世界范圍內(nèi)廣泛分布[1]。臨床癥狀主要有發(fā)熱、咳嗽、腹瀉、呼吸困難、嘔吐甚至死亡[2-3]。CDV是一種有包膜、不分節(jié)段、無重疊的單鏈負(fù)股RNA病毒，屬于副黏病毒科(Paramyxoviride)，麻疹病毒屬(Morbillivirus)[4]。病毒基因組全長為15 690 bp，從3′到5′分別編碼核衣殼(N)、磷蛋白(P)(包含兩個非結(jié)構(gòu)蛋白基因，C和V)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)、大蛋白(L)8個蛋白[5]。H和F糖蛋白是病毒粒子誘導(dǎo)中和保護(hù)性抗體的最外層蛋白質(zhì)，比其他CDV蛋白更易變異，并決定病毒感染的宿主特異性[6]。兩種糖蛋白都是誘導(dǎo)針對CDV的保護(hù)性免疫反應(yīng)的抗原決定簇，H和F基因的遺傳變異被認(rèn)為是宿主感染CDV數(shù)量增加的重要原因，因此對CDV毒株H、F基因進(jìn)行深入研究更為重要[7-8]。

小熊貓(Ailurusfulgens)，國家二級保護(hù)動物，目前多被圈養(yǎng)于動物園或野生動物救護(hù)站[9]。犬瘟熱病毒已經(jīng)成為我國圈養(yǎng)小熊貓大量死亡、種群數(shù)量急劇下降的主要病原，常與犬冠狀病毒、犬細(xì)小病毒發(fā)生混合感染，危害嚴(yán)重[10-11]。1968年，米克維茨[12]首次報(bào)道犬瘟熱病毒導(dǎo)致小熊貓的大規(guī)模疾病和死亡，隨后，中國多地相繼報(bào)道圈養(yǎng)小熊貓感染犬瘟熱病毒的病例，包括因接種犬瘟熱弱毒疫苗導(dǎo)致死亡的案例等[13]。本研究中的毒株來自江蘇某地封閉管養(yǎng)圈養(yǎng)的小熊貓，此前從未發(fā)生過犬瘟熱感染，所以，探究病毒的遺傳演化背景，了解病毒基因的變異情況對疾病防控具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料、菌株 病料采集自江蘇某地感染犬瘟熱病毒病死小熊貓的肺組織；大腸桿菌DH5α感受態(tài)購自天根生化(北京)科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒，購自AXYGEN生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒，購自O(shè)MEGA公司產(chǎn)品；DNA Marker、pMD18-T 載體，PrimerScriptTMOne step RT-PCR Kit，均購自寶生物(大連)有限公司；氨芐青霉素(Amp+)、LB培養(yǎng)基(酵母提取物2 g、胰蛋白胨1 g和氯化鈉2 g，定容至200 mL)均購自廣州華奇盛生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病料處理 病料組織置于4倍體積的PBS中進(jìn)行充分研磨，分裝后4 ℃ 5 000 r·min-1離心10 min，棄沉淀，收取的上清液用0.22 μm濾器過濾除菌，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因克隆及測序 比較分析GenBank上發(fā)表的犬瘟熱病毒N基因序列，設(shè)計(jì)合成用于鑒定感染CDV的特異性鑒定引物，比較分析GenBank上發(fā)表的H、F基因全長序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增H及F基因的引物，引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，引物詳細(xì)情況見表1。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后，與pMD18-T 載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，初步鑒定正確的重組質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1 擴(kuò)增CDV的引物設(shè)計(jì)

1.2.3 序列分析 采用Lasergene Version 7.1 軟件中SeqMan、Meglign的對序列進(jìn)行拼接、序列比對、抗原表位及分子特征分析。測得的序列登陸NCBI進(jìn)行BLAST分析。同時下載不同基因型的犬瘟熱病毒代表序列進(jìn)行基因、氨基酸序列相似性分析。采用MEGA7.1軟件繪制H、F基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。進(jìn)化樹的繪制方法：應(yīng)用Neighbor-joining法(參數(shù)設(shè)置為1 000 replications)及Maximum composite likelihood model 比對核苷酸序列。采用NetNGlyc1.0軟件進(jìn)行糖基化位點(diǎn)分析。

2 結(jié) 果

2.1 鑒定引物RT-PCR擴(kuò)增及H、F全長基因擴(kuò)增

采用針對CDVN基因的特異性鑒定引物經(jīng)RT-PCR 擴(kuò)增、1%瓊脂糖凝膠電泳之后，得到大小約為637 bp的目的基因片段，結(jié)果與預(yù)期片段大小一致(圖略)，將PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測定，比對分析證實(shí)為CDVN基因序列。采用針對H、F基因全長的特異性引物，對H、F的全長基因進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測，獲得與預(yù)期大小一致的H基因全長片段(1 824 bp)和F基因全長片段(1 989 bp)，結(jié)果如圖1所示。

A. GD-1 H基因擴(kuò)增；B. GD-1 F基因擴(kuò)增；M. DL5000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 陰性對照；2. 擴(kuò)增片段；3. 陽性對照

2.2 H、F基因的序列及遺傳演化分析

H基因序列測定結(jié)果表明：H基因全長為1 824 bp， 編碼607個氨基酸。登錄GenBank進(jìn)行Blast分析，H基因序列與丹麥報(bào)道的登錄號為GU266280犬源犬瘟熱病毒株的核苷酸序列相似性最高，為96%。與其他參考毒株的核苷酸相似性為88.5%～95.4%，相應(yīng)的氨基酸序列相似性為83.1%～95.2%，與標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株A75/17(登錄號:AF164967，犬源CDV)氨基酸相似性為95.2%；與Convac、Onderstepoort、Recombinant Snyder Hill、CDV3四種經(jīng)典疫苗株同源性較低，核苷酸相似性為90.3%～90.8%，對應(yīng)的氨基酸序列相似性為88.2%～89.3%。

F基因測序結(jié)果表明，F(xiàn)基因全長為1 989 bp，編碼663個氨基酸，其中1—135位是信號肽，136—224位為F2，225—662位為F1，切割位點(diǎn)的氨基酸序列為A↓QIHW。登錄GenBank進(jìn)行Blast分析，與巴西報(bào)道的登錄號KY057355犬源犬瘟熱病毒的核苷酸相似性最高，為95.7%；與其他CDV毒株相應(yīng)的基因序列核苷酸相似性為92.2%～95.6%，其推定的氨基酸相似性為91.1%～99.0%，與疫苗株Onderstepoort、Recombinant Snyder Hill、CDV3、Shusiky等相應(yīng)序列的核苷酸、氨基酸序列相似性較低，分別為91.0%～91.2%和89.1%～89.7%。

應(yīng)用MEGA 7.0軟件將GD-1株H、F基因與Asia-1、Asia-2、Asia-3、Asia-4、America-1、America-2、Europe、Europe-wildlife、Rockborn-like和Arctic-like等10個基因型的參考毒株進(jìn)行遺傳演化分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：GD-1株分離株與Asia-4型的各參考毒株親緣關(guān)系較近，位于同一大的進(jìn)化分支，但是單獨(dú)形成一個小的亞基因型分支，而與疫苗株America-1 親緣關(guān)系遠(yuǎn)，這與國內(nèi)報(bào)道的流行毒株位于Asia-1型存在差異(圖2)。

2.3 H、F基因的分子特征分析

對H、F蛋白基因進(jìn)行N-糖基化位點(diǎn)分析，結(jié)果顯示：H蛋白基因具有8個N-糖基化位點(diǎn)，分別在19、149、309、391、422、456、587、603位點(diǎn)。其中，309—311糖基化位點(diǎn)是野毒株所特有的；其他位點(diǎn)沒有發(fā)現(xiàn)新增的糖基化位點(diǎn)，這和大量文獻(xiàn)中報(bào)道的野毒株含有8個或9個糖基化位點(diǎn)相一致；F蛋白共有6個N-糖基化位點(diǎn)，分別位于62、108、141、173、179、517位。

對H、F基因編碼氨基酸序列進(jìn)行蛋白抗原表位預(yù)測，H蛋白的抗原表位在1—38、368—391、419—433、568—607位氨基酸，與CDV3、Convac、recombinant Snyder Hill和Onderstepoort 疫苗株存在差異，與疫苗株Convac株、Onderstepoort株在393—408位氨基酸的抗原表位也有不同，與經(jīng)典野毒株A75/17比對，在419—450、568—607位氨基酸處有較大差異。對F基因編碼的F0蛋白進(jìn)行抗原表位預(yù)測比對分析，在1—133、176—194、629—663位氨基酸的抗原表位與疫苗株(CDV3株、Shusiky株、recombinant Snyder Hill株和Onderstepoort株)和經(jīng)典野毒株A75/17相應(yīng)區(qū)域差異明顯。

CDV H蛋白作為重要的膜蛋白，主要通過與宿主體內(nèi)SLAM受體結(jié)合而復(fù)制。研究表明H蛋白個別氨基酸位點(diǎn)改變會影響與SLAM受體的結(jié)合能力。文獻(xiàn)報(bào)道這些位點(diǎn)集中在525、526、529、530、549等，分析發(fā)現(xiàn)本分離株的這幾個位點(diǎn)氨基酸與歐亞野生毒株的完全一致，與疫苗株相比530、549位氨基酸差異明顯。

此外CDV H及F蛋白單個氨基酸的變異，可能引起毒力發(fā)生改變。分析發(fā)現(xiàn)該毒株的H蛋白氨基酸序列與其他CDV參考毒株相比，在24、41、85、219等共計(jì)9個氨基酸位點(diǎn)發(fā)生明顯變異(表2)。與其他參考毒株相比， F蛋白共計(jì)有115、130、162等11處氨基酸發(fā)生了新的變異(表2)。

表2 分離株H、F蛋白氨基酸變異位點(diǎn)分析

3 討 論

CDV作為引起小熊貓大批量死亡、數(shù)量驟減的重要病原之一，其導(dǎo)致的CD暴發(fā)具有發(fā)病急、傳播快、發(fā)病率高、死亡率高等特點(diǎn)[14-15]。近年來，各地不斷有圈養(yǎng)野生動物感染CDV的報(bào)道，如1991—1992年北美動物園的虎、豹等，1994年坦桑尼亞塞倫蓋蒂國家公園的獅子，1997年中國重慶動物園的大熊貓、2004年俄羅斯博克羅夫卡的西伯利亞虎，中國廣西人工飼養(yǎng)場恒河猴等[16-21]。CDV的宿主范圍也越來越廣，由傳統(tǒng)宿主犬科、浣熊科、鼬科動物擴(kuò)大至食肉目所有8個科的動物，給疾病的預(yù)防增加了難度[22-24]。本研究中的小熊貓，此前未接種過相關(guān)疫苗，且長期封閉圈養(yǎng)，排除疫苗免疫造成的感染，更大可能性來自于野毒感染，病例發(fā)生之前有針對小熊貓分型研究的團(tuán)隊(duì)在該地進(jìn)行過采樣，據(jù)了解，研究人員此前的采樣地是成都某小熊貓圈養(yǎng)地，而此地此前就發(fā)生過小熊貓感染CDV的病例，究竟兩地之間的病例是否存在關(guān)聯(lián)還在進(jìn)一步研究中。

本分離株的H蛋白具有8個潛在糖基化位點(diǎn)(19、149、309、391、422、456、587、603)，包含野毒株所特有的309—311糖基化位點(diǎn)，未發(fā)現(xiàn)新增的糖基化位點(diǎn)，這與大量文獻(xiàn)中報(bào)道的野毒株含有8或9個糖基化位點(diǎn)相一致，與當(dāng)前流行的Asia-4型的CDV一致。根據(jù)H、F抗原表位分析，GD-1株的抗原表位與疫苗株的相應(yīng)序列存在較大差異，蛋白抗原決定簇發(fā)生改變，暗示更多免疫逃避株的存在。與各參考毒株相比，該株H、F蛋白還存在不同數(shù)量的氨基酸位點(diǎn)變異，這些關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸的變異，是否影響了病毒本身傳播能力或毒力還有待進(jìn)一步研究。

基于犬瘟熱病毒的地域流行情況，目前已報(bào)道過約17個基因型[25-29]，分別稱為亞洲1～4型、美國1型(多為疫苗株)、美國2～5型、歐洲1型(南美洲1型)、歐洲野生動物型、南美洲2型、南美洲3型、北極型、類洛克伯恩型、非洲1型、非洲2型等。構(gòu)建基于F、H基因進(jìn)化樹，GD-1株在基因型判定為Asia-4，但是與Asia-4的毒株基因序列仍存在差異，隸屬小的進(jìn)化分支。與當(dāng)前我國流行的Asia-1型各野毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，之前本研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道過廣東某地分離小熊貓?jiān)碈DV，均屬于Asia-1型[30-31]。據(jù)Piewbang等[26]近年的報(bào)道，Asia-4基因型主要在泰國地區(qū)呈流行趨勢，宿主源主要是犬、果子貍以及新報(bào)道的麝香貓等。本研究結(jié)果提示在高強(qiáng)度的疫苗免疫之下，國內(nèi)犬瘟熱病毒免疫逃避株越來越多，病毒本身發(fā)生更多漂移或漂變，而關(guān)于本研究中毒株的傳播能力、致病機(jī)制等有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究在國內(nèi)首次報(bào)道了位于Asia-4的小熊貓?jiān)碈DV，并對病毒的H、F 蛋白進(jìn)行系統(tǒng)分析，在目前缺乏野生動物專用犬瘟熱疫苗使用的情況下，了解新流行毒株的分子特點(diǎn)及變異情況、對于圈養(yǎng)野生動物犬瘟熱的科學(xué)防控具有指導(dǎo)意義。