雞TRAF6和TIFA蛋白的序列分析與相互作用驗(yàn)證

趙采芹，王燕碧，朱 杰, 唐 宏，董運(yùn)韜，段志強(qiáng)*

(1.貴州大學(xué) 高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025； 2. 貴州大學(xué)貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025； 3. 山東濱州沃華生物工程有限公司，濱州 256600)

腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor(TNF) receptor-associated factor 6, TRAF6)是一個(gè)具有典型環(huán)指結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶[1]，它作為一種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的關(guān)鍵接頭蛋白，可通過激活下游的細(xì)胞核因子κB(nuclear factor-kB, NF-κB)、激活因子蛋白-1(activator protein-1, AP-1)、PI3K/Akt和JNK/p38以及干擾素調(diào)節(jié)因子等信號(hào)通路影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，并且調(diào)控細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和骨代謝等生物學(xué)過程[2-3]。研究表明，TRAF6蛋白在人和不同動(dòng)物的組織中廣泛表達(dá)，其中在肺、肝、脾、胸腺和法氏囊中高表達(dá)，在腦、心和腿肌中低表達(dá)[4-5]。Jin等[6]研究發(fā)現(xiàn)，TRAF6基因在新城疫病毒(newcastle disease virus, NDV)未感染雞的肺和脾中呈現(xiàn)高表達(dá)，而在NDV感染雞后的免疫器官(法氏囊、脾和胸腺)中表現(xiàn)為高表達(dá)，這表明TRAF6蛋白在抵抗NDV感染中有著重要作用。研究人員利用基因敲除小鼠試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，TRAF6蛋白還在動(dòng)物的天然免疫和獲得性免疫，以及淋巴結(jié)、脾、胸腺和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用[7]。此外，TRAF6蛋白還是病毒感染細(xì)胞后的靶標(biāo)分子，如仙臺(tái)病毒和水泡性口炎病毒能分別以蛋白酶依賴或不依賴的方式降解TRAF6蛋白，抑制NF-κB的激活和I型干擾素以及促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)病毒在細(xì)胞中的復(fù)制[8-9]。

腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子相互作用的具有叉形頭相關(guān)結(jié)構(gòu)域的蛋白(TNF receptor associated factor(TRAF)-interacting protein with a forkhead-associated(FHA)domain, TIFA)是一種在白細(xì)胞介素1(interleukin 1, IL-1)信號(hào)通路中將TRAF6蛋白連接到IL-1受體相關(guān)激酶1的蛋白分子[10]。研究表明，TIFA蛋白與先天性免疫相關(guān)，它通過調(diào)節(jié)TRAF6蛋白的泛素化和寡聚化激活NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生[11]。例如，在細(xì)菌感染人胚腎細(xì)胞過程中，α蛋白激酶1 (alpha-protein kinase 1，ALPK1)的N-端結(jié)構(gòu)域可以直接結(jié)合細(xì)菌脂多糖合成的前體糖分子ADP-heptose，通過蛋白構(gòu)象變化誘導(dǎo)C-端激酶結(jié)構(gòu)域活化，進(jìn)而磷酸化TIFA使其發(fā)生寡聚化，并進(jìn)一步通過與TRAF6蛋白的相互作用激活下游NF-κB信號(hào)通路[12-13]。本課題組最近研究發(fā)現(xiàn)，在NDV感染過程中，病毒的M蛋白可以通過劑量依賴的方式降低幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞中TIFA和TRAF6蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生，促進(jìn)NDV復(fù)制[14]。因此，TIFA和TRAF6蛋白相互作用所介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路在抵抗微生物感染方面具有重要作用，逐漸得到研究人員的重視和關(guān)注。

目前，TRAF6和TIFA蛋白相互作用的報(bào)道僅在非洲爪蟾[15]和人[16]可見。由于雞與人和非洲爪蟾TRAF6和TIFA蛋白的同源性較低，雞TRAF6和TIFA蛋白是否也具有相互作用尚不清楚。因此，本研究首先擴(kuò)增雞TRAF6和TIFA基因，構(gòu)建其重組真核表達(dá)載體pCMV-HA-TRAF6和pEGFP-C1-TIFA，并進(jìn)行雞TRAF6和TIFA蛋白的序列分析；將構(gòu)建的重組真核表達(dá)載體pCMV-HA-TRAF6和pEGFP-C1-TIFA共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，利用熒光共定位和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)試驗(yàn)驗(yàn)證雞TRAF6和TIFA蛋白的相互作用。本研究將為后續(xù)進(jìn)一步探究雞TRAF6和TIFA蛋白相互作用參與的NF-κB信號(hào)通路調(diào)控雞相關(guān)病毒復(fù)制的作用機(jī)制奠定工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與細(xì)胞

真核表達(dá)載體pEGFP-C1、pCMV-HA 購(gòu)自Invitrogen公司；雞胚成纖維細(xì)胞(DF-1)、人胚胎腎細(xì)胞(HEK-293T)和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

TRIzol、2×Taq PCR starMix、T4 DNA連接酶購(gòu)自Invitrogen 公司；卡那霉素、氨芐青霉素、DAPI購(gòu)自Sigma公司；cDNA第一鏈合成試劑盒、限制性內(nèi)切酶SalⅠ、KpnⅠ、XhoⅠ、EcoR Ⅰ、DNA Marker購(gòu)自Thermo Fisher公司；質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自O(shè)mega 公司；FuGENE?HD Transfection Reagent購(gòu)自Promega公司； anti-HA和anti-GFP鼠單克隆抗體購(gòu)自Proteintech公司；RIPA(弱)細(xì)胞裂解液、Protein A+G瓊脂球、預(yù)染蛋白Marker、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)、Cy3標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)、SDS-PAGE上樣緩沖液(5×)、 極超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中雞TRAF6基因登錄號(hào)(XM_015287208.2)和TIFA基因登錄號(hào)(XM_015276339.2)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增雞TRAF6和TIFA基因ORF序列的特異性引物(表1)。引物由擎科(成都)生物技術(shù)有限公司合成。

表1 構(gòu)建重組真核表達(dá)載體所用引物信息

1.4 雞TRAF6和TIFA 基因的RT-PCR擴(kuò)增

使用TRIzol法從DF-1細(xì)胞中提取總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以設(shè)計(jì)合成的特異性引物分別擴(kuò)增雞TRAF6和TIFA基因的CDS區(qū)。PCR反應(yīng)體系：cDNA模板1.0 μL，2×Taq PCR starMix 10.0 μL，上、下游引物 (10 μmol·L-1)各1.0 μL，加ddH2O加至20.0 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min； 94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；12 ℃保存。將獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 雞TRAF6和TIFA 基因重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建

分別使用SalⅠ、KpnⅠ和XhoⅠ、EcoR Ⅰ限制性內(nèi)切酶對(duì)真核表達(dá)載體pCMV-HA和pEGFP-C1以及TRAF6和TIFA基因的膠回收產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后進(jìn)行切膠純化，回收目的片段后進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切鑒定。將鑒定正確的重組真核表達(dá)載體pCMV-HA-TRAF6和pEGFP-C1-TIFA送擎科(成都)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.6 雞TRAF6和TIFA基因的生物信息學(xué)分析

利用生物信息學(xué)在線軟件ProtParam(http://us.expasy.org/tools/protparam.html/)、SOPMA(http://npsapbil.ibcp.fr/cgi-bin/nps a_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(http://swissmodel.ex-pasy.org/)分別對(duì)雞TRAF6和TIFA基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析；從GenBank下載不同物種TRAF6和TIFA蛋白序列，用MegAlign軟件進(jìn)行氨基酸同源性分析；用NCBI服務(wù)器上的Protein數(shù)據(jù)庫(kù)和MegAlign軟件對(duì)雞TRAF6和TIFA蛋白氨基酸序列的功能結(jié)構(gòu)域保守性進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；用PSORTⅡ(https://psort.hgc.jp/form2.html)軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位分析；用在線軟件STRING(https://version11.string-db.org/cgi/input.pl?sessionId=TqSW5v1qFKp0&input_page_show_search=on)對(duì)TRAF6和TIFA蛋白相互作用的細(xì)胞蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.7 HEK-293T細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

將HEK-293T細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基置于37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d，按5×105個(gè)·孔-1的量將消化后的HEK-293T細(xì)胞鋪在35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞完全貼壁生長(zhǎng)至80%左右，將純化的空載體或重組真核表達(dá)載體和脂質(zhì)體混合后分別共轉(zhuǎn)染細(xì)胞(轉(zhuǎn)染組分為3組，分別為pEGFP-C1和pCMV-HA-TRAF6；pCMV-HA和pEGFP-C1-TIFA；pEGFP-C1-TIFA和pCMV-HA-TRAF6)，輕輕吹打混勻后室溫靜置25 min，然后加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放入37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.8 重組蛋白的熒光觀察

重組真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞后24 h，PBS洗滌細(xì)胞3次，依次加入適量4%多聚甲醛固定、0.25% Triton X-100破膜、含10%小牛血清的PBS封閉；PBS洗滌3遍，加入anti-HA鼠多克隆抗體于37 ℃作用2 h；PBS洗滌3遍，加入Cy3標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (H+L)于37 ℃作用1 h；PBS洗滌3遍，加入DAPI染細(xì)胞核10 min，最后用倒置熒光顯微鏡觀察熒光。將獲得的熒光圖片用Photoshop CS3軟件進(jìn)行Merge處理，觀察重組蛋白的共定位。

1.9 免疫共沉淀(Co-IP)試驗(yàn)

將重組真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞后36 h，用PBS清洗細(xì)胞3次，加入適量RIPA(弱)細(xì)胞裂解液(含PMSF)裂解細(xì)胞，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，收集上清，加入2 μg anti-GFP鼠單克隆抗體，4 ℃作用過夜；加入40 μL protein A+G 瓊脂球繼續(xù)作用3 h；用預(yù)冷的RIPA洗滌protein A+G瓊脂球，重復(fù)3次后加入20 μL SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸5 min，離心收集上清，對(duì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE和轉(zhuǎn)膜，最后用anti-HA鼠單克隆抗體進(jìn)行Western blot，檢測(cè)蛋白之間是否存在相互作用。反之，以anti-HA鼠單克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀，用anti-GFP鼠單克隆抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 雞TRAF6和TIFA基因的RT-PCR擴(kuò)增

以DF-1細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，使用特異性引物分別擴(kuò)增雞TRAF6和TIFA基因的CDS區(qū)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果獲得與預(yù)期大小相符的TRAF6 (1 657 bp，圖1A)和TIFA(586 bp，圖1B)基因的目的條帶，但特異性引物含酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基的長(zhǎng)度，分別為19和22 bp，因此，最終的CDS區(qū)長(zhǎng)度分別為1 638和564 bp。

A. 雞TRAF6基因PCR擴(kuò)增結(jié)果(M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1～2. 雞TRAF6基因)；B. 雞TIFA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果(M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1～2. 雞TIFA基因)

2.2 雞TRAF6和TIFA基因重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建

將獲得的雞TRAF6和TIFA基因片段分別亞克隆至真核表達(dá)載體pCMV-HA和pEGFP-C1，用于構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pCMV-HA-TRAF6和pEGFP-C1-TIFA。雙酶切鑒定結(jié)果顯示，重組真核表達(dá)載體pCMV-HA-TRAF6酶切后獲得3 782 bp的載體條帶和1 657 bp的目的基因條帶(圖2A)，而重組真核表達(dá)載體pEGFP-C1-TIFA酶切后則獲得約4 731 bp的載體條帶和586 bp的目的基因條帶(圖2B)。測(cè)序結(jié)果顯示，與GenBank中登錄的雞TRAF6和TIFA基因序列相比，送測(cè)的9個(gè)樣中雞TRAF6基因CDS區(qū)第148位核苷酸均存在堿基突變(T→C)，導(dǎo)致苯丙氨基酸(F)變?yōu)榱涟被?L)，但F和L均為非極性疏水性氨基酸，推測(cè)該位點(diǎn)本身就存在突變；而TIFA基因第265位核苷酸發(fā)生一個(gè)堿基突變(T→C)，但沒有引起氨基酸的改變。

M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：1～2. 重組真核表達(dá)載體pCMV-HA-TRAF6雙酶切產(chǎn)物；3～4. 重組真核表達(dá)載體pEGFP-C1-TIFA雙酶切產(chǎn)物

2.3 雞TRAF6和TIFA蛋白的生物信息學(xué)分析

2.3.1 雞TRAF6和TIFA蛋白的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用生物信息學(xué)在線軟件ProtParam、SOPMA和SWISS-MODEL對(duì)雞TRAF6和TIFA蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示，雞TRAF6蛋白共編碼545個(gè) 氨基酸，分子量約為 62 ku，理論pI為6.14；雞TIFA蛋白共編碼187個(gè)氨基酸，分子量約為22 ku， 理論pI為5.18。雞TRAF6蛋白含有豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中無規(guī)則卷曲占47.08%、α-螺旋占38.14%、延伸鏈占11.86%、β-轉(zhuǎn)角占2.92%；雞TIFA蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲占51.87%、α-螺旋占27.81%、延伸鏈占16.58%、β-轉(zhuǎn)角占3.74%。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，雞TRAF6和TIFA蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖3)與二級(jí)結(jié)構(gòu)相符，主要由無規(guī)則卷曲和α-螺旋構(gòu)成。

圖3 雞TRAF6(A)和TIFA(B)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.3.2 雞TRAF6和TIFA蛋白氨基酸同源性分析 用MegAlign 軟件將雞與人、鼠、牛、豬和非洲爪蟾的TRAF6和TIFA蛋白進(jìn)行氨基酸同源性分析，結(jié)果表明，雞與人和其他哺乳動(dòng)物TRAF6和TIFA蛋白的同源性分別為76.4%～80.3% 和49.7%～53.3%，而與非洲爪蟾的同源性分別為 69.4% 和49.7%(圖4A、B)，其中雞與牛TRAF6蛋白的同源性最高(80.3%)，與非洲爪蟾的同源性最低(69.4%)，而雞與牛TIFA蛋白的同源性最高(53.3%)，與豬和非洲爪蟾的同源性最低(49.7%)。

數(shù)字1～9表示不同物種；表格右上角數(shù)字表示氨基酸同源性，表格左下角數(shù)字表示變異度

2.3.3 雞TRAF6和TIFA蛋白功能結(jié)構(gòu)域保守性分析 用NCBI服務(wù)器上的Protein數(shù)據(jù)庫(kù)和MegAlign 軟件對(duì)雞TRAF6和TIFA蛋白氨基酸序列的功能結(jié)構(gòu)域保守性進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。功能結(jié)構(gòu)域分析顯示，雞TRAF6蛋白中存在3個(gè)明顯的功能結(jié)構(gòu)域，主要包括RING結(jié)構(gòu)域、zinc-finger結(jié)構(gòu)域和MATH結(jié)構(gòu)域，分別在69～107、204～360和378～505位氨基酸區(qū)域。TIFA蛋白存在1個(gè)FHA結(jié)構(gòu)域，位于47～104個(gè)氨基酸區(qū)域。分別對(duì)雞、人和非洲爪蟾的TRAF6和TIFA蛋白功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行保守性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖5)，與非洲爪蟾和人TRAF6蛋白相比，雞TRAF6蛋白的RING結(jié)構(gòu)域氨基酸變異位點(diǎn)主要位于92(G/A)位氨基酸，zinc-finger結(jié)構(gòu)域氨基酸變異位點(diǎn)主要位于325(Q/E)和340(V/I)位氨基酸，MATH結(jié)構(gòu)域氨基酸變異位點(diǎn)主要位于394(R/K)、398(M/I)、414(L/M)、428(F/Y)、488(H/P)位氨基酸；與非洲爪蟾和人TIFA蛋白相比，雞TIFA蛋白的FHA結(jié)構(gòu)域變異位點(diǎn)主要位于47～48(MA/VV)、75～77(FYR/LFK)位氨基酸。以上結(jié)果說明，雞和人以及非洲爪蟾TRAF6和TIFA蛋白功能結(jié)構(gòu)域氨基酸位點(diǎn)的保守性較低。

方框表示氨基酸變異位點(diǎn)

2.3.4 雞TRAF6和TIFA蛋白亞細(xì)胞定位分析 運(yùn)用在線軟件PSORTⅡ預(yù)測(cè)雞TRAF6和TIFA 蛋白的亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明，雞TRAF6蛋白在細(xì)胞核中占82.6%、細(xì)胞質(zhì)占13.0%，表明雞 TRAF6蛋白主要定位在細(xì)胞核。TIFA蛋白在細(xì)胞核中占56.5%、細(xì)胞質(zhì)占17.4%、線粒體占17.4%，表明雞TIFA蛋白主要定位在細(xì)胞核。

2.3.5 雞TRAF6和TIFA蛋白相互作用蛋白的預(yù)測(cè) 運(yùn)用在線軟件STRING對(duì)雞TRAF6和TIFA蛋白可能存在的互作蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示(圖6)，與TRAF6和TIFA蛋白可能存在互作的蛋白有IL1R1、IL1RL2、IRAK4、UBE2N、TICAM1、TAB2、TAB1、MAP3K7、IRF7、TLR4、MYD88、TRAF3等。其中，IL1R1和IL1RL2同屬于IL-1家族受體，IL1R1在許多細(xì)胞因子誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和宿主防御中發(fā)揮重要作用[17-18]，IL1RL2是炎癥反應(yīng)中重要的銜接分子[19]。TLR4可以通過MYD88和TRAF6來調(diào)控NF-κB信號(hào)通路參與炎癥反應(yīng)， TLR4/MYD88/NF-κB信號(hào)通路通過調(diào)控促炎因子的產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)心肌組織的炎癥反應(yīng)[20]。IRF7是I型干擾素的重要調(diào)節(jié)因子，在抵抗病毒感染中發(fā)揮著重要作用，另外，研究表明，IRF7的過表達(dá)會(huì)增加人巨噬細(xì)胞中免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus-1，HIV-1)的復(fù)制，在NF-κB信號(hào)通路中TRAF6的下調(diào)也會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞中HIV-1復(fù)制增強(qiáng)[21]。

圖6 與TRAF6和TIFA相互作用蛋白的預(yù)測(cè)

2.4 雞TRAF6和TIFA蛋白的熒光共定位

將雞TRAF6和TIFA基因重組真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞后24 h，對(duì)其進(jìn)行熒光觀察。熒光共定位結(jié)果顯示，當(dāng)pCMV-HA-TRAF6和pEGFP-C1-TIFA共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，重組蛋白EGFP-TIFA和HA-TRAF6主要定位在細(xì)胞核；當(dāng)pEGFP-C1和pCMV-HA-TRAF6共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，EGFP標(biāo)簽蛋白和重組蛋白HA-TRAF6在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均存在；而當(dāng)pEGFP-C1-TIFA和pCMV-HA共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，重組蛋白EGFP-TIFA和HA標(biāo)簽蛋白同樣定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)(圖7)。

圖7 雞TRAF6和TIFA重組蛋白在HEK-293T細(xì)胞中的共定位(200×)

2.5 雞TRAF和TIFA蛋白相互作用的驗(yàn)證

為驗(yàn)證雞TRAF6和TIFA蛋白在細(xì)胞內(nèi)是否存在相互作用，將重組真核表達(dá)載體pMCV-HA-TRAF6和pEGFP- C1-TIFA以及空載體pMCV-HA和pEGFP-C1分別進(jìn)行組合共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后36 h收集細(xì)胞裂解上清進(jìn)行Co-IP試驗(yàn)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，重組蛋白HA-TRAF6能與 EGFP-TIFA發(fā)生相互作用，而重組蛋白HA-TRAF6和EGFP標(biāo)簽蛋白以及重組蛋白EGFP-TIFA和HA標(biāo)簽蛋白均不發(fā)生相互作用 (圖8)。

圖8 Co-IP驗(yàn)證雞TRAF6和TIFA蛋白的相互作用

3 討 論

TRAF6作為重要的多功能信號(hào)接頭分子，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[22]。研究表明，TRAF6蛋白含有RING、zinc-finger和MATH結(jié)構(gòu)域[1]，其中MATH結(jié)構(gòu)域具有高度保守性，可以介導(dǎo)TRAF蛋白分子間同源三聚體的形成以及與不同受體蛋白MATH結(jié)構(gòu)域或胞質(zhì)中含有該結(jié)構(gòu)域的蛋白相結(jié)合[23]；而RING和zinc-finger結(jié)構(gòu)域在信號(hào)傳導(dǎo)通路中發(fā)揮泛素連接酶的作用，可以激活下游信號(hào)通路和催化底物的泛素化[24]。本研究進(jìn)行了雞、人和非洲爪蟾TRAF6蛋白功能結(jié)構(gòu)域氨基酸位點(diǎn)的變異分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雞和人及非洲爪蟾TRAF6蛋白中存在多個(gè)氨基酸位點(diǎn)變異，這些變異的氨基酸位點(diǎn)可能會(huì)導(dǎo)致雞TRAF6蛋白在細(xì)胞中的免疫調(diào)控機(jī)制不同。而NF-κB作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)細(xì)胞受到病毒和細(xì)菌感染，NF-κB通過TARF6細(xì)胞因子刺激后可被激活，增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明，TRAF6與NF-κB受體激活因子(receptor activator of nuclear factor-κB, RANK)相結(jié)合，參與IL-1及脂多糖等因子介導(dǎo)的信號(hào)通路，激活NF-κB信號(hào)通路[25]。近年來，關(guān)于TRAF6上游蛋白分子介導(dǎo)的TRAF6/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)報(bào)道越來越多，如TLR4/TRAF6/NF-κB、IRAK1/TRAF6/NF-κB和IL-17RA/ TRAF6/NF-κB等[26-28]。已有研究表明，廣州管圓線蟲引起的曲霉菌感染可以通過下調(diào)IL-17RA/TRAF6/NF-κB信號(hào)通路來降低TRAF6的表達(dá)，從而促進(jìn)曲霉菌的感染[28]。志賀菌感染可以抑制宿主的TRAF6/NF-κB信號(hào)通路，從而抑制炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生來促進(jìn)志賀菌的復(fù)制[29]。另外，Zhang等[30]研究表明，博爾納病毒1感染下調(diào)了人小膠質(zhì)細(xì)胞中IRAK1和TRAF6蛋白的表達(dá)，并抑制NF-κB信號(hào)途徑，從而在宿主細(xì)胞中降低細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促進(jìn)病毒的復(fù)制。這些研究結(jié)果表明，TRAF6蛋白介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路在研究病毒和細(xì)菌感染方面有重要意義。

TIFA是由Takatsuna等[10]通過酵母菌雙雜交技術(shù)首次篩選并被鑒定為一種與TRAF6相互作用的蛋白。在結(jié)構(gòu)上，TIFA具有N末端叉形頭相關(guān)結(jié)構(gòu)域(the forkhead-associated，F(xiàn)HA)和C末端有1個(gè)共同的TRAF6結(jié)合基序[31]。其中，F(xiàn)HA結(jié)構(gòu)域已經(jīng)被證實(shí)可以與磷酸蘇氨酸和磷酸絲氨酸結(jié)合，其主要功能與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)，以及在細(xì)胞生長(zhǎng)、DNA損傷修復(fù)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程中都發(fā)揮關(guān)鍵作用[32-33]。本研究對(duì)TIFA蛋白功能結(jié)構(gòu)域氨基酸位點(diǎn)變異分析發(fā)現(xiàn)，雞和人及非洲爪蟾TIFA蛋白中存在多個(gè)氨基酸位點(diǎn)變異，說明TIFA蛋白功能結(jié)構(gòu)域在哺乳動(dòng)物中的保守性較低，而雞TIFA蛋白功能結(jié)構(gòu)域氨基酸位點(diǎn)的變異可能會(huì)導(dǎo)致其功能的改變。Huang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于人正常的TIFA與TRAF6蛋白結(jié)構(gòu)域之間的弱結(jié)合，將人TIFA蛋白的C末端第174位氨基酸S突變?yōu)镼和第179位氨基酸M突變?yōu)镈可以增強(qiáng)TIFA與TRAF6蛋白TRAF結(jié)構(gòu)域之間的相互作用。對(duì)雞TIFA蛋白氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，雞TIFA蛋白第174位氨基酸為Q，因此，該位點(diǎn)的變化可能會(huì)增強(qiáng)雞TIFA與TRAF6蛋白之間的相互作用。

Inoue等[15]在非洲爪蟾中首次證實(shí)，TIFA蛋白C末端的TRAF6結(jié)合基序結(jié)合TRAF6蛋白后可以激活NF-κB信號(hào)通路，而攜帶TRAF6結(jié)合位點(diǎn)突變的TIFA無法激活NF-κB[10]。另外，研究發(fā)現(xiàn)，人TRAF6蛋白的TRAF結(jié)構(gòu)域和TIFA蛋白的FHA結(jié)構(gòu)域之間的相互作用是介導(dǎo)NF-κB激活的重要因素[16]，并且TIFA/TRAF6/NF-κB信號(hào)通路的活化也是產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子的關(guān)鍵通路[13-14]。駱磊[34]研究發(fā)現(xiàn)，TRAF6及其下游基因在NDV感染的雞胚成纖維細(xì)胞或SPF雞免疫器官中均表現(xiàn)為顯著上調(diào)表達(dá)，可能在雞抵抗NDV感染過程中發(fā)揮作用，但是TIFA/TRAF6/NF-κB信號(hào)通路在雞相關(guān)病毒感染方面的研究還未見報(bào)道。近年來，ALPK1控制TIFA/TRAF6/NF-κB依賴的先天免疫抵抗細(xì)菌感染的研究也逐漸被報(bào)道[35-37]。例如，鼠傷寒沙門菌和志賀菌感染細(xì)胞后會(huì)降低ALPK1的產(chǎn)生，并且誘導(dǎo)TIFA和TRAF6蛋白在感染的細(xì)胞中形成寡聚體，進(jìn)而抑制NF-κB的活化以及細(xì)胞因子的產(chǎn)生[37]。鑒于TRAF6和TIFA蛋白相互作用在NF-κB信號(hào)通路調(diào)控的免疫應(yīng)答中發(fā)揮的重要作用，開展TIFA/TRAF6/NF-κB信號(hào)通路調(diào)控雞相關(guān)病毒復(fù)制作用機(jī)制的研究具有重要意義。本研究通過對(duì)雞TRAF6和TIFA蛋白的同源性分析發(fā)現(xiàn)，雞與人和其他哺乳動(dòng)物及其非洲爪蟾的TRAF6和TIFA蛋白之間的同源性差異較大，并且它們功能結(jié)構(gòu)域的氨基酸并不保守。另外，雖然雞TRAF6和TIFA重組蛋白單獨(dú)表達(dá)時(shí)定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，但是兩者共表達(dá)時(shí)卻共同定位在細(xì)胞核。進(jìn)一步通過Co-IP證實(shí)，雞TRAF6和TIFA蛋白存在相互作用，說明兩者主要在細(xì)胞核中發(fā)生相互作用。以上研究將為后續(xù)深入探討與雞TRAF6和TIFA蛋白相互作用的細(xì)胞蛋白以及兩者互作調(diào)控雞相關(guān)病毒復(fù)制的作用機(jī)制奠定重要基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了雞TRAF6和TIFA基因的重組真核表達(dá)載體pCMV-HA-TRAF6和pEGFP-C1-TIFA；雖然雞與人和其他哺乳動(dòng)物以及非洲爪蟾TRAF6和TIFA蛋白的序列同源性及功能結(jié)構(gòu)域保守性均較低，但是利用熒光共定位和Co-IP試驗(yàn)證實(shí)，雞TRAF6和TIFA蛋白能在細(xì)胞核中發(fā)生相互作用。