miR-409-3p通過(guò)調(diào)控SLBP影響肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

周 杰，李敬東，權(quán) 剛，孫 驥，岳 亮

1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽一科，四川 南充 637000；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院

肝癌是臨床常見(jiàn)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與死亡率較高，患者5年生存率較低[1-4]。miR-409-3p是一種在胃癌等幾種癌癥中表達(dá)下調(diào)的miRNA，并通過(guò)增殖、分化等生物學(xué)過(guò)程參與腫瘤進(jìn)展調(diào)控[5]。生物信息學(xué)分析顯示，莖環(huán)結(jié)合蛋白(stem-loop binding protein，SLBP)與miR-409-3p存在靶向結(jié)合序列，資料顯示SLBP表達(dá)在骨肉瘤[6]、乳腺癌[7]等腫瘤中被上調(diào)，并可參與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移過(guò)程。本研究主要探討miR-409-3p、SLBP在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)，分析miR-409-3p在肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲中的作用，并結(jié)合其對(duì)SLBP的調(diào)控旨在揭示肝癌中miR-409-3p的機(jī)制，為闡明肝癌病理進(jìn)展的分子機(jī)理提供新的啟示。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑肝癌組織及癌旁組織來(lái)源：選取2017年5月至2018年6月我院收治的30例肝癌患者為研究對(duì)象，所有患者均經(jīng)病理證實(shí)為肝癌，男20例，女10例，年齡(56.35±12.36)歲(40～70歲)，所有患者均于術(shù)中切除肝癌組織及癌旁組織，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

人肝上皮細(xì)胞(THLE-3)、肝癌細(xì)胞系(MHCC97H、Hep3B、SK-HEP-1)購(gòu)自美國(guó)ATCC。Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；miR-409-3p寡核苷酸模擬物(miR-409-3p mimics)、miR-409-3p特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-409-3p)、SLBP小干擾RNA(si-SLBP)及陰性對(duì)照mimic NC序列(miR-NC)、抑制劑NC序列(anti-miR-NC)、亂序無(wú)意義小干擾RNA序列(si-NC)購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；MTT與DMSO購(gòu)自美國(guó)BD公司；凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗人SLBP抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；兔抗人細(xì)胞周期蛋白1(Cyclin D1)、兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinases2，MMP2)、兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases9，MMP9)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；山羊抗兔二抗購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組：在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中，用DMEM完全培養(yǎng)基(含有質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清)培養(yǎng)THLE-3、MHCC97H、Hep3B、SK-HEP-1細(xì)胞。取對(duì)數(shù)期Hep3B細(xì)胞1×104個(gè)/ml接種于6孔板(150 μl/孔)，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至70%時(shí)將培養(yǎng)基更換為不含胎牛血清的DMEM，參照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)分別按miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-409-3p組(轉(zhuǎn)染miR-409-3p mimics)、si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-SLBP組(轉(zhuǎn)染si-SLBP)、miR-409-3p+pcDNA-NC組(轉(zhuǎn)染miR-409-3p mimics和pcDNA-NC)、miR-409-3p+pcDNA-SLBP組(轉(zhuǎn)染miR-409-3p mimics和pcDNA-SLBP)進(jìn)行Hep3B細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)miR-409-3p、SLBP mRNA的表達(dá)水平：取出凍存肝癌組織及癌旁組織，采用Trizol法提取組織中的總RNA，同時(shí)提取THLE-3、MHCC97H、Hep3B、SK-HEP-1細(xì)胞和轉(zhuǎn)染后Hep3B細(xì)胞中的總RNA，在超微量分光光度計(jì)(Nanodrop 2000c)上進(jìn)行RNA濃度測(cè)量。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作指示將RNA反轉(zhuǎn)錄。以合成的cDNA為模板，與引物、SYBR Green試劑盒在95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40次循環(huán)(miR-409-3p)，或95 ℃ 60 s，95 ℃ 60 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40次循環(huán)(SLBP)的反應(yīng)條件下進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-409-3p(內(nèi)參為U6)、SLBP mRNA(內(nèi)參為β-actin)的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖：收集各組對(duì)數(shù)期Hep3B細(xì)胞(3×104個(gè)/ml)，接種于96孔板(100 μl/孔)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔加入MTT溶液20 μl，置于37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，1 300 r/min離心5 min，棄上清，每孔滴加DMSO 150 μl，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔避光充分反應(yīng)5 min后的吸光度值(OD490 nm)，計(jì)算細(xì)胞增殖率(%)=OD490 nm實(shí)驗(yàn)組/OD490 nm空白組×100%。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲：無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠，并鋪板Transwell上室(40 μl/孔)，以進(jìn)行侵襲檢測(cè)。收集各組對(duì)數(shù)期Hep3B細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整為3×104個(gè)/ml，按照200 μl/孔的密度將細(xì)胞懸液加入鋪Matrigel基質(zhì)膠(侵襲檢測(cè))或未鋪Matrigel基質(zhì)膠(遷移檢測(cè))的上室。另取600 μl含質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的培養(yǎng)液加入下室，37 ℃反應(yīng)24 h，多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，顯微鏡下觀察遷移細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-409-3p的靶基因：分別構(gòu)建野生型載體WT-SLBP與突變型載體MUT-SLBP，在Hep3B細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-SLBP、MUT-SLBP與miR-NC、miR-409-3p mimics，檢測(cè)轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性。分別將miR-NC、miR-409-3p、anti-miR-NC、anti-miR-409-3p轉(zhuǎn)染至Hep3B細(xì)胞，采用Western blotting進(jìn)行SLBP蛋白表達(dá)測(cè)定。

1.2.6 Western blotting檢測(cè)SLBP、Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)：收集THLE-3、MHCC97H、Hep3B、SK-HEP-1細(xì)胞與轉(zhuǎn)染后Hep3B細(xì)胞，在RIPA裂解液中進(jìn)行總蛋白的分離提取，進(jìn)行SDS-PAGE(50 μg)和轉(zhuǎn)PVDF膜，PVDF膜在質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂奶粉中封閉，2 h后于4 ℃與1∶1 000稀釋的一抗孵育12 h，室溫與1∶2 000稀釋的二抗孵育1 h，滴加ECL，各條帶顯影后的灰度值在軟件Image J中獲得。

2 結(jié)果

2.1 在肝癌組織與細(xì)胞系中miR-409-3p和SLBP表達(dá)情況肝癌組織中miR-409-3p的表達(dá)水平較癌旁組織降低(P<0.05)，SLBP mRNA及SLBP蛋白表達(dá)水平均較癌旁組織升高(P<0.05)；肝癌細(xì)胞系MHCC97H、Hep3B、SK-HEP-1中miR-409-3p的表達(dá)水平均較THLE-3細(xì)胞降低(P<0.05)，SLBP mRNA及SLBP蛋白表達(dá)水平均較THLE-3細(xì)胞升高(P<0.05)，其中對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3B中miR-409-3p的表達(dá)水平降低幅度明顯高于其他肝癌細(xì)胞系，因而選用肝癌細(xì)胞Hep3B進(jìn)行后續(xù)研究(見(jiàn)圖1～2、表1)。

表1 在肝癌細(xì)胞系中miR-409-3p和SLBP表達(dá)情況Tab 1 Expression of miR-409-3p and SLBP in liver

注：*P<0.05。圖1 肝癌組織中miR-409-3p和SLBP mRNA的表達(dá)情況 A：miR-409-3p在肝癌組織中的表達(dá)；B：SLBP mRNA在肝癌組織中的表達(dá)Fig 1 Expression of miR-409-3p and SLBP mRNA in liver cancer tissues A:expression of miR-409-3p in liver cancer tissues;B:expression of SLBP mRNA in liver cancer tissues

圖2 Western blotting檢測(cè)SLBP蛋白表達(dá) Fig 2 The expression of SLBP protein detected by Western blotting

2.2 高表達(dá)miR-409-3p對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3B增殖、遷移和侵襲的影響miR-409-3p組細(xì)胞增殖率較miR-NC組降低(P<0.05)，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)較miR-NC組減少(P<0.05)，Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白相對(duì)表達(dá)量也較miR-NC組降低(P<0.05)(見(jiàn)圖3、表2)。

注：*P<0.05。圖3 高表達(dá)miR-409-3p對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3B增殖、遷移和侵襲的影響 A：MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖率；B：Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲；C：Western blotting檢測(cè)Cyclin D1、MMP2和MMP9蛋白的表達(dá)Fig 3 Effects of highly expressed miR-409-3p on the proliferation,migration and invasion of liver cancer cell Hep3B A:cell proliferation rate detected by MTT;B:cell numbers of migration and invasion detected by Transwell;C:Cyclin D1,MMP2 and MMP9 protein expressions detected by Western blotting

表2 高表達(dá)miR-409-3p對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3B增殖、遷移和侵襲的影響Tab 2 Effects of highly expressed miR-409-3p on the proliferation,migration and invasion of liver cancer cells Hep3B

2.3 低表達(dá)SLBP對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3B增殖、遷移和侵襲的影響si-SLBP組肝癌細(xì)胞增殖率低于si-NC組(P<0.05)，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)少于si-NC組(P<0.05)，Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白相對(duì)表達(dá)量也低于si-NC組(P<0.05)(見(jiàn)圖4、表3)。

注：*P<0.05。圖4 低表達(dá)SLBP對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3B增殖、遷移和侵襲的影響 A：MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖率；B：Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲；C：Western blotting檢測(cè)SLBP、Cyclin D1、MMP2和MMP9的蛋白表達(dá)Fig 4 Effects of low expressed SLBP on the proliferation,migration and invasion of liver cancer cell Hep3B A:cell proliferation rate detect by MTT;B:cell numbers of migration and invasion detected by Transwell;C:protein expressions of SLBP,Cyclin D1,MMP2 and MMP9 detected by Western blotting

表3 低表達(dá)SLBP對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3B增殖、遷移和侵襲的影響Tab 3 Effects of low expressed SLBP on the proliferation,migration and invasion of liver cancer cell Hep3B

2.4 miR-409-3p靶向SLBPmiR-409-3p與SLBP的結(jié)合位點(diǎn)在Starbase中預(yù)測(cè)(見(jiàn)圖5A)。轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-SLBP細(xì)胞熒光素酶活性在miR-409-3p組中顯著低于miR-NC組(P<0.05)(見(jiàn)表4)。miR-409-3p可負(fù)向調(diào)控SLBP的表達(dá)(見(jiàn)圖5B、表5)。

表5 Western blotting檢測(cè)miR-409-3p對(duì)SLBP表達(dá)的影響Tab 5 Western blotting was used to detect the expression of SLBP regulared by miR-409-3p

圖5 miR-409-3p靶向調(diào)控SLBP表達(dá) A：Starbase預(yù)測(cè)示意圖；B：Western blotting檢測(cè)miR-409-3p對(duì)SLBP表達(dá)的影響Fig 5 miR-409-3p targeted the expression of SLBP A:Starbase predicted the combination of miR-409-3p and SLBP;B:Western blotting was used to detect the expression of SLBP regulared by miR-409-3p

表4 SLBP報(bào)告質(zhì)粒與miR-409-3p共轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞的熒光素酶活性Tab 4 Luciferase activity of Hep3B cells co-transfected with SLBP reporter plasmid and miR-409-3p

2.5 miR-409-3p通過(guò)調(diào)控SLBP影響Hep3B的增殖、遷移和侵襲miR-409-3p+pcDNA-SLBP組Hep3B細(xì)胞增殖率比miR-409-3p+pcDNA-NC組升高(P<0.05)，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)較miR-409-3p+pcDNA-NC組增多(P<0.05)，Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白相對(duì)表達(dá)量較miR-409-3p+pcDNA-NC組升高(P<0.05)(見(jiàn)圖6、表6)。

注：*P<0.05。圖6 高表達(dá)SLBP可以部分逆轉(zhuǎn)miR-409-3p對(duì)Hep3B增殖、遷移和侵襲的影響 A：MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖率；B：Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲；C：Western blotting檢測(cè)SLBP、Cyclin D1、MMP2和MMP9的蛋白表達(dá)Fig 6 Highly expressed SLBP could partially reverse the effects of miR-409-3p on Hep3B proliferation,migration and invasion A:cell proliferation rate detected by MTT;B:cell numbers of migration and invasion detected by Transwell;C:expressions of SLBP,Cyclin D1,MMP2 and MMP9 proteins detected by Western blotting

表6 miR-409-3p通過(guò)調(diào)控SLBP影響Hep3B增殖、遷移和侵襲Tab 6 miR-409-3p influenced the proliferation,migration and invasion of Hep3B by regulating SLBP

3 討論

miRNA在多種腫瘤中發(fā)揮致癌或抑癌作用，研究表明miRNA在肝癌組織或細(xì)胞系中異常表達(dá)并可促進(jìn)或抑制肝癌發(fā)生及發(fā)展，其作用機(jī)制可能是通過(guò)靶向調(diào)控下游靶基因而發(fā)揮作用[8-10]。

miR-409-3p在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-409-3p表達(dá)可通過(guò)靶向Akt1從而抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)及侵襲[11]。研究表明，miR-409-3p可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖及侵襲[12]。相關(guān)報(bào)道指出，miR-409-3p過(guò)表達(dá)可抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及侵襲[13]。與上述研究結(jié)果相似，本研究結(jié)果顯示，miR-409-3p在肝癌細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，miR-409-3p過(guò)表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。Cyclin D1可正向調(diào)控細(xì)胞周期而促進(jìn)細(xì)胞增殖[14]。MMP2、MMP9是細(xì)胞遷移和侵襲的重要誘導(dǎo)因子[15]。本研究結(jié)果表明，miR-409-3p過(guò)表達(dá)可抑制Cyclin D1、MMP2、MMP9表達(dá)，提示miR-409-3p過(guò)表達(dá)可減弱肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。

SLBP可調(diào)控細(xì)胞周期，并可能參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過(guò)程[16-17]。本研究結(jié)果顯示，SLBP在肝癌中顯著上調(diào)，抑制SLBP表達(dá)后，肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力被減弱。本研究證實(shí)SLBP是miR-409-3p的靶標(biāo)，miR-409-3p對(duì)肝癌細(xì)胞中SLBP的表達(dá)具有負(fù)向調(diào)控作用。同時(shí)，miR-409-3p可能通過(guò)靶向下調(diào)SLBP表達(dá)，從而在肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮抑制功能。

綜上所述，miR-409-3p可靶向調(diào)控SLBP表達(dá)從而影響肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，miR-409-3p在肝癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，miR-409-3p可能作為肝癌的分子治療靶點(diǎn)，但仍需通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-409-3p在體內(nèi)對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。