基于PI3K/AKT通路探討電針預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制*

全愛(ài)君，魏 巍，張師偉，蔡國(guó)鋒,李世偉，尚莉莉

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040)

臨床治療過(guò)程中對(duì)于發(fā)病率、致殘率和死亡率都比較高的缺血性腦卒中治療最有效的方法就是及時(shí)恢復(fù)缺血區(qū)域的血液供應(yīng)，挽救缺血半暗帶，但缺血后的血液恢復(fù)會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致組織損傷和功能障礙[1-2]。醫(yī)藥工作者普遍認(rèn)為降低再灌注損傷是治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵因素[3-4]。腦缺血再灌注損傷機(jī)制并不明確，但主要與能量代謝障礙、線粒體損傷、氧化應(yīng)激、鈣超載、興奮性氨基酸毒性和神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)[5-8]。

磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(Serine /threonine kinase，Akt)信號(hào)通路是膜受體信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑，對(duì)于維持細(xì)胞的生存和抑制細(xì)胞凋亡起關(guān)鍵作用[9]，Akt是PI3K下游信號(hào)通路的主要靶點(diǎn)，處于中心環(huán)節(jié)，活化的Akt是發(fā)揮抗凋亡的關(guān)鍵作用，具有抑制多種刺激引起的細(xì)胞凋亡作用[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt是促進(jìn)細(xì)胞存活的重要信號(hào)通路，在腦缺血再灌注過(guò)程中能夠減輕對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷，促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞存活作用[12-14]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是在特定的缺氧條件下廣泛存在的一種缺氧應(yīng)答調(diào)控因子，通過(guò)轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，使機(jī)體適應(yīng)缺血或缺氧環(huán)境，同時(shí)研究證明HIF-1α在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT/HIF-1α信號(hào)通路能夠減輕肺缺血再灌注損傷[17-18]。

研究表明,電針可以調(diào)控腦缺血再灌注大鼠海馬CA1區(qū)的CREB及其磷酸化水平(p-CREB)的表達(dá)，減小梗死面積，改善認(rèn)知功能。電針曲池、足三里穴，頭針透刺百會(huì)、曲鬢穴治療方法可調(diào)控炎癥相關(guān)信號(hào)通路。另外還可以降低腦組織中缺血區(qū)的環(huán)氧化酶2(COX-2)并增強(qiáng)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的表達(dá)[19-20]。本實(shí)驗(yàn)建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，給予重復(fù)電針預(yù)處理百會(huì)穴、曲鬢穴與神庭穴，探討其對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后的保護(hù)機(jī)制。研究是否通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt/HIF-1α信號(hào)通路對(duì)腦缺血再灌注引起的細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用。本研究采用線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，觀察電針預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注損傷神經(jīng)功能和腦梗死體積影響及對(duì)腦組織中p-Akt、Caspase-3和HIF-1α表達(dá)情況，探討電針預(yù)處理治療腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

48只健康SD大鼠，體質(zhì)量(240±10)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)觀察3 d。將大鼠完全隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、電針預(yù)處理組和LY294002組(2.5 μg/kg)。模型組、電針預(yù)處理組和LY294002組大鼠進(jìn)行腦缺血再灌注模型制備。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.2 藥品及試劑

LY294002(美國(guó)Sigma公司);兔抗大鼠p-Akt多克隆抗體、兔抗大鼠Caspase-3多克隆抗體及兔抗大鼠HIF-1α多克隆抗體(愛(ài)必信公司);辣根酶過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔(北京中杉金橋)。

1.3 腦缺血再灌注模型建立

將連續(xù)給藥7 d的各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物按照Longa線栓法改良制作大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷模型[11]。稱(chēng)量大鼠體質(zhì)量并且按體質(zhì)量給藥。腹腔注射給予10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，頸前術(shù)區(qū)脫毛、消毒，沿頸部正中線切開(kāi)皮膚，逐層分離暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，用動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端后，在頸內(nèi)動(dòng)脈上距離頸總動(dòng)脈分叉處約2 mm處做一切口，將備好的線栓經(jīng)切口處插入大腦中動(dòng)脈始端，栓塞大腦中動(dòng)脈，造成局灶性腦缺血。缺血2 h后拔除栓線實(shí)施再灌注24 h。

1.4 干預(yù)方法

1.4.1 假手術(shù)組 大鼠使用與模型組相同的處理手段，但不插入線栓對(duì)大腦中動(dòng)脈進(jìn)行阻閉，不進(jìn)行電針預(yù)處理。

1.4.2 模型組 大鼠進(jìn)行模型制備，不給予電針干預(yù)，其他處理方法均與電針預(yù)處理組一致。

1.4.3 電針預(yù)處理組 造模前先進(jìn)行電針干預(yù)，參照華興邦等制定的《大鼠穴位圖譜的研制》取穴，取百會(huì)穴、曲鬢穴和神庭穴，以0.40 mm×0.25 mm毫針，15°角針刺,斜刺進(jìn)針2 mm，百會(huì)穴連正極，神庭穴連負(fù)極，連成一組，曲鬢穴連成一組，針刺后施以電針(電流0.3 mA,疏密波,疏波頻率20 Hz,密波頻率100 Hz);曲池、足三里穴，以0.40 mm×0.25 mm毫針，直刺進(jìn)針，直刺2 mm，連電針，參數(shù)為：疏密波，刺激電流l～2 mA，頻率2/15 Hz，波寬0.2～0.6 ms。通電10 min，留針不通電5 min，連續(xù)重復(fù)4次，共1 h，電針干預(yù)結(jié)束后觀察30 min行造模手術(shù)。

1.4.4 LY294002組 尾靜脈注射LY294002(2.5 μg/kg)。

1.5 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分

按照Longa 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[11]進(jìn)行神經(jīng)功能缺失程度評(píng)分。0分:無(wú)神經(jīng)功能缺失癥狀，活動(dòng)正常;1分:不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪;2分:出現(xiàn)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分:行走時(shí)身體向偏癱側(cè)傾倒者;4分:不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失者。其中選取評(píng)分為1～3分并且無(wú)蛛網(wǎng)膜下腔出血的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.6 腦梗死體積測(cè)定

取缺血再灌注后腦組織，-20 ℃冷凍30 min，去除小腦、低位腦干及嗅球，腦組織從額極向后做連續(xù)冠狀切成5片，置于含2% TTC的磷酸鹽緩沖液中，37 ℃恒溫箱孵育染色30 min，置于4%多聚甲醛固定24 h后拍照。采用圖像分析軟件分析計(jì)算腦梗死體積百分比。

1.7 Western blot檢測(cè)

取缺血側(cè)大腦組織100 mg置于1 mL組織細(xì)胞裂解液中，超聲細(xì)胞破碎儀低溫勻漿。12 000 r/min 4 ℃離心15 min，取上清，取2 μL蛋白溶液利用Direct Detect Spectrometer-Sample Measuring紅外微定量分析儀直接檢測(cè)蛋白濃度，取相同蛋白進(jìn)行上樣經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，TBS-T洗膜2次，10 min/次，5%脫脂奶粉室溫孵育2 h后，加入p-AKT、Caspase3和HIF-1α一抗工作液，4 ℃過(guò)夜， TBS-T緩沖液洗膜5次，10 min/次，加入二抗工作液，室溫孵育1 h，TBS-T洗膜5次，10 min/次，采用ECL法顯色。凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析。

1.8 腦組織中SOD、MDA和ROS含量測(cè)定

取各組缺血側(cè)大腦組織100 mg，置于1.5 mL離心管中，超聲細(xì)胞破碎儀低溫勻漿置于冰上靜置10 min，3 500 r/min離心10 min，取上清液待測(cè)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求測(cè)定SOD、MDA和ROS含量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果

如表1所示，假手術(shù)組未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損，其余各組均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損。與假手術(shù)組比較，模型組出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能損傷；與模型組比較，LY294002組神經(jīng)功能缺損明顯加重，表明抑制PI3K/AKT通路的激活，能夠加重神經(jīng)功能缺損；與模型組比較，電針預(yù)處理組神經(jīng)功能缺損情況明顯減輕，表明電針預(yù)處理能夠明顯改善腦缺血再灌注引起的神經(jīng)功能缺損。腦梗死體積測(cè)定結(jié)果顯示假手術(shù)組腦組織未出現(xiàn)梗死病灶，其余各組均出現(xiàn)不同程度的梗死病灶。與模型組比較，LY294002組的梗死病灶體積明顯增加(P<0.05),表明抑制PI3K/AKT通路的激活能夠明顯增加腦缺血再灌注損傷；與模型組比較，電針預(yù)處理組腦梗死病灶體積明顯減少(P<0.05)，表明電針預(yù)處理能夠改善腦缺血再灌注損傷。

表1 腦缺血再灌注神經(jīng)功能缺損評(píng)分及腦梗死體積測(cè)定

2.2 電針預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注損傷腦組織中p-Akt、Caspase3和HIF-1α蛋白影響

如圖1～2所示，腦組織中存在基礎(chǔ)的p-Akt和HIF-1α分泌，腦缺血再灌注后p-Akt和HIF-1α表達(dá)明顯增加；與假手術(shù)組比較，模型組腦組織中p-Akt和HIF-1α表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，電針預(yù)處理組腦組織中p-Akt和HIF-1α表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，LY294002組腦組織中p-Akt表達(dá)明顯降低(P<0.05)；如圖3所示，與假手術(shù)組比較，模型組腦組織中Caspase-3的表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，電針預(yù)處理組腦組織中Caspase-3的表達(dá)明顯減少(P<0.05)；與模型組比較，LY294002組腦組織中Caspase-3表達(dá)明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)表2。

注：1.假手術(shù)組；2.模型組；3.電針預(yù)處理組；4.LY294002組。圖1 腦缺血再灌注損傷腦組織中HIF-1α蛋白表達(dá)

注：1.假手術(shù)組；2.模型組；3.電針預(yù)處理組；4.LY294002組。圖2 腦缺血再灌注損傷腦組織中p-Akt蛋白表達(dá)

注：1.假手術(shù)組；2.模型組；3.電針預(yù)處理組；4.LY294002組。圖3 腦缺血再灌注損傷腦組織中Caspase-3蛋白表達(dá)

表2 電針預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注損傷腦組織中p-Akt、Caspase-3和HIF-1α蛋白影響

2.3 電針預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注損傷腦組織中SOD、GSH和MDA含量的影響

如表3所示，與假手術(shù)組比較，模型組腦組織內(nèi)SOD、MDA和GSH水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較，電針預(yù)處理能夠明顯降低腦組織內(nèi)MDA水平,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，明顯升高腦組織內(nèi)SOD和GSH水平,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明腦缺血再灌注后機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，電針預(yù)處理組能夠明顯減輕氧化應(yīng)激。

表3 電針預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注損傷腦組織中SOD、GSH和MDA含量影響

3 討論

腦缺血再灌注損傷病理學(xué)機(jī)制復(fù)雜，研究表明通過(guò)調(diào)控機(jī)體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)能夠明顯改善缺血再灌注損傷，在此調(diào)控過(guò)程中PI3K/AKT信號(hào)通路具有重要的作用[21]。本研究發(fā)現(xiàn)預(yù)處理給予電針預(yù)處理后能夠明顯降低腦缺血再灌注對(duì)神經(jīng)功能損傷，降低腦梗死體積百分比，說(shuō)明電針預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用；同時(shí)預(yù)處理給予PI3K/Akt通路抑制劑LY294002能夠明顯增加腦缺血再灌注對(duì)神經(jīng)功能損傷，增加腦梗死體積，表明抑制PI3K/Akt通路的激活能夠加重腦缺血再灌注損傷；本研究發(fā)現(xiàn)建立局灶性腦缺血再灌注模型能夠明顯增加p-Akt的表達(dá)，說(shuō)明腦缺血再灌注能夠激活PI3K/Akt轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；預(yù)處理給予電針預(yù)處理能夠極顯著增加p-Akt的表達(dá)，說(shuō)明電針預(yù)處理能夠在腦缺血再灌注過(guò)程中激活PI3K/Akt信號(hào)通路。該研究與先前各種組織缺血再灌注損傷研究結(jié)果一致[22-23]。

HIF-1α在缺血再灌注損傷疾病中具有重要的作用，研究表明HIF-1α與腦血管疾病具有十分密切的關(guān)系[24-25]。細(xì)胞內(nèi)氧濃度在1%～3%輕度缺氧情況下HIF-1α的表達(dá)具有抑制細(xì)胞凋亡的作用[26-27]。研究發(fā)現(xiàn)在腦缺血狀態(tài)下，HIF-1α能夠通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl2/Bax、TNFα通路及ERK1/2通路來(lái)抑制Caspase3活化，進(jìn)而抑制Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)擴(kuò)大，減少神經(jīng)細(xì)胞的損傷[28-29]。本研究發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注過(guò)程中HIF-1α的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，說(shuō)明腦缺血再灌注過(guò)程中HIF-1α表達(dá)增加；預(yù)處理組給予電針預(yù)處理在腦缺血再灌注過(guò)程中HIF-1α的表達(dá)明顯高于模型組，說(shuō)明給予電針預(yù)處理能夠進(jìn)一步激活HIF-1α的表達(dá)。

Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶和執(zhí)行者，細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)途徑[30]。本研究發(fā)現(xiàn)給予電針預(yù)處理后腦缺血再灌注后Caspase-3表達(dá)明顯低于模型組，說(shuō)明電針預(yù)處理能夠明顯降低腦缺血再灌注損傷引起神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，這與任德啟等人研究結(jié)果一致[31]；給予LY294002阻斷PI3K/Akt通路的激活能夠明顯增加Caspase-3表達(dá)，說(shuō)明阻斷PI3K/Akt通路促使神經(jīng)細(xì)胞凋亡，這與王耀伍等人研究結(jié)果相符合。綜上所述電針預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路、抑制Caspase-3表達(dá)有關(guān)。

已有大量研究證實(shí)腦缺血再灌注損傷時(shí)，腦組織內(nèi)伴隨著大量自由基的產(chǎn)生及介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化是缺血再灌注損傷的重要發(fā)病機(jī)制[32]。SOD和GSH是機(jī)體固有的氧自由基清除劑，體現(xiàn)機(jī)體清除氧自由基能力，MDA是氧自由基引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，反映機(jī)體過(guò)氧化程度。本研究發(fā)現(xiàn)模型組腦組織中SOD和GSH含量明顯降低，MDA含量明顯增加，電針預(yù)處理組能夠明顯增加腦組織中SOD和GSH表達(dá)，MDA含量明顯降低，說(shuō)明氧化應(yīng)激參與腦缺血再灌注損傷疾病的發(fā)生發(fā)展，電針預(yù)處理組能夠通過(guò)提高SOD和GSH含量、降低MDA含量抵抗氧化應(yīng)激對(duì)腦缺血再灌注的損傷。

百會(huì)穴為諸陽(yáng)之會(huì)，開(kāi)竅醒神、振奮陽(yáng)氣;神庭穴清散頭風(fēng)、鎮(zhèn)靜安神;此二穴皆屬督脈，提升陽(yáng)氣。百會(huì)穴其治療功效從《黃帝內(nèi)經(jīng)》《針灸甲乙經(jīng)》《針灸大成》記載可以改善腦組織供血；能提高機(jī)體的抵抗力，激活、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫機(jī)制，增強(qiáng)機(jī)體的防衛(wèi)功能。本研究證明了電針預(yù)處理百會(huì)穴、曲鬢穴和神庭穴能夠有效減輕腦缺血再灌注損傷減輕氧化損傷等作用。分子水平結(jié)果顯示，電針預(yù)處理可以通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路從而抑制Caspase-3表達(dá)最終抑制細(xì)胞凋亡，并且升高SOD和GSH抗氧化活性以及降低MDA含量最終改善腦缺血再灌注損傷，對(duì)腦缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。