甜蕎FeFUL2基因的克隆與表達(dá)分析

張良波 王旋 錢成旭 劉志雄

摘?要：?為了探索甜蕎FUL同源基因參與花與籽粒發(fā)育調(diào)控的分子機(jī)制，該文采用同源克隆的方法從甜蕎（Fagopyrum esculentum）長(zhǎng)花柱和長(zhǎng)雄蕊突變體（lpls）中克隆到1個(gè)長(zhǎng)837 bp 的FeFUL2基因（GenBank登錄號(hào)為MG779493.1），其包含長(zhǎng)690 bp的完整開放閱讀框，編碼1個(gè)由229個(gè)氨基酸殘基組成的MADS-box轉(zhuǎn)錄因子。通過(guò)對(duì)FeFUL2進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)生、同源蛋白比對(duì)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示FeFUL2與核心真雙子葉植物AP1/FUL亞家族轉(zhuǎn)錄因子中的euFUL進(jìn)化系聚于1個(gè)進(jìn)化分支，屬甜蕎euFUL型MADS-box轉(zhuǎn)錄因子，且包含1個(gè)57個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)的高度保守的MADS結(jié)構(gòu)域、1個(gè)69個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)的次級(jí)保守的K結(jié)構(gòu)域，其C末端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)在序列長(zhǎng)度和氨基酸殘基組成上與其他euFUL型轉(zhuǎn)錄因子差異較大，但仍含有2個(gè)euFUL型轉(zhuǎn)錄因子特有的保守基元：FUL motif和paleo AP1 motif。用qPCR檢測(cè)基因表達(dá)的組織特異性顯示：FeFUL2基因在甜蕎lpls突變體的根、莖、葉、花被片、雄蕊、雌蕊和發(fā)育4 d的幼果中均有表達(dá)，但其在花被片中表達(dá)量極顯著高于該基因在其他器官中的表達(dá)量（LSD， P<0.01）。綜合轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)與基因的表達(dá)模式推測(cè)，F(xiàn)eFUL2基因與其他euFUL型基因的功能可能存在一定差異，其在花發(fā)育過(guò)程中可能主要參與甜蕎花被片的發(fā)育調(diào)控。

關(guān)鍵詞： 蕎麥， 花發(fā)育， FRUITFULL， MADS-box， 基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：?Q943.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A

文章編號(hào)：?1000-3142（2021）04-0591-07

Abstract：?In order to uncover the molecular mechanisms of FRUITFULL （FUL） homologous genes involving in regulating flower and fruit development in buckwheat， an 837 bp of FeFUL2 cDNA containing a 690 bp full ORF （Open Reading Frame） encoding 229 amino acids （GenBank Accession Number MG779493.1） was isolated from a Fagopyrum esculentum mutant line with long pistil and long stamen （lpls） through homologous cloning. Moreover， the FeFUL2 cDNA contains a 30 bp 5′UTR （untranslated region， UTR） and a 117 bp 3′UTR including poly-A. The results showed that the buckwheat FeFUL2 was classified into the core eudicot euFUL lineages of AP1/FUL subfamily MADS-box transcription factors through phylogenetic， protein alignment and sequence analyses. In addition， FeFUL2 was classified transcription contained a highly conservation MADS-box domain （1-57） with 57 amino acids （aa）， a secondary conserved K domain （91-159） with 69 aa， as well as two conserved motifs： FUL motif and paleo AP1 motif lying variable C terminal region. The highly conserved MADS domain was responsible for DNA binding， dimerization and nuclear localization of MADS-domain transcription factors. The secondary conserved K domain was involved in the formation of amphipathic helices and responsible for protein dimerization and multimeric complex formation protein-protein interactions. Finally， the C domain was important for transcriptional activation and multimeric complex formation. Moreover， the C terminal region of FeFUL2 was variable in sequence and length comparing with other euFUL-like transcriptors， which suggested that FeFUL2 may play different roles regulating flower and fruit development with FUL-like homologs from other species. qPCR revealed that FeFUL2 expression was detectable in all tissues including root， stem， leaf， tepal， stamen， gynoecium and 4-day-old juvenile fruit. However， FeFUL2 expression level in tepal was significantly higher than those in?other organs （LSD， P<0.01）. In addition， FeFUL2 expression level in stamen， gynoecium and 4-day-old juvenile fruit displayed no significant differences（LSD，P>0.05）， but FeFUL2 expression level in stem and leaf was significantly higher than root （LSD，P<0.05）. However， FeFUL2 expression level in stem and leaf showed no significant differences（LSD，P>0.05）. Above all， our data suggest that the function of FeFUL2 may show a difference with other euFUL-like gene， and FeFUL2 play a major role involving in perianth development.

Key words： buckwheat， flower development， FRUITFULL， MADS-box， gene expression

甜蕎（Fagopyrum esculentum）是蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬食用和保健兼用的糧食作物，其籽粒含有豐富的賴氨酸、膳食纖維、蘆丁和抗氧化活性物等，具有很高的營(yíng)養(yǎng)和保健功效（Quinet et al.， 2004; Li et al.， 2017）;作為典型的二型花柱作物，甜蕎自然群體中thrum型（短花柱長(zhǎng)雄蕊）和pin型（長(zhǎng)花柱短雄蕊）花植株按1∶1分離，自花或相同花型植株間授粉不親和，僅異型花植株間相互授粉才能正常結(jié)實(shí)，產(chǎn)量低，不利于開展雜交育種工作，成為制約這一重要經(jīng)濟(jì)作物推廣應(yīng)用的瓶頸（Li et al.， 2017）。尋找和選育親和性好的甜蕎新品系（種），對(duì)增加甜蕎種質(zhì)資源多樣性，開展雜交育種均具有重要的意義。甜蕎長(zhǎng)花柱和長(zhǎng)雄蕊突變體（long pistil and long stamen， lpls）是課題組從甜蕎品種‘北早生群體中篩選獲得的自然變異的株系，其具有雌雄蕊等長(zhǎng)、同型花間授粉能結(jié)實(shí)，且與pin型和thrum型植株雜交也顯示出良好的親和性，是開展甜蕎雜交育種的理想材料（圖版 I）。弄清甜蕎lpls突變株系花序發(fā)育、開花以及籽粒發(fā)育過(guò)程與調(diào)控機(jī)制，是合理利用該材料開展雜交工作的前提和基礎(chǔ)。

前人在研究模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）花和角果的發(fā)育規(guī)律與調(diào)控機(jī)制發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)RUITFULL（FUL）基因編碼MADS-box基因家族中APETALA1 （AP1）/FUL進(jìn)化系轉(zhuǎn)錄因子， 其在擬南芥總狀花序分生組織、花芽原基、雌蕊、莖和莖生葉中都有表達(dá)，參與促進(jìn)開花、花序、花芽的發(fā)育與分化，莖生葉和長(zhǎng)角果的發(fā)育（McCarthy et al.， 2015）。為弄清甜蕎FUL同源基因的結(jié)構(gòu)以及在花和果實(shí)發(fā)育調(diào)控中功能是否保守，本研究通過(guò)同源克隆分離甜蕎FUL同源基因FeFUL2，在分析其編碼轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，結(jié)合qPCR檢測(cè)該基因在甜蕎lpls突變體植株中表達(dá)的組織特異性，從而預(yù)測(cè)該基因在參與調(diào)控lpls突變體植株花和瘦果發(fā)育過(guò)程中的作用與功能， 在豐富甜蕎lpls突變體花和瘦果發(fā)育調(diào)控資料的同時(shí)，能為開展甜蕎雜交育種工作和基因工程育種積累資料。

1?材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2018年8月底，將甜蕎lpls突變體株系的種子播種于長(zhǎng)江大學(xué)作物遺傳育種研究所實(shí)驗(yàn)基地的塑膠花盆（21 cm × 14 cm × 20 cm），常規(guī)水肥管理，待9—10月開花、坐果后分別將花盆搬回實(shí)驗(yàn)室，在超凈臺(tái)上用RNAase-free的尖嘴鑷子剝?nèi)√鹗wlpls突變體的花序、花被片、雄蕊、雌蕊和發(fā)育4 d的幼果，置于2 mL RNAase-free的EP管中，經(jīng)液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｏ扔盟疀_出甜蕎lpls突變體植株的根系，快速用吸水紙吸取根上水分，然后用RNA free的小剪刀剪取甜蕎根尖、幼葉和幼莖，最后用錫箔紙包好，經(jīng)液氮速凍于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 甜蕎FeFUL2基因克隆?稱取上述8種組織各100 mg，用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（艾德萊生物科技， 北京）分別提取其總RNA，操作參照試劑盒說(shuō)明書上的程序。經(jīng)電泳、紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的質(zhì)量和完整性后，參照Li et al.（2017）的方法合成第一鏈cDNA，根據(jù)課題組前期分離的FaeseuFUL基因（Genbank登錄號(hào)： KM386626.1）的cDNA序列，引入適宜的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，從甜蕎lpls突變體中克隆FeFUL2基因，PCR擴(kuò)增的上、下游引物分別為FeFUL2F和FeFUL2R。引物（表1）合成和DNA測(cè)序均委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2.2 蛋白同源序列比對(duì)與分子系統(tǒng)發(fā)生分析?將FeFUL2基因編碼的蛋白序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中執(zhí)行Protein Blast同源搜索比對(duì)。選取來(lái)源于不同被子植物類群中的同源序列，用MEGA 5.0軟件，選鄰接法（neighbour joining，NJ）構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹，所建樹經(jīng)1 000次的自展重復(fù)（bootstrap replicate）檢驗(yàn)，確定FeFUL2基因的進(jìn)化分支，以及與其他物種的FUL同源蛋白的演化關(guān)系（Tamura et al.， 2011）。同時(shí)用BioEdit 7.0.9軟件，選 ClustalW 程序?qū)eFUL2轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析和功能預(yù)測(cè)。

1.2.3 FeFUL2基因的表達(dá)分析?分別提取甜蕎lpls突變體的根、莖、葉、花被片、雄蕊、雌蕊和發(fā)育4 d幼果的總RNA，檢測(cè)其質(zhì)量與完整性后，合成第一鏈cDNA。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR， qPCR）技術(shù)檢測(cè)FeFUL2基因在甜蕎上述7種組織中表達(dá)的特異性和表達(dá)量的差異。qPCR檢測(cè)所用的基因的上、下游特異性引物分別為qFeFUL2F和qFeFUL2R（表1）; qPCR檢測(cè)所用的陽(yáng)性對(duì)照內(nèi)參基因?yàn)樘鹗w的Feactin基因（Genbank登錄號(hào)： HQ398855.1），檢測(cè)特異性引物分別為qFeactinF和qFeactinR（表1）。qPCR 在Line-Gene 9600 Plus Real-time PCR Detection System 中進(jìn)行，每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，實(shí)時(shí)熒光定量采用兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序： 95 ℃預(yù)變性30 s， PCR反應(yīng)為 95 ℃變性 10 s， 60 ℃ 延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。 溶解曲線分析為95 ℃ 15 s， 60 ℃ 60 s， 和95 ℃ 15 s。

2?結(jié)果與分析

2.1 甜蕎FeFUL2基因全長(zhǎng)cDNA的序列結(jié)構(gòu)與登錄

通過(guò)同源克隆方法，直接從甜蕎lpls突變體花序中分離到FeFUL2基因cDNA全長(zhǎng)。序列結(jié)構(gòu)分析表明：甜蕎FeFUL2基因cDNA序列全長(zhǎng)為837 bp，包括30 bp的5′UTR （untranslated region）、690 bp的完整ORF（Open Reading Frame）和117 bp的3′UTR，編碼229個(gè)氨基酸殘基和1個(gè)終止密碼子。其與擬南芥中AtFUL基因（Genbank登錄號(hào)： NM_125484.4 ）同源性最高，命名為FeFUL2 （Fagopyrum esculentum FUL），GenBank登錄號(hào)為MG779493.1。

2.2 甜蕎FeFUL2轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)分析與功能預(yù)測(cè)

轉(zhuǎn)錄因子分子系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化樹重建（圖1）顯示：甜蕎FeFUL2屬核心真雙子葉植物AP1/FUL亞家族轉(zhuǎn)錄因子中的euFUL進(jìn)化系，與核心真雙子葉植物euFUL型轉(zhuǎn)錄因子聚于1個(gè)進(jìn)化分支，與菠菜（Spinacia oleracea）的SpFUL親緣關(guān)系較近，同時(shí)與擬南芥的euFUL型轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列相似性高達(dá)54.55%，并與核心真雙子葉植物AP1/FUL亞家族轉(zhuǎn)錄因子中的AP1和AGL79進(jìn)化系分開，經(jīng)典分類學(xué)中同源蛋白所屬植物種屬間的進(jìn)化關(guān)系也在樹上得以很好地呈現(xiàn)（圖1）。 蛋白同源序列比對(duì)（圖2）顯示：甜蕎FeFUL2轉(zhuǎn)錄因子包含1個(gè)57個(gè)（1～57）氨基酸殘基長(zhǎng)的高度保守MADS-box結(jié)構(gòu)域，一個(gè)由69個(gè)（91～159）氨基酸殘基組成的次級(jí)保守的K結(jié)構(gòu)域，其C末端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)由70個(gè)（160～229）氨基酸殘基組成，雖然該區(qū)域序列長(zhǎng)度和氨基酸殘基的組成上同其他euFUL型轉(zhuǎn)錄因子差異較大，但該區(qū)域上仍存在2個(gè)十分保守的euFUL型轉(zhuǎn)錄因子特有的基元：FUL motif和paleo AP1 motif（Litt & Irish，2003; Shan et al.， 2007）。綜上來(lái)看，F(xiàn)eFUL2屬甜蕎MADS-box轉(zhuǎn)錄因子家族中的euFUL型轉(zhuǎn)錄因子，其M、K 和C區(qū)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域的保守性說(shuō)明該轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控花和果實(shí)發(fā)育的功能會(huì)呈現(xiàn)一定的保守性，但轉(zhuǎn)錄激活區(qū)序列長(zhǎng)度和氨基酸殘基的組成變異會(huì)使其功能呈現(xiàn)一定的分化。

2.3 FeFUL2基因在甜蕎中表達(dá)的組織特異性

qPCR檢測(cè)FeFUL2基因在甜蕎7種器官中表達(dá)的特異性發(fā)現(xiàn)（圖3）：甜蕎lpls突變體的根、莖、葉、花被片、雄蕊、雌蕊和發(fā)育4 d的幼果中均能檢測(cè)到FeFUL2基因的轉(zhuǎn)錄信號(hào)。進(jìn)一步分析FeFUL2基因在這7種器官中的相對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，其在花被片中的表達(dá)量最高，極顯著高于該基因在其他6種器官中的表達(dá)量（LSD，P<0.01）。另外，F(xiàn)eFUL2基因在雄蕊、雌蕊和發(fā)育4 d的幼果等生殖結(jié)構(gòu)中的表達(dá)量無(wú)顯著差異（LSD，P>0.05）;但在甜蕎根、莖和葉等營(yíng)養(yǎng)器官中，F(xiàn)eFUL2基因在莖和葉中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于根（LSD，P<0.05），但莖與葉中的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著性差異（LSD，P>0.05）。

3?討論與結(jié)論

在被子植物MADS-box轉(zhuǎn)錄因子中，M區(qū)主要負(fù)責(zé)DNA序列的識(shí)別與結(jié)合、蛋白二聚體形成和轉(zhuǎn)錄因子核定位，K區(qū)主要參與蛋白二聚體和多聚體的特異性結(jié)合，C末端結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄激

活和參與蛋白多聚體復(fù)合物形成，這3個(gè)關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)域在維持轉(zhuǎn)錄因子活性、發(fā)揮正常功能起重要作用（Theien et al.， 2016）。與來(lái)源于其他植物euFUL型轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)相比，甜蕎FeFUL2蛋白的M區(qū)和K區(qū)在氨基酸組成和序列長(zhǎng)度上十分保守，但其C末端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)在氨基酸殘基的組成和序列長(zhǎng)度上呈現(xiàn)較大的變異，推測(cè)該轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控花和果實(shí)的發(fā)育時(shí)功能會(huì)呈現(xiàn)一定的保守性，同時(shí)也會(huì)呈現(xiàn)一定的分化。

前人在研究模式植物擬南芥和金魚草（Antirrhinum majus）花發(fā)育調(diào)控發(fā)現(xiàn)，MADS-box基因的表達(dá)模式與其功能有明顯的相關(guān)性;因此，在其他植物中，可通過(guò)MADS-box基因的表達(dá)模式來(lái)預(yù)測(cè)其功能（Ma & dePamphilis， 2000）。在薔薇類（rosids）植物擬南芥中，F(xiàn)UL基因編碼MADS-box基因家族中AP1/FUL進(jìn)化系轉(zhuǎn)錄因子， 其在花序分生組織、花芽原基、雌蕊、莖和莖生葉中均有表達(dá)，參與促進(jìn)花序、花芽的分化、雌蕊中胚珠的發(fā)育與開花，同時(shí)還參與調(diào)控莖生葉和果實(shí)的發(fā)育（McCarthy et al.， 2015）;擬南芥近緣種油菜（Brassica napus）的FUL-like基因則具有參與調(diào)控長(zhǎng)角果開裂的功能（Peng et al.， 2015）。豆科（Leguminosae）植物苜蓿（Medicago truncatula）有3個(gè)FUL-like型基因，序列相似性高的MtFULa 和 MtFULb在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖發(fā)育階段均有表達(dá)，但在開花前表達(dá)量最高，主要參與促進(jìn)植物開花，MtFULc在開花后表達(dá)量最高，主要參與促進(jìn)花的發(fā)育（Jaudal et al.， 2015）;大豆（Glycine max）的FUL同源基因GmFULa在根、莖、葉、莖頂端分生組織、花和莢果中均有表達(dá)，但其在花中的表達(dá)量最高，主要參與調(diào)控植物的成花轉(zhuǎn)變和開花（Jia et al.， 2015）;雞蛋果（Passiflora edulis）的FUL-like基因PeFUL不僅在所有花器官和果實(shí)中有表達(dá)，其在營(yíng)養(yǎng)器官中也有表達(dá)，但其在幼果中的表達(dá)量最高，主要參與果實(shí)的發(fā)育調(diào)控（Scorza et al.， 2017）。在菊類（asterids）植物番茄（Solanum lycopersicum）中，F(xiàn)UL-like基因TDR4在雄蕊和果實(shí)開始發(fā)育時(shí)表達(dá)，且在成熟漿果中的表達(dá)量最高，但另一個(gè)FUL-like基因SlFUL2在所有花器官、果實(shí)中均有表達(dá)，兩者均參與調(diào)控果實(shí)的發(fā)育和成熟（Bemer et al.， 2012;Maheepala et al.， 2019）。在山茶（Camellia japonica）中，F(xiàn)UL-like基因CjAPL1（CjFUL1）在所有花器官中均有表達(dá)，但其在心皮中的表達(dá)量最高，主要參與促進(jìn)開花和果實(shí)的發(fā)育，而且其在重瓣品種的表達(dá)量明顯高于單瓣，說(shuō)明其可能也參與花被片的發(fā)育調(diào)控（Sun et al.， 2014;Lyu et al.， 2019）。上述研究發(fā)現(xiàn)，核心真雙子葉植物FUL-like基因的表達(dá)模式和功能呈現(xiàn)出明顯的多樣性。薔薇類和菊類作為核心真雙子葉植物最大的2個(gè)進(jìn)化分支（Zeng et al.， 2014），其不同類群的植物，甚至同一科不同植物的FUL-like基因，表達(dá)模式會(huì)隨序列結(jié)構(gòu)的變化而呈現(xiàn)一定的差異，但主要參與其表達(dá)量最高的組織發(fā)育與調(diào)控。在甜蕎中，F(xiàn)eFUL2在營(yíng)養(yǎng)器官和生殖結(jié)構(gòu)中均有表達(dá)，其表達(dá)模式與其近緣種菠菜的SpFUL基類類似（Sather & Golenberg， 2009），但其在花被片中的表達(dá)量最高，推測(cè)甜蕎FeFUL2基因可能主要參與花被片的發(fā)育調(diào)控。

前人研究發(fā)現(xiàn)，核心真雙子葉植物euFUL型基因是由祖先類型的FUL-like基因通過(guò)1次主要的基因重復(fù)后產(chǎn)生（Shan et al.， 2007）。基因重復(fù)前的FUL-like基因通常表現(xiàn)出更廣泛的表達(dá)模式，基部真雙子葉植物懸鈴木（Platanus acerifolia）的FUL-like基因在營(yíng)養(yǎng)器官和生殖結(jié)構(gòu)中均有表達(dá)，主要參與開花和花發(fā)育調(diào)控（Zhang et al.， 2019）;罌粟科（Papaveraceae）植物罌粟（Papaver somniferum）是較為原始的基部真雙子葉植物，其FUL-like基因具真雙子葉植物中euAP1和euFUL型基因所有的功能，主要參與促進(jìn)開花、花分生組織特性決定、花被片和果實(shí)發(fā)育等（Pabón-Mora et al.， 2012）。可見(jiàn)，F(xiàn)UL-like基因通過(guò)基因重復(fù)事件產(chǎn)生的euFUL型基因在核心真雙子葉植物中發(fā)生了明顯的亞功能化，但其表達(dá)模式和功能會(huì)伴隨被子植物的系統(tǒng)發(fā)育與演化發(fā)生改變（Litt & Irish， 2003）。甜蕎屬早期分化的核心真雙子葉植物（Brockington et al.， 2012），其與菊類植物中菠菜和山茶的親緣關(guān)系較近（Zeng et al.， 2014），我們的分子系統(tǒng)發(fā)生分析也支持了前人分類學(xué)的結(jié)果，同時(shí)，山茶的FUL-like基因也具有參與調(diào)控花被片發(fā)育的功能（Sun et al.， 2014），F(xiàn)eFUL2基因參與調(diào)控花被片發(fā)育的功能可能是其在伴隨物種演化過(guò)程中，對(duì)祖先類型基因功能的保留，其在甜蕎花發(fā)育中的具體作用和生理功能仍有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯?周翠鳴）