青海省櫻桃葉斑病菌生物學特性及室內(nèi)藥劑毒力測定

劉俏 寧楠楠 馬永強 郭青云

摘要 ：為明確青海省櫻桃葉斑病菌鏈格孢Alternaria alternata的生物學特性及篩選出對其防效最佳的藥劑，本研究采用菌絲生長速率法和孢子計數(shù)法研究了不同培養(yǎng)條件對該病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響，并用菌絲生長抑制率法對9種殺菌劑進行室內(nèi)毒力測定。結(jié)果表明，菌絲生長和產(chǎn)孢的最適培養(yǎng)基分別為馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA）培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基，最適溫度為25℃，最適氮源為蛋白胨，最適碳源分別為肌醇和乳糖，最適pH分別為6～8和6～7，24 h持續(xù)黑暗處理更有利于菌絲生長和產(chǎn)孢。9種化學藥劑對病原菌均有不同程度的抑制作用，其中250 g/L嘧菌酯懸浮劑抑菌效果最好，EC50為1.258 mg/L。該研究結(jié)果可為青海省櫻桃葉斑病的防治提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 ：櫻桃; 葉斑病; 鏈格孢; 生物學特性; 毒力測定

中圖分類號：

S 436.629

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020107

Biological characteristics of pathogen causing leaf spot disease of cherry in Qinghai

province and toxicity test of different fungicides in laboratory

LIU Qiao#， NING Nannan#， MA Yongqiang*， GUO Qingyun*

（Academy of Agricultural and Forestry Sciences， Qinghai University， Key Laboratory of Agricultural Integrated Pest Management， of Qinghai， Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pests in Xining， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Biotechnology， Ministry of Education， Xining 810016， China）

Abstract

The aim of this study is to confirm the biological characteristics of Alternaria alternata causing leaf spot disease of cherry in Qinghai province and to screen out the best fungicides. Influence of different culture conditions on mycelium growth and sporulation of pathogen was investigated using the mycelial growth rate method and spore counting method. The toxicity of nine fungicides to the pathogen was determined by mycelial growth inhibition method in laboratory. The results showed that the optimal medium for mycelium growth and sporulation was PSA medium and PDA medium， respectively. The optimal temperature was 25℃， the optimal nitrogen source was peptone， the optimal carbon source was inositol and lactose， and the optimal pH value was 6-8 and 6-7， respectively. 24 h dark treatment was more favorable for mycelium growth and sporulation. Nine kinds of fungicides had different inhibition activity on the pathogen. Among them， azoxystrobin 250 g/L SC has the best antibacterial effect， with the EC50 value of 1.258 mg/L. The results provide a theoretical basis for the control of cherry leaf spot in Qinghai province.

Key words

cherry; leaf spot; Alternaria alternata; biological characteristics; toxicity test

甜櫻桃原產(chǎn)于西亞、非洲西北部和黑海沿岸，早在16世紀就作為果樹栽培，現(xiàn)已在世界范圍內(nèi)種植，目前主要有土耳其、美國、伊朗、烏克蘭、德國、西班牙和意大利等60多個國家進行商業(yè)化栽培[12]。在我國作為果樹栽培最早始于19世紀70年代，目前，國內(nèi)作為經(jīng)濟栽培的櫻桃除了甜櫻桃外，還有中國櫻桃、酸櫻桃和毛櫻桃，但以歐美甜櫻桃為主，主要分布在山東、遼寧、陜西、四川、河南、貴州等地[3]。櫻桃果實中含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、以及鐵、鉀、鈣、磷等多種礦物質(zhì)，能夠促進能量代謝、增加人體免疫力、延緩機體衰老，醫(yī)療保健價值頗高，被譽為“水果中的鉆石”[4]。此外，櫻桃還具有較高的藥用價值，其根、枝、葉、核、鮮果皆可入藥，能治療多種疾病[5]。櫻桃經(jīng)濟效益高，生產(chǎn)前景廣，因此在我國各省市有大面積的推廣栽培。

青海省于1994年首次試點栽培甜櫻桃，目前全省的櫻桃栽培面積已發(fā)展到800 hm2，主要集中在海拔2 200 m以下的湟水河流域及黃河河谷地帶的平原川水地區(qū)和黃土丘陵淺山地帶[6]。青海省地處青藏高原東北部，是長江、黃河和瀾滄江的發(fā)源地，其地形地貌復雜多樣，屬高原大陸性氣候，光照時數(shù)長，太陽輻射強，晝夜溫差大，降雨量少，溫度相對較低，年平均氣溫在-5～8℃之間[7]。由于特殊的地理位置和氣候條件，病蟲害極輕，產(chǎn)出的櫻桃果實品質(zhì)極佳。再加上栽培方式多為露地栽培，成熟期較其他各省晚，大大延長了國內(nèi)櫻桃產(chǎn)品的供應時間，發(fā)展前景廣闊。

近年來，由于青海省氣溫升高，雨量增加，導致發(fā)生在櫻桃上的病害種類和危害程度明顯上升。其中，葉斑病發(fā)生最為嚴重，在7、8月份病株率高達100%。病菌在葉片上引起圓形或近圓形的褐色或紫紅色病斑，嚴重時，病斑相互連接成不規(guī)則狀，使葉片失綠黃化，導致樹體衰弱，果實大量減產(chǎn)。本研究組通過形態(tài)學和分子生物學手段，將病原菌鑒定為鏈格孢Alternaria alternata、細極鏈格孢A.tenuissima和刺盤孢屬Colletotrichum spp.，分離頻率分別為84.95%、5.02%和10.03%[8]。本文在青海省櫻桃葉斑病病原鑒定的基礎上對主要病原菌A.alternata的生物學特性進行研究，并用9種化學試劑對其防效進行評價，旨在為青海省櫻桃葉斑病的科學防控提供理論支撐和技術(shù)指導。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

櫻桃葉斑病菌HS002（鏈格孢A.alternata），分離自海東市樂都區(qū)櫻桃病葉，保存在青海省農(nóng)林科學院植物保護研究所青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室。

1.2 供試培養(yǎng)基

參照張秀偉等[9]、安穎等[10]、孫宇等[11]和馬雪兒等[12]對病原菌生物學特性的研究方法，本研究選擇了馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、燕麥片瓊脂培養(yǎng)基（OA）、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）、淀粉瓊脂培養(yǎng)基（SA）、葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（GPA）、麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基（MA）、酵母膏瓊脂培養(yǎng)基（YEA）、査氏培養(yǎng)基（Czapek）、馬鈴薯胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基（PCA）、水瓊脂培養(yǎng)基（WA）、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（CMA）和V8培養(yǎng)基等12種培養(yǎng)基對櫻桃葉斑病菌A.alternata進行培養(yǎng)，篩選該病原菌生長和產(chǎn)孢的最適培養(yǎng)基。

1.3 供試藥劑

本試驗所用的殺菌劑種類、廠家及稀釋倍數(shù)見表1。

1.4 櫻桃葉斑病病原菌生物學特性研究

1.4.1 不同培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

將病原菌接種在PDA平板上，25℃黑暗培養(yǎng)6 d，使其形成供試菌落。配制12種供試培養(yǎng)基，于121℃下濕熱滅菌30 min，待溫度下降至60℃左右時，在無菌條件下分別倒入直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中制成平板[1214]。用滅菌打孔器沿供試菌株菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅接種在平板中央，重復3次，置于25℃下黑暗培養(yǎng)6 d后，用十字交叉法測量菌落直徑取平均值。培養(yǎng)12 d后，采用十字交叉法，用直徑為5 mm的打孔器從平板中央向邊緣依次打取不同部位的菌絲塊，每皿20塊，放入20 mL無菌水中，壓碎菌餅并不斷攪拌，使分生孢子充分混勻于無菌水中，于顯微鏡下用血球計數(shù)板測定孢子數(shù)量[14]。

1.4.2 溫度對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

在培養(yǎng)好的供試病原菌菌落邊緣打取5 mm的

菌餅接種在PDA平板中央，分別置于5、10、15、20、25、30、35℃和40℃下進行黑暗培養(yǎng)[15]，重復次數(shù)、菌落直徑和產(chǎn)孢量的測量方法同1.4.1。

1.4.3 碳源對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

以PDA培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，以不加糖的PDA培養(yǎng)基為對照，以淀粉、蔗糖、麥芽糖、果糖、肌醇、乳糖、山梨醇、木糖為碳源等質(zhì)量替換PDA培養(yǎng)基中的葡萄糖配制成不同含碳培養(yǎng)基[12]，處理方法同1.4.1。

1.4.4 氮源對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

以 PDA 培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基和對照，分別加入3 g NaNO3、KNO3、（NH4）2SO4、NH4NO3、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏配制成不同含氮培養(yǎng)基[16]，處理方法同1.4.1。

1.4.5 pH對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

用1 mol/L HCl和NaOH將無菌PDA培養(yǎng)基的pH調(diào)至4～12后，制成平板[15]。處理方法同14.1。

1.4.6 光照周期對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

將病原菌菌餅接在PDA平板中央，分別置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中進行24 h持續(xù)光照、24 h持續(xù)黑暗、L∥D=12 h∥12 h光暗交替培養(yǎng)[17]。重復次數(shù)、菌落直徑和產(chǎn)孢量的測量方法同1.4.1。

1.4.7 菌絲致死溫度測定

在無菌條件下，打取供試病原菌菌餅置于試管中，分別放入35、40、45、50、55℃和60℃恒溫水浴鍋中水浴10 min（到達設定溫度時開始計時）。以室溫下放置的試管作為對照，重復3次[18]。將菌餅接種在PDA平板上，25℃黑暗培養(yǎng)3 d后觀察病原菌的生長狀況。

1.5 室內(nèi)毒力測定

1.5.1 含藥培養(yǎng)基的制備

將所有供試藥劑按照推薦濃度分別稀釋相應的倍數(shù)備用。將配制好的PDA培養(yǎng)基分裝在容量為250 mL的三角瓶中，每瓶99 mL，封口后進行滅菌。待溫度冷卻至60℃左右時，在無菌條件下，將配制好的藥劑分別加入到PDA培養(yǎng)基中，最終稀釋倍數(shù)如表1所示，以不加藥劑的PDA平板作為對照，再加入少量的鏈霉素，防止細菌污染。振蕩搖勻后倒入直徑為9 cm的一次性培養(yǎng)皿中，制成不同的含藥平板[19]。

1.5.2 不同藥劑對病原菌菌絲生長的毒力測定

采用菌絲生長抑制率法[20]，將供試病原菌菌餅接種在不同含藥培養(yǎng)基中央，重復5次。25℃黑暗培養(yǎng)6 d后測量菌落直徑，計算出菌絲生長抑制率。以菌絲生長抑制率幾率值作為因變量（y），藥劑濃度的自然對數(shù)值作為自變量（x），利用最小二乘法建立“濃度對數(shù)-幾率值”直線方程（y=ax +b）[21]。采用Excel 2010、SPSS 19.0等軟件，求出各藥劑對櫻桃葉斑病菌的抑制中濃度（EC50），以衡量不同殺菌劑對病原菌的毒力效果。

抑菌率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的生物學特性

2.1.1 不同培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

病原菌在12種供試培養(yǎng)基上均能生長但差異顯著（P<0.05），在GPA、PSA和MA培養(yǎng)基上菌絲生長較快，但在GPA和MA培養(yǎng)基上菌絲較稀疏;其次是PDA、OA、CMA和V8培養(yǎng)基，但在OA和CMA培養(yǎng)基上菌絲生長不緊密且在OA上顏色較淺;在PCA、WA、Czapek和YEA培養(yǎng)基上菌絲生長較慢。SA培養(yǎng)基則不利于菌絲生長，其菌落直徑顯著小于其他培養(yǎng)基上的菌落直徑。不同培養(yǎng)基對病原菌產(chǎn)孢量的影響也顯著不同，在PDA和PSA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量顯著多于其他培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量，且在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最多;其次是GPA培養(yǎng)基，在SA、YEA、OA、PCA和CMA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢較少，而在MA、Czapek、WA和V8培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢（圖1）。

2.1.2 溫度對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

病原菌在5～35℃下均能生長，但差異顯著。在25℃時，菌落直徑最大，顯著大于其他溫度條件下的菌落直徑;在15～35℃時菌落生長良好，其中在30～35℃時菌落生長較快;5℃和10℃時菌落生長較慢，而40℃時菌落不生長。病原菌產(chǎn)孢的最適溫度為25℃，顯著多于其他溫度條件下的產(chǎn)孢量，在20℃、30℃和35℃下產(chǎn)孢較多;在5℃和10℃下產(chǎn)孢量較少，其中5℃下產(chǎn)孢最少（40℃除外）;而在40℃下菌落不生長也不產(chǎn)孢（圖2）。

2.1.3 碳源對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

菌絲在以肌醇為碳源的培養(yǎng)基上生長最快，菌落直徑最大;以蔗糖、果糖、乳糖和山梨醇為碳源的培養(yǎng)基上，菌落生長較好，菌落直徑顯著大于對照;以葡萄糖、麥芽糖和淀粉為碳源的培養(yǎng)基上菌落大小與對照差異不顯著;而以木糖為碳源的培養(yǎng)基上菌落直徑最小，顯著小于對照。病原菌在以乳糖為碳源的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢最多;在以肌醇、果糖、木糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇為碳源的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢次之，其產(chǎn)孢量均顯著多于對照;而在以麥芽糖和淀粉為碳源的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量與空白碳源培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量無顯著差異（圖3）。

2.1.4 氮源對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

菌絲生長的最適氮源是蛋白胨，在以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上菌落直徑顯著大于其他氮源培養(yǎng)基上的菌落直徑，但與對照無顯著差異。在以KNO3為氮源的培養(yǎng)基上菌絲生長相對較快，而以牛肉膏、酵母膏、NaNO3、（NH4）2SO4和NH4NO3為氮源能夠顯著抑制菌絲生長。病原菌在以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢最多，其次是KNO3，兩者的產(chǎn)孢量均顯著多于其他氮源培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量，但與對照差異不顯著;而在以牛肉膏、NaNO3、（NH4）2SO4和NH4NO3為氮源的培養(yǎng)基上，病原菌的產(chǎn)孢量嚴重受到抑制，顯著低于對照;而在以酵母膏為氮源的培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢（圖4）。

2.1.5 pH對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

病原菌在pH為4～12范圍內(nèi)均能生長和產(chǎn)孢，但差異顯著。菌絲生長的最適pH為6～8，產(chǎn)孢的最適pH為6～7，過酸過堿均不利于菌絲生長和產(chǎn)孢（圖5）。

2.1.6 光照周期對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

在24 h持續(xù)黑暗處理條件下，菌絲生長速率最快，菌落直徑顯著大于其他2種光照周期下的菌落直徑;其次是24 h光照處理，而12 h∥12 h光照黑暗交替條件不利于菌絲生長。24 h持續(xù)黑暗處理有利于產(chǎn)孢，其產(chǎn)孢量顯著多于其他2種光照周期下的產(chǎn)孢量;24 h持續(xù)光照處理和12 h∥12 h光照黑暗交替條件下產(chǎn)孢量較少且無顯著差異（圖6）。

2.1.7 菌絲致死溫度

將分別在35～60℃的恒溫水浴鍋內(nèi)處理10 min的菌餅接種在PDA平板上，置于25℃下黑暗培養(yǎng)3 d后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在35～50℃條件下處理10 min后，菌絲能夠生長且產(chǎn)生新的菌落，而在50℃及以上條件下菌絲不生長，說明病原菌菌絲的致死條件為50℃處理10 min。

2.2 室內(nèi)毒力測定結(jié)果

9種化學藥劑對病原菌菌絲生長均有不同程度的抑制作用，且隨藥劑濃度的升高抑制作用逐漸增強（圖7）。表2結(jié)果顯示，在不同防治藥劑中250 g/L嘧菌酯SC抑制效果最好，EC50為1.258 mg/L;10%苯醚甲環(huán)唑WG和250 g/L吡唑嘧菌酯EC抑制效果次之，EC50分別為1.555 mg/L和1.727 mg/L;再者是50%啶酰菌胺WG，EC50為11.348 mg/L;抑菌效果最差的為75%百菌清WP，其EC50高達10 894.317 mg/L。

3 結(jié)論與討論

櫻桃葉斑病是由多種不同病原菌引起的一種世界性真菌病害，常造成櫻桃果實大量減產(chǎn)，是遏制櫻桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要病害之一[2228]。青海省櫻桃病害以葉斑病發(fā)生最為普遍，主要危害櫻桃葉片，尤其是下部老葉更容易發(fā)病。本研究組前期將其病原菌鑒定為鏈格孢、細極鏈格孢和刺盤孢屬，其中以鏈格孢病原菌為主。研究發(fā)現(xiàn)，鏈格孢作為鏈格孢屬的模式種，具有侵染能力強、寄主范圍廣和危害程度重等特點，可引起觀賞鳳梨葉斑病[29]、枸杞葉枯病[30]、草莓葉斑病[31]、番茄黑斑病[32]、香榧果實褐斑病[33]和紫花苜蓿葉斑病和枯萎病[34]等多種植物病害。此外，該病原菌還可以侵染駿棗、藍莓、向日葵、菊花和鷹嘴豆等多種植物，使其發(fā)病，表現(xiàn)出明顯的癥狀[3539]。

國內(nèi)外對于鏈格孢引起的病害防控主要依賴于化學藥劑。然而，化學藥劑的種類和劑量的選擇成為病害防控過程中的一個突出問題。為此，很多學者對鏈格孢進行防治藥劑的室內(nèi)毒力測定。孫潔等[40]通過菌絲生長速率法測定了8種殺菌劑對新疆紅棗縮果病菌A.alternata菌絲的毒力，結(jié)果表明，70%代森錳鋅WP和50%福美雙WP對病原菌菌絲生長的抑制效果較好;其次為70%丙森鋅WP和75%百菌清WP;抑制作用最差的為25%阿米西達SC和70%甲基硫菌靈WP。王志霞等[41]通過菌絲生長抑制率法和孢子萌發(fā)抑制率法測定了5種殺菌劑對新疆紅棗葉斑病菌A.tenuissima和A.alternata的毒力，結(jié)果表明，70%代森錳鋅對病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制效果最好。王芳等[42]選擇了7種殺菌劑對玉米大斑病病原菌A.alternata進行毒力測定，結(jié)果表明，50%異菌脲WP抑制效果最好，當試驗濃度為50 mg/L時，抑制率可達95%。此外，張丹華等[43]對重慶地區(qū)枇杷葉斑病菌A.alternata進行防治藥劑室內(nèi)篩選，認為5種殺菌劑中10%苯醚甲環(huán)唑WG的抑制效果最好，EC50為3.84 mg/L。

本研究對青海省櫻桃葉斑病主要病原菌A.alternata進行了生物學特性研究及室內(nèi)防治藥劑的篩選，結(jié)果表明，不同培養(yǎng)條件對菌絲生長和產(chǎn)孢量均有顯著影響，且菌落顏色、厚度以及菌絲的生長狀況顯著不同。病原菌在12種供試培養(yǎng)基上均能生長，但在PSA培養(yǎng)基上生長最佳。病原菌生長的溫度范圍比較廣，在5～35℃條件下均能生長，適宜溫度是25～30℃，最適溫度為25℃，而溫度高于40℃時，菌落不生長，這與孫潔等[40]、王志霞等[41]和詹文平等[44]的研究結(jié)果相似。病原菌在不同碳氮源培養(yǎng)基上均能生長，但對碳氮源具有一定的選擇性，其中以肌醇為碳源，蛋白胨為氮源最有利于菌絲生長，而以乳糖為碳源，蛋白胨為氮源最有利于產(chǎn)孢。病原菌在不加碳氮源培養(yǎng)基上雖能快速生長，但菌絲稀疏、菌落稀薄且顏色較淺，由此可知碳氮源對病原菌的生長具有重要作用。病原菌在pH為4～12條件下均能生長，且菌絲生長的最適pH為6～8，產(chǎn)孢的最適pH為6～7，過酸過堿均不利于菌絲生長和產(chǎn)孢，這與孫潔等[40]的研究結(jié)果相同。病原菌在3種光照周期下均可生長和產(chǎn)孢，持續(xù)黑暗條件下菌絲生長最快，產(chǎn)孢量最多，這與喬鏡澄等[32]的研究結(jié)果相同，與沈會芳等[14]和劉曉琳等[45]的研究結(jié)果相反，他們認為光照能夠促進鏈格孢菌絲生長和產(chǎn)孢。病原菌的致死溫度為50℃水浴處理10 min。

防治藥劑室內(nèi)毒力測定結(jié)果表明，9種殺菌劑對病原菌均有不同程度的抑制作用且抑制效果差異顯著，其中250 g/L嘧菌酯懸浮劑抑制效果最好，EC50為1.258 mg/L;10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑和250 g/L吡唑嘧菌酯乳油抑制效果次之，EC50分別為1.555 mg/L和1.727 mg/L，這與王芳等[42]和張丹華等[43]對A.alternata的毒力測定試驗結(jié)果相似。再者是50%啶酰菌胺水分散粒劑，抑菌效果最差的為75%百菌清可濕性粉劑，其EC50高達10 894.317 mg/L。周英等[46]在對獼猴桃黑斑病菌進行室內(nèi)藥劑篩選時也得到相同的結(jié)果，認為75%百菌清可濕性粉劑對病原菌A.alternata的抑制效果較弱或不明顯。

本研究對青海省櫻桃葉斑病菌A.alternata的生物學特性進行分析，并用9種殺菌劑對其進行室內(nèi)毒力測定，該試驗結(jié)果可為青海省櫻桃葉斑病的防治提供技術(shù)參考。由于藥劑試驗是在室內(nèi)進行，田間防治效果還需進一步驗證。

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（責任編輯：楊明麗）