豬舍細(xì)顆粒物促進(jìn)豬原代肺泡巨噬細(xì)胞向M1極化

沈家鯤，唐 倩，崔洋洋，金曉明，李延森，李春梅

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 家畜環(huán)境控制與智慧生產(chǎn)研究中心，南京 210095)

豬舍空氣顆粒物是豬呼吸道疾病發(fā)生的重要原因之一，也是疾病傳播的重要媒介[1]。高密度、集約化的養(yǎng)豬生產(chǎn)導(dǎo)致豬舍空氣污染物濃度增加，造成豬群呼吸道疾病多發(fā)，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬生產(chǎn)。其中，細(xì)顆粒物(fine particulate matter，PM2.5)因粒徑小，表面積大，易吸附攜帶更多有害物質(zhì)，且可直接進(jìn)入肺泡，危害最大[2]。研究表明，高濃度豬舍PM2.5會(huì)導(dǎo)致小鼠體重下降，肺組織出現(xiàn)病理?yè)p傷和炎癥[3]。肺泡巨噬細(xì)胞是肺內(nèi)游離的免疫細(xì)胞，主要分布于肺泡表面，是肺抵御外源物質(zhì)入侵的第一道防線，對(duì)維持肺部健康穩(wěn)態(tài)具有重要作用[4]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，豬舍PM2.5能夠誘導(dǎo)豬肺泡巨噬細(xì)胞(porcine alveolar macrophages，PAMs)發(fā)生炎癥反應(yīng)，激活NLRP3炎性小體，引發(fā)細(xì)胞凋亡[5]。研究結(jié)果提示，豬舍PM2.5可誘發(fā)豬肺部炎癥損傷。

巨噬細(xì)胞具有高度的可塑性，能夠根據(jù)不同的微環(huán)境而改變自身表型[6]。根據(jù)激活方式的不同，可將巨噬細(xì)胞分為M1和M2型。M1型巨噬細(xì)胞可由脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)或腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)激活，這類(lèi)巨噬細(xì)胞可分泌較高水平的促炎因子，如TNF-α、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)等[7]。同時(shí)，也可產(chǎn)生單核細(xì)胞趨化因子-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)等趨化因子，并通過(guò)趨化性吸引Th1細(xì)胞，促進(jìn)強(qiáng)烈的Th1免疫反應(yīng)。此外，M1型巨噬細(xì)胞還高表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)，并產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)和一氧化氮(nitric oxide，NO)[8]。M2型巨噬細(xì)胞可由白介素-4(interleukin-4，IL-4)、白介素-10(interleukin-10，IL-10)、白介素-13(interleukin-13，IL-13)、糖皮質(zhì)類(lèi)激素等誘導(dǎo)產(chǎn)生，主要發(fā)揮抗炎作用，具有促進(jìn)損傷修復(fù)和組織再生的功能。M2型巨噬細(xì)胞可分泌高水平的抗炎因子，如IL-10、IL-4、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)；低表達(dá)促炎因子，包括IL-12、IL-1β、 TNF-α等，同時(shí)也可增強(qiáng)精氨酸酶活性，緩解炎癥反應(yīng)[9]。生物體內(nèi)的巨噬細(xì)胞，在功能和活性上都介于M1型和M2型之間[10]。在具體的微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞會(huì)根據(jù)微環(huán)境的變化不斷進(jìn)行著表型間的轉(zhuǎn)換，維持一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，任何影響巨噬細(xì)胞M1/M2極化穩(wěn)態(tài)的因素都可能導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生炎癥或疾病[11]。

PAMs是研究豬肺部炎癥與免疫的重要細(xì)胞模型，是豬肺炎支原體、豬繁殖與呼吸綜合征病毒等病原微生物感染的重要靶細(xì)胞[12-13]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，豬舍PM2.5誘導(dǎo)PAMs發(fā)生炎癥反應(yīng)[5]，但PM2.5是否影響PAMs的極化尚不清楚。因此，本研究旨在通過(guò)建立原代PAMs模型，研究豬舍PM2.5對(duì)原代PAMs的細(xì)胞活力、NO分泌量、精氨酸酶活性，以及炎癥因子和極化表型標(biāo)志物的mRNA表達(dá)水平的影響，探究PM2.5對(duì)原代PAMs極化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

原代PAMs分離自140日齡杜×大×長(zhǎng)三元雜交豬；特氟龍濾膜購(gòu)自Whatman公司；基礎(chǔ)培養(yǎng)基RPMI 1640和胎牛血清購(gòu)自BI公司；青霉素-鏈霉素-兩性霉素B三抗購(gòu)自Sigma公司；紅細(xì)胞裂解液、DAPI和Alexa Fluor488標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗購(gòu)自碧云天公司；小鼠F4/80抗體購(gòu)自Servicebio公司；0.01 mol·L-1PBS、牛血清白蛋白(BSA)和Triton X-100購(gòu)自北京索萊寶有限公司；多聚甲醛固定液購(gòu)自Biosharp公司；細(xì)胞活力試劑盒、Diff-quik試劑盒和一氧化氮試劑盒均購(gòu)自南京建成生物技術(shù)有限公司；Tris-HCl、硫酸和磷酸購(gòu)自國(guó)藥試劑公司；氯化錳、尿素和L-精氨酸購(gòu)自源葉公司；α-異亞硝基苯丙酮購(gòu)自安耐吉化學(xué)公司；總RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(HiScript Ⅱ Q RT SuperMix)購(gòu)自諾唯贊公司；熒光定量試劑盒(2×T5 Fast qPCR Mix SYBR Green I)購(gòu)自擎科公司。

1.2 PAMs分離與培養(yǎng)

豬屠宰放血后，用消毒過(guò)的棉線結(jié)扎主氣管(防止血液進(jìn)入氣管)，分離豬肺。用預(yù)冷的PBS清洗肺表面后，開(kāi)放主氣管，用含0.5%三抗的PBS灌洗豬肺。每次灌洗50 mL，停留2 min，回收肺泡灌洗液，反復(fù)3～4次，回收后的灌洗液4 ℃保存，并在24 h內(nèi)完成PAMs提取。將4 ℃保存的肺泡灌洗液，于100目無(wú)菌不銹鋼篩過(guò)濾，過(guò)濾后的液體分裝，2 000 r·min-1離心10 min，棄上清，保留沉淀，加入紅細(xì)胞裂解液1～2 mL，37 ℃裂解紅細(xì)胞5 min。 裂解完成后2 000 r·min-1離心10 min，留沉淀，用1～2 mL無(wú)血清的RPMI 1640重懸，計(jì)數(shù)。按每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，每孔3×105個(gè)細(xì)胞接種于24孔板，每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，接種完成后，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，貼壁的細(xì)胞即為PAMs，換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 PM2.5的采集與提取

PM2.5的采集方法詳見(jiàn)先前的研究[5]，將采樣器置于集約化豬舍中，采樣器流量為16.67 L·min-1，PM2.5樣本被采集在直徑為47 mm的特氟龍濾膜上。每天采集PM2.5樣本23 h，從早上7:00至第二天早上6:00，采集樣本于-20 ℃保存。采集后的濾膜加入超純水，經(jīng)超聲波振蕩后，用6層無(wú)菌紗布過(guò)濾，過(guò)濾后懸濁液于12 000 r·min-1離心40 min，保留沉淀。經(jīng)冷凍干燥后，在干燥器內(nèi)室溫平衡6 h后，加入一定量的生理鹽水，配制成1 mg·mL-1的母液，并高壓滅菌后于4 ℃保存，用以處理細(xì)胞。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

試驗(yàn)分為對(duì)照組和PM2.5組(50 μg·mL-1)，PM2.5濃度的選擇參照課題組先前的研究[5]。純化后的細(xì)胞先培養(yǎng)24 h，PM2.5組細(xì)胞用含5%PM2.5母液的完全培養(yǎng)基(PM2.5終濃度為50 μg·mL-1)再培養(yǎng)4、8和12 h，對(duì)照組細(xì)胞用含有5%生理鹽水的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)4、8和12 h，兩組每個(gè)時(shí)間均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，處理結(jié)束后收集相應(yīng)的細(xì)胞上清和細(xì)胞用于指標(biāo)檢測(cè)。

1.5 細(xì)胞形態(tài)觀察和活力測(cè)定

細(xì)胞純化后，先培養(yǎng)24 h，之后每24 h用倒置相差顯微鏡觀察記錄細(xì)胞形態(tài)變化和生長(zhǎng)狀態(tài)，并測(cè)定細(xì)胞活力。96孔板內(nèi)的細(xì)胞添加不同處理后，培養(yǎng)不同時(shí)間，到達(dá)設(shè)定的時(shí)間后，按MTT試劑盒說(shuō)明書(shū)方法測(cè)定細(xì)胞活力。

1.6 PAMs的鑒定

1.6.1 Diff-quik染色 純化前的肺泡灌洗液采用涂片法制作涂片，室溫風(fēng)干。接種PAMs于6孔 培養(yǎng)板細(xì)胞爬片上，純化后，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，室溫風(fēng)干。參考黃燕霞等[14]方法，按照Diff-quik試劑盒進(jìn)行染色。主要步驟：風(fēng)干后的爬片于Reagent 1內(nèi)固定10 s，Reagent 2內(nèi)染色10 s，甩去多余液體，放入Reagent 3中染色10 s， 取出爬片，放入清水中洗去多余的染液，無(wú)水乙醇脫水2次，每次10 s，待干后，放入二甲苯中透明10 s，中性樹(shù)脂封片，鏡檢。

1.6.2 F4/80免疫熒光標(biāo)記 F4/80為巨噬細(xì)胞膜表面蛋白，是巨噬細(xì)胞標(biāo)志之一[15]。接種PAMs于6孔培養(yǎng)板細(xì)胞爬片上，純化后，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，加入4%多聚甲醛固定30 min，接著PBS洗滌3次，每個(gè)爬片加入100 μL的0.5% TritonX-100通透10 min后，PBS洗滌3次。每孔加入1 mL含1% BSA的PBS，室溫封閉1 h，棄去封閉液。用含1% BSA的PBS按1∶100稀釋一抗(小鼠F4/80單抗)，每個(gè)爬片上加入100 μL的一抗，37 ℃孵育1 h，棄去一抗，PBS洗滌3次。再用含1% BSA的PBS按1∶200稀釋二抗(Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG)，37 ℃避光孵育10 min。 每孔加入50 μL的DAPI，室溫避光孵育10 min， 棄去DAPI，PBS洗滌3次。在干凈的載玻片上滴加5 μL的抗淬滅劑，將爬片取出倒扣在載玻片上，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.7 巨噬細(xì)胞NO含量的測(cè)定

細(xì)胞處理后收集PAMs的細(xì)胞上清，2 500 r·min-1離心10 min，收集上清，按照NO試劑盒說(shuō)明書(shū)方法測(cè)定NO含量，550 nm測(cè)定吸光度，計(jì)算細(xì)胞上清中的NO含量。

1.8 細(xì)胞內(nèi)精氨酸酶活性的測(cè)定

參考Corraliza等[16]的方法，將處理后的細(xì)胞先用PBS洗滌2次，加入100 μL 0.1%Triton X-100，室溫裂解30 min，再加入100 μL 的50 mmol·L-1Tris-HCl和10 mmol·L-1MnCl2，56 ℃溫育10 min。加入100 μL 的0.5 mol·L-1精氨酸(pH 9.7)，37 ℃ 水解精氨酸60 min。加入900 μL H2SO4(96%)/H3PO4(85%)/H2O(1/3/7)終止反應(yīng)。加入40 μL的9% α-異亞硝基苯乙酮(溶于100%乙醇)，95 ℃避光，溫育30 min。以尿素為標(biāo)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，在540 nm下測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品的尿素濃度。每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol尿素為酶的一個(gè)活性單位IU。

1.9 炎癥因子與極化表型相關(guān)基因的RT-PCR分析

用PBS洗滌6孔板里的細(xì)胞2次，利用總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，用Nanodrop?2000測(cè)定RNA濃度和純度，并使用HiScript II Q RT SuperMix將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃保存。按照2× T5 Fast qPCR Mix SYBR Green I試劑盒說(shuō)明書(shū)操作反應(yīng)進(jìn)行。反應(yīng)體系：T5 Fast qPCR Mix(2×)10 μL， 上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 4 μL，總體積為20 μL。使用QuantStudio?5 Real-Time PCR進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)檢測(cè)，設(shè)置反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性10 s，60 ℃ 退火延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)；熔解曲線95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 1 s。每個(gè)RT-PCR均進(jìn)行3個(gè)重復(fù)。使用2-△△Ct法以β-actin為內(nèi)參基因測(cè)定相對(duì)mRNA表達(dá)水平。表1為細(xì)胞因子和極化標(biāo)志物相關(guān)基因的引物序列。

表1 RT-PCR引物信息

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)”表示。采用Graphpad Prism 8.0(CA，USA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析(ANOVA)中的Tukey多重比較法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，P<0.05則認(rèn)為這些差異顯著，P<0.01則認(rèn)為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 PAMs的形態(tài)觀察與活力測(cè)定

如圖1A所示，分離得到的PAMs呈圓形，大小不等。純化后，大部分細(xì)胞完全貼壁生長(zhǎng)，在培養(yǎng)24～48 h內(nèi)，細(xì)胞無(wú)明顯死亡現(xiàn)象，細(xì)胞逐漸發(fā)生變形，呈現(xiàn)為圓形、橢圓形或梭形等形狀。培養(yǎng)72 h后，一部分細(xì)胞出現(xiàn)死亡脫落。PAMs的細(xì)胞活力隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低(P<0.05，圖1B)，適宜的細(xì)胞處理時(shí)間應(yīng)在純化后培養(yǎng)48 h內(nèi)。

A. PAMs的形態(tài)學(xué)觀察，標(biāo)尺=100 μm。B. PAMs的活力測(cè)定，n=3。柱形圖頂部不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 PAMs的鑒定

如圖2A所示，純化前的豬肺泡灌洗液中含有多種細(xì)胞成分，除PAMs外，還有大量紅細(xì)胞和細(xì)胞碎片。純化后的細(xì)胞可以清晰看出，PAMs呈紫色，大小不均一，呈圓形或橢圓形等形狀，細(xì)胞核較大，多偏向一側(cè)，細(xì)胞中偶爾可見(jiàn)2個(gè)細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)呈微嗜堿性，染成淺藍(lán)色。免疫熒光結(jié)果顯示(圖2B)， 分離純化后細(xì)胞帶有F4/80標(biāo)記的均為PAMs。

A. Diff-quik染色。B. F4/80鑒定，F(xiàn)4/80-：未孵育F4/80抗體，F(xiàn)4/80+：孵育F4/80抗體

2.3 豬舍PM2.5對(duì)PAMs活力的影響

細(xì)胞活力測(cè)定結(jié)果顯示(圖3)，與對(duì)照組相比，PM2.5處理4、8 和12 h，PAMs的活力均沒(méi)有顯著變化(P>0.05)，表明PM2.5的短時(shí)間處理對(duì)PAMs的活力無(wú)明顯影響。

柱形圖頂部未標(biāo)注者表示與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)，下同，n=3

2.4 豬舍PM2.5對(duì)PAMs精氨酸代謝關(guān)鍵酶活性的影響

用PM2.5處理細(xì)胞4、8和12 h，PAMs分泌的NO量隨時(shí)間增加而增多，在4和12 h，PM2.5處理組PAMs分泌的NO量顯著高于對(duì)照組(P<0.05，圖4A)。PAMs的精氨酸酶活性隨時(shí)間增加而降低，與對(duì)照組相比，PM2.5處理4、8和12 h均極顯著降低PAMs精氨酸酶的活性(P<0.01，圖4B)。

A. NO測(cè)定。B. 精氨酸酶活性測(cè)定。*.P<0.05和**.P<0.01表示PM2.5組與對(duì)照組相比差異顯著，下同，n=3

2.5 豬舍PM2.5對(duì)PAMs炎癥因子表達(dá)水平的影響

如結(jié)果所示，與對(duì)照組相比，PM2.5處理不同時(shí)間均可提高PAMsIL-1β(圖5A)和TNF-α(圖5B)的mRNA表達(dá)水平，且呈時(shí)間依賴性增加，并在8和12 h差異顯著(P<0.01)。此外，與對(duì)照組相比，PM2.5處理8 h，顯著降低PAMs抗炎因子IL-10 mRNA表達(dá)水平(P<0.05，圖5C)。

A. RT-PCR檢測(cè)PM2.5處理后不同時(shí)間IL-1β的相對(duì)表達(dá)量。B. RT-PCR檢測(cè)PM2.5處理后不同時(shí)間TNF-α的相對(duì)表達(dá)量。C. RT-PCR檢測(cè)PM2.5處理后不同時(shí)間IL-10的相對(duì)表達(dá)量，n=3

2.6 豬舍PM2.5對(duì)PAMs的M1及M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，PM2.5處理4 h時(shí)，M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD80 mRNA表達(dá)水平顯著提高(P<0.01，圖6A)。另外，與對(duì)照組相比，PM2.5處理8 h顯著降低M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206 mRNA表達(dá)水平(P<0.01，圖6B)。

A. RT-PCR檢測(cè)PM2.5處理后不同時(shí)間CD80的相對(duì)表達(dá)量。B. RT-PCR檢測(cè)PM2.5處理后不同時(shí)間CD206的相對(duì)表達(dá)量，n=3

3 討 論

肺泡灌洗液中的主要成分是巨噬細(xì)胞，一般占肺泡灌洗液細(xì)胞的90%以上[17]。目前，通過(guò)肺泡灌洗液提取原代肺泡巨噬細(xì)胞的方法已得到廣泛應(yīng)用。綜合前人研究發(fā)現(xiàn)，利用不同細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中的貼壁時(shí)間不同這一特點(diǎn)[18-20]，通過(guò)差速離心貼壁法可以分離純化獲得PAMs。本試驗(yàn)也采用差速離心貼壁法從豬肺泡灌洗液中分離純化獲得PAMs，并通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)和Diff-quik染色及F4/80免疫熒光標(biāo)記的方法對(duì)PAMs進(jìn)行鑒定，證實(shí)這一方法的有效性。從肺泡灌洗液中分離提取細(xì)胞時(shí)，一定要注意避免血液污染，一旦有大量的血液混入肺泡灌洗液，容易導(dǎo)致紅細(xì)胞裂解不完全，并易造成污染。另外，肺泡灌洗液中可添加0.5%的三抗(青霉素-鏈霉素-兩性霉素B)，這樣可以有效避免分離提取操作時(shí)的二次污染。本研究結(jié)合已有的研究，進(jìn)一步完善了原代PAMs的分離提取方法。本試驗(yàn)結(jié)果表明，分離提取的PAMs在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有出現(xiàn)明顯的增殖現(xiàn)象，在培養(yǎng)72 h后細(xì)胞數(shù)量可以看到明顯的減少，這也是原代巨噬細(xì)胞培養(yǎng)一直令人困擾的問(wèn)題。有研究報(bào)道，巨噬細(xì)胞屬于終末分化細(xì)胞，不會(huì)增殖[20]，但在特殊條件下，巨噬細(xì)胞也可能會(huì)發(fā)生增殖[21]。因此，在細(xì)胞活力較為穩(wěn)定的時(shí)間點(diǎn)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)處理，可以有效避免因原代細(xì)胞脫落死亡而造成的對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。

豬舍PM2.5表面含有大量的LPS和金屬離子等，這些都是誘發(fā)巨噬細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)的重要因素[22-23]。當(dāng)清除PM2.5中LPS后，PM2.5誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)會(huì)減輕[24]。先前的研究證實(shí)，豬舍PM2.5可通過(guò)TLR4/MAPK/NK-κB信號(hào)通路激活PAMs，提高NLRP3炎性小體蛋白水平，誘發(fā)IL-1β、IL-18、TNF-α和COX-2表達(dá)提高[5]。在本研究中，原代PAMs在處理PM2.5后，同樣發(fā)現(xiàn)促炎因子的高表達(dá)，這與前期的研究結(jié)果一致。此外，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抗炎因子IL-10的表達(dá)水平在一定程度上受到抑制，這與M1型巨噬細(xì)胞中抗炎因子低表達(dá)相似[9, 25]。

精氨酸代謝的差異是M1型和M2型巨噬細(xì)胞的主要代謝差異。iNOS在M1型巨噬細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，分解精氨酸為瓜氨酸和NO，在機(jī)體抵御細(xì)胞內(nèi)病原體感染中起到重要作用，M2型巨噬細(xì)胞分泌的精氨酸酶Ⅰ (arginase Ⅰ，Arg-1)可以與iNOS競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合底物精氨酸，分解精氨酸為鳥(niǎo)氨酸和尿素[26]。正常情況下，iNOS與Arg-1的表達(dá)和活性在巨噬細(xì)胞中受到嚴(yán)格調(diào)控，兩者的動(dòng)態(tài)平衡在維持巨噬細(xì)胞功能穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用[27]。PM2.5處理小鼠巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生大量NO，同時(shí)，精氨酸酶活性降低[28]。本試驗(yàn)中，在PM2.5處理下，PAMs產(chǎn)生的NO含量明顯增加，而精氨酸酶的活性顯著下降，這與前人研究結(jié)果相似。本研究表明，PM2.5處理改變了肺泡巨噬細(xì)胞精氨酸代謝關(guān)鍵酶的活性，促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)變。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，豬舍空氣PM2.5中的LPS含量高達(dá)(681.80±19.47) EU·mg-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于大氣PM2.5中的LPS含量[5]。另外，由于LPS已是公認(rèn)的M1型巨噬細(xì)胞激活劑[29]，因此推測(cè)，PM2.5誘導(dǎo)的PAMs極化可能與PM2.5高含量的LPS有關(guān)。CD80是M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物之一，CD206又稱甘露糖受體，是M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物之一[30]。為進(jìn)一步證實(shí)PM2.5引發(fā)PAMs的極化，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了M1和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)情況。研究發(fā)現(xiàn)，CD80 mRNA表達(dá)水平在PM2.5短期處理(4 h)時(shí)顯著上升，而CD206 mRNA表達(dá)水平在8 h處理時(shí)顯著下降。這些結(jié)果表明，PM2.5很可能誘導(dǎo)了巨噬細(xì)胞從M2向M1的轉(zhuǎn)化，破壞了巨噬細(xì)胞M1/M2的平衡，進(jìn)而促進(jìn)炎癥的發(fā)生。

巨噬細(xì)胞M1/M2的平衡對(duì)肺部健康至關(guān)重要。在通常情況下，當(dāng)機(jī)體受到細(xì)菌感染，巨噬細(xì)胞會(huì)向M1極化，啟動(dòng)急性感染期的炎癥反應(yīng)，清除病原菌。炎癥反應(yīng)后期，巨噬細(xì)胞向M2極化，釋放抗炎因子，促進(jìn)組織修復(fù)。巨噬細(xì)胞極化的平衡在哮喘[31]和慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)[32]中具有重要的作用，通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的方向，成為COPD等炎癥性肺部疾病治療的新策略[33]。有研究表明，高濃度的PM2.5暴露會(huì)進(jìn)一步加重哮喘小鼠氣道炎癥[34]。此外，PM2.5濃度的升高也會(huì)加劇COPD引發(fā)的炎性反應(yīng)，誘發(fā)疾病的發(fā)生[35-36]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PM2.5處理破壞了PAMs的極化平衡，加劇炎癥反應(yīng)。因此，PM2.5加劇呼吸道疾病可能與改變巨噬細(xì)胞極化有關(guān)。豬長(zhǎng)期處于高濃度PM2.5環(huán)境，PAMs的極化失衡可能會(huì)增加豬呼吸道疾病發(fā)生率，進(jìn)一步影響豬呼吸道疾病的轉(zhuǎn)歸。

4 結(jié) 論

綜上所述，豬舍來(lái)源的PM2.5在體外破壞了PAMs的M1/M2平衡，這種改變隨時(shí)間的延長(zhǎng)而加深，并促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌高水平的NO和炎癥因子，表明PM2.5在體外能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1極化，加劇炎癥反應(yīng)。體外分離培養(yǎng)的原代PAMs能夠較好地模擬PM2.5對(duì)肺泡微環(huán)境的影響，為后續(xù)研究微生物和病原菌等對(duì)PAMs的影響提供借鑒。