“串珠狀”復合納米組裝體修飾絲網(wǎng)印刷電極構(gòu)建的生物傳感器

徐夢祎，黃雪雯，李小杰，魏 瑋，劉曉亞

（江南大學化學與材料工程學院,無錫 214122）

隨著傳感技術(shù)的不斷革新，生物傳感器在疾病診斷和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域得到了快速發(fā)展.酶基傳感器作為最早商業(yè)化的生物傳感器，目前已廣泛應(yīng)用于血糖、尿酸和乳酸等生理指標的檢測［1～4］以及有機磷和過氧化氫等環(huán)境指標的檢測［5，6］.這類傳感器由固定化酶和修飾電極組成，通過酶與底物反應(yīng)，將化學信號轉(zhuǎn)換成電信號輸出，進而對底物進行量化分析.電極作為信號傳導的重要組成部分，對傳感性能的影響至關(guān)重要.提升酶與電極之間的直接電子轉(zhuǎn)移能力仍是新一代酶基傳感器面臨的主要問題，通常需要引入導電基元對電極進行修飾以促進電子的傳輸［7～9］.

碳納米管（CNTs）是一種具有中空結(jié)構(gòu)的一維納米材料，因其優(yōu)異的電學和力學特性而成為電極修飾材料的理想選擇［10～12］；但強烈的范德華力相互作用極易導致CNTs發(fā)生團聚，限制其實際應(yīng)用［13］.為此，人們常使用結(jié)構(gòu)可設(shè)計的功能聚合物對CNTs 進行改性，其改性分為共價鍵改性和非共價鍵改性2種方式［14，15］.非共價鍵改性是利用氫鍵、范德華力、親疏水作用及π-π作用等弱相互作用對CNTs 進行改性［15～18］.該方法不易破壞CNTs的結(jié)構(gòu)，但由于非共價鍵強度較弱，傳感器的穩(wěn)定性較難保持.相對而言，共價鍵改性效果更加顯著，改性劑與碳納米管之間通過化學鍵連結(jié)，長期穩(wěn)定性好［19，20］，但大部分共價改性方法的反應(yīng)環(huán)境不夠溫和，會破壞碳納米管的共軛結(jié)構(gòu)，損害碳納米管固有的結(jié)構(gòu)性能［14］.Diels-Alder 反應(yīng)是指共軛雙烯類化合物（二烯體）與含有一個活潑雙鍵或叁鍵的化合物（親二烯體）之間發(fā)生可逆環(huán)加成的反應(yīng).該方法反應(yīng)條件溫和，具有良好的可逆性和穩(wěn)定性等特點，適用于CNTs的共價改性［21～23］.

本文以丙烯酰胺基苯硼酸（AAPBA）、甲基丙烯酸糠酯（FMA）和甲基丙烯酸羥乙酯（HEMA）為單體，合成了雙親性無規(guī)共聚物poly（AAPBA-co-FMA-co-HEMA）（PAFH）；PAFH與CNTs發(fā)生Diels-Alder反應(yīng)，制備了聚合物共價接枝改性碳納米管PAFH-CNTs；再通過自組裝方法制備了0D/1D“串珠狀”復合納米組裝體PAFH-CNTs NCs；將PAFH-CNTs NCs 用于修飾絲網(wǎng)印刷碳電極（SPCE），并構(gòu)建了用于檢測過氧化氫（H2O2）的酶基生物傳感器（Scheme 1）.在該策略中，PAFH-CNTs NCs 在電極表面形成納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，較大的比表面積和PAFH 中對糖蛋白有強親和性的苯硼酸基團有利于辣根過氧化氫酶（HRP）的有效固定和電子的快速轉(zhuǎn)移.PAFH與CNTs共價結(jié)合的方式使得空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)固，賦予了生物傳感器更好的穩(wěn)定性.

Scheme 1 Schematic illustration of fabricating enzymatic biosensor

Scheme 2 Synthesis route of PAFH-CNTs NCs

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

絲網(wǎng)印刷碳電極（SPCE，CL10）購于寧波元感生物科技有限公司；3-丙烯酸氨基苯硼酸（AAPBA，純度98%）購于美國Ark Pharm有限公司；甲基丙烯酸糠醇酯（FMA，純度95%）購自北京百靈威科技有限公司；甲基丙烯酸羥乙酯（HEMA，純度96%）、多巴胺（DA，純度99%）和尿酸（UA，純度99%）購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；偶氮二異丁腈（AIBN，純度99%，重結(jié)晶）和辣根過氧化物酶（HRP，＞300 U/mg）購于上海麥克林生化科技有限公司；2-（十二烷基三硫代碳酸酯基）-2-甲基丙酸（DMP）購于西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；過氧化氫溶液、N，N'-二甲基甲酰胺（DMF）和葡萄糖（Glc）均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司；L-賴氨酸（Lys）、抗壞血酸（AA）和谷氨酸（Glu），生物試劑，購于國藥集團化學試劑有限公司；多壁碳納米管（TNM3，d=10～20 nm，l=0～30 μm）購自中國科學院成都有機化學有限公司；全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物溶液（Nafion，D-520，質(zhì)量分數(shù)5%）購于杜邦中國集團有限公司.

Nicolet iS50 型全反射傅里葉變換紅外光譜儀（ATR-FTIR），美國賽默飛世爾科技公司；AVANCEⅢHD 型核磁共振波譜儀（1H NMR），德國布魯克有限公司；1525 型凝膠滲透色譜儀（GPC），美國Waters有限公司，S-4800型掃描電子顯微鏡（SEM），日本電子株式會社；1100SF型熱重分析儀（TGA），梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司；inVia型顯微共聚焦拉曼光譜儀，英國雷尼紹貿(mào)易有限公司；JEM-2100型透射式電子顯微鏡（TEM），日本電子株式會社；TU-1901 型雙光束紫外-可見分光光度計（UV-Vis），北京普析通用儀器有限公司；CHI660E電化學工作站，上海辰華儀器有限公司.

1.2 實驗過程

1.2.1 雙親性無規(guī)共聚物PAFH的制備 以AAPBA為生物親和單體，F(xiàn)MA為二烯體單體，HEMA為親水單體，以AIBN 為引發(fā)劑，DMP為鏈轉(zhuǎn)移劑，合成了雙親性無規(guī)共聚物PAFH，反應(yīng)過程如Scehem 2所示.將0.9550 g AAPBA，1.6617 g FMA，1.3014 g HEMA，0.1422 g DMP 和0.0064 g AIBN 溶解在10 mL DMF中，經(jīng)冷凍-抽氣-解凍循環(huán)3次除去溶液中的氧氣；將溶液在75 ℃下反應(yīng)48 h，反應(yīng)完畢用液氮猝滅；將反應(yīng)液在乙醚中沉淀，固體用THF溶解，再用石油醚沉淀，重復溶解和沉淀過程3次；將收集的淺黃色固體于30 ℃下真空干燥12 h，得到產(chǎn)物PAFH.

1.2.2 復合納米組裝體PAFH-CNTs NCs的制備 以PAFH中的呋喃環(huán)為二烯體，CNTs為親二烯體，進行Diels-Alder 反應(yīng)，制備了聚合物改性碳納米管PAFH-CNTs（Scheme 2）.將250 mg PAFH 溶解于10 mL DMF 中；將25 mg CNTs 超聲分散于40 mL DMF 中；將2 種溶液混合，于80 ℃超聲反應(yīng)8 h；取2 mL Diels-Alder反應(yīng)液，加入0.5 mL DMF，在超聲下緩慢滴加0.3 mL水，超聲0.5 h至穩(wěn)定，經(jīng)透析后得到PAFH-CNTs NCs分散液.

1.2.3 酶基生物傳感器的構(gòu)建 在經(jīng)預(yù)處理的SPCE工作電極上滴涂9 μL PAFH-CNTs NCs分散液；待電極干燥后依次滴涂3 μL 10 mg/mL HRP 和3 μL 0.1%（質(zhì)量分數(shù)）的Nafion（NF）溶液，干燥后即得到酶基生物傳感器，于4 ℃下保存.

2 結(jié)果與討論

2.1 PAFH的合成與表征

以AAPBA，F(xiàn)MA和HEMA為單體，通過可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合（RAFT）反應(yīng)制備了雙親性無規(guī)聚合物PAFH.利用核磁共振氫譜對聚合物的結(jié)構(gòu)進行了表征.如圖1所示，δ0.46～1.87處為聚合物主鏈上H1，H2，H9，H10，H15和H16的特征峰，δ4.94 處為糠酯單體上H11的特征峰，δ6.45 處為糠酯單體上H12和H13的特征峰，δ7.17～7.89 處為糠酯單體上H14及苯硼酸單體上H4～H7的特征峰，δ7.99和9.75 處分別為苯硼酸單體上H8和H3的特征峰，δ4.79，3.88 和3.56 處分別為甲基丙烯酸羥乙酯上H19，H17和H18的特征峰.通過δ4.94，3.88和7.17～7.89處峰的積分面積求得合成的聚合物中n（AAPBA）∶n（FMA）∶n（HEMA）的實際配比為0.306∶0.960∶1.上述結(jié)果表明，合成了雙親性無規(guī)共聚物PAFH.GPC 測試結(jié)果顯示，所制備的PAFH 數(shù)均分子量為9200，聚合物多分散性指數(shù)（PDI）為1.58.

Fig.1 1H NMR spectrum of PAFH

2.2 PAFH-CNTs NCs的制備與表征

PAFH 的呋喃環(huán)與CNTs 之間發(fā)生Diels-Alder 反應(yīng)，制得聚合物共價改性碳納米管PAFH-CNTs.圖2（A）為PAFH，CNTs和PAFH-CNTs的紅外光譜圖，可見，CNTs的紅外譜圖中幾乎沒有吸收峰，而修飾后的PAFH-CNTs 的紅外光譜圖出現(xiàn)了一系列吸收峰，且與PAFH 的吸收峰基本一一對應(yīng)，證明了PAFH-CNTs的成功制備.

Fig.2 FTIR spectra(A)and TGA curves(B)of PAFH,CNTs and PAFH-CNTs

圖2（B）示出了PAFH，CNTs 和PAFH-CNTs 的TGA 曲線.可見，CNTs 在升溫至800 ℃后未發(fā)生失重，而PAFH 在升溫過程中質(zhì)量迅速下降，在600 ℃后其失重基本達到穩(wěn)定，聚合物的熱分解基本完成，650 ℃時熱失重比例為87.38%；在升溫過程中，PAFH-CNTs 中PAFH 的熱分解導致其質(zhì)量發(fā)生明顯下降，在升溫至650 ℃后熱失重比例為11.09%.根據(jù)3種樣品的熱失重比例計算得出PAFH-CNTs中聚合物PAFH和CNTs的質(zhì)量分數(shù)分別為12.69%和87.31%.

通過離心實驗評估了CNTs 和PAFH-CNTs 分散液的穩(wěn)定性［圖3（A）］.離心前，CNTs 和PAFHCNTs的DMF分散液均一性良好，離心后，CNTs聚集在瓶底，而PAFH-CNTs依舊穩(wěn)定分散，未發(fā)生沉底現(xiàn)象.這說明對CNTs進行共價改性后，得到的PAFH-CNTs在DMF中的穩(wěn)定性顯著提高.

Fig.3 Digital photographs of CNTs and PAFH-CNTs dispersion before or after centrifugation(A)and Raman spectra of CNTs and PAFH-CNTs(B)

圖3（B）為PAFH，CNTs 和PAFH-CNTs 的拉曼（Raman）光譜.可見，CNTs 在1360和1598 cm-1處有2個特征吸收峰，對應(yīng)于無序的sp3雜化碳原子的D帶和石墨化的sp2雜化碳原子的G帶.PAFH-CNTs分別在1364和1602 cm-1處出現(xiàn)了D帶和G帶吸收峰.D帶和G帶的峰強度比值（ID/IG）通常用來衡量碳材料的缺陷程度［24］，CNTs 的ID/IG為0.867，PAFH-CNTs 的ID/IG為0.879，2 個數(shù)值較為接近，說明Diels-Alder反應(yīng)條件較為溫和，不會對CNTs結(jié)構(gòu)造成明顯破壞.

雙親性無規(guī)共聚物在選擇性溶劑中可以通過親疏水作用自組裝形成聚合物納米粒子［25］.在良溶劑DMF中，PAFH鏈呈無規(guī)線團狀.而在加入不良溶劑水后，溶液環(huán)境變得不利于PAFH中疏水鏈段的溶解，導致PAFH中疏水鏈段的收縮，隨著透析的進行，溶液環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)樗h(huán)境，PAFH和接枝在CNTs表面的聚合物共組裝形成0D/1D“串珠狀”復合納米組裝體材料PAFH-CNTs NCs.利用SEM 和TEM 對PAFH-CNTs NCs 的形貌進行了表征.由圖4 可見，PAFH-CNTs NCs 呈現(xiàn)以PAFH 形成的粒子為“珠”，CNTs為“線”的串珠狀，少量PAFH鏈同時與多根CNTs共價相連，形成了不規(guī)則狀組裝體.

Fig.4 SEM(A)and TEM(B)images of PAFH-CNTs NCs

圖5（A）示出了500 nm 波長處不同濃度CNTs 水分散液的吸光度.隨著CNTs 水分散液濃度的增大，其在500 nm波長處的吸光度呈現(xiàn)線性增大，計算得到的線性方程為A=55.9c-0.0115（R2=0.999）.根據(jù)PAFH-CNTs NCs水分散液在500 nm波長處的吸光度，減去聚合物納米粒子的吸光度，計算得到制備的PAFH-CNTs NCs 水分散液中CNTs 的濃度為0.0212 mg/mL.圖5（A）插圖為CNTs（a）和PAFH-CNTs NCs（b）水分散液的照片，可以看出，CNTs 在純水中不能穩(wěn)定分散，靜置后發(fā)生沉淀，而組裝后的PAFH-CNTs NCs水分散液則可以均勻穩(wěn)定地長期分散.

Fig.5 Standard curve of PAFH-CNTs NCs absorption(A)and the ratios of the absorbance value of PAFH-CNTs aqueous dispersion(At)at 500 nm to absorbance value at first day(Ai)in 30 d(B)

PAFH-CNTs NCs 分散液的長期穩(wěn)定性對該材料的實際應(yīng)用性有重要影響.利用紫外-可見分光光度法研究了PAFH-CNTs NCs分散液的穩(wěn)定性，即測試PAFH-CNTs NCs分散液在500 nm波長處的吸光度，觀察其隨時間的變化.圖5（B）示出了PAFH-CNTs NCs分散液的吸光度隨時間的變化情況，在靜置30 d 后，分散液的吸光度仍保持在初始值的98%以上，說明PAFH-CNTs NCs 分散液具有優(yōu)異的穩(wěn)定性.

2.3 酶基生物傳感器的構(gòu)建及表征

Fig.6 SEM images of SPCE(A),PAFH-CNTs NCs/SPCE(B),HRP/PAFH-CNTs NCs/SPCE(C)and NF/HRP/PAFH-CNTs NCs/SPCE(D)

在SPCE工作電極上依次修飾PAFH-CNTs NCs，HRP和Nafion，即可制得過氧化氫傳感器.圖6為不同修飾過程電極表面的SEM 照片.裸SPCE 的表面由高比表面積的碳納米顆粒構(gòu)成［圖6（A）］；PAFH-CNTs NCs/SPCE表面形成了由0D/1D復合納米組裝體材料構(gòu)成的納米網(wǎng)絡(luò)［圖6（B）］，這種納米結(jié)構(gòu)有利于酶的負載和待測目標物的傳質(zhì)；在修飾HRP后，絕大多數(shù)酶固定在PAFH-CNTs NCs構(gòu)成的納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，少量存在于表面［圖6（C）］；NF/HRP/PAFH-CNTs NCs/SPCE 在修飾電極上形成一層較為平整的膜，可以起到保護生物傳感器的作用［圖6（D）］.

圖7 給出了SPCE，PAFH-CNTs NCs/SPCE和NF/HRP/PAFH-CNTs NCs/SPCE 的循環(huán)伏安（CV）曲線.可以看出，經(jīng)PAFH-CNTs NCs 修飾后，電極的氧化還原峰略有下降，這是由于絕緣的聚合物含量遠大于導電的CNTs.同時，酶和Nafion的加入進一步降低了電流峰值.

已知基于HRP制備的H2O2傳感器可能發(fā)生的檢測機理如式（1）～式（3）所示［26］.其中，化合物Ⅰ和Ⅱ是HRP 的氧化配合物，HRP 中血紅素的Fe（IV）與氧進行配位，加入H2O2后HRP 被氧化，引起電流的增加.

Fig.7 CV curves of SPCE(a),PAFH-CNTs NCs/SPCE(b)and NF/HRP/PAFH-CNTs NCs/SPCE(c)

圖8 為NF/HRP/PAFH-CNTs NCs/SPCE 在加入不同濃度H2O2后的電流-時間（I-t）曲線.可見，隨著H2O2溶液的加入，NF/HRP/PAFH-CNTs NCs/SPCE呈現(xiàn)出階梯式的電流變化.該傳感器的響應(yīng)電流值與H2O2濃度存在線性關(guān)系，在0.02～3.48 mmol/L 的濃度范圍內(nèi)，計算得到的線性回歸方程為I=3.999c+0.8828，式中：c（mmol/L）為H2O2濃度，R2=0.997，靈敏度為63.98 μA·（mmol/L）-1·cm-2，且響應(yīng)時間較短（＜3 s），計算得到的檢出限（LOD）為4.2 μmol/L（S/N=3）.

Fig.8 I-t curve of NF/HRP/PAFH-CNTs NCs/SPCE(A)and calibration curve of response currents against H2O2 concentration(B)

進一步測試了傳感器的選擇性、抗干擾性和穩(wěn)定性.選擇Glc，AA，DA，UA，Glu和Lys作為干擾物（干擾物濃度為H2O2的10 倍）測試了NF/HRP/PAFH-CNTs NCs/SPCE 的電流響應(yīng)情況.由圖9（A）可知，該傳感器對干擾物的響應(yīng)十分微弱，且在存在干擾物的情況下仍能保持對H2O2的高電流響應(yīng)，可以實現(xiàn)特異性檢測.圖9（B）示出了同一支NF/HRP/PAFH-CNTs NCs/SPCE 傳感器對0.1 mmol/L H2O2溶液進行連續(xù)30 d測試的結(jié)果.可見，第15 d時傳感器的響應(yīng)電流為初始響應(yīng)電流的93.7%，30 d后，傳感器的響應(yīng)電流依舊保持在初始響應(yīng)電流的90%左右，優(yōu)于之前非共價鍵改性的體系［27］，表明其具有優(yōu)異的穩(wěn)定性.

為了測試NF/HRP/PAFH-CNTs NCs/SPCE的實際應(yīng)用性能，對真實樣品中進行了加標回收實驗，結(jié)果列于表1.該生物傳感器對含不同濃度H2O2的牛奶和湖水樣品檢測的回收率在97%～103%之間，相對標準偏差（RSD）較小，符合檢測要求.這表明該生物傳感器可用于實際樣品的檢測.

Fig.9 Anti-interference(A)and stability analysis(B)of NF/HRP/PAFH-CNTs NCs/SPCE

Table 1 Detection of H2O2 in milk and lake water samples using NF/HRP/PAFH-CNTs NCs/SPCE biosensor

3 結(jié) 論

以生物親和單體AAPBA，二烯體單體FMA 和親水單體HEMA 合成了功能性雙親無規(guī)共聚物PAFH；然后以PAFH為二烯體，CNTs為親二烯體，通過Diels-Alder反應(yīng)制備了聚合物共價改性碳納米管PAFH-CNTs，其在選擇性溶劑中與PAFH 共組裝制得0D/1D“串珠狀”復合納米組裝體材料PAFHCNTs NCs.將PAFH-CNTs NCs 修飾在SPCE 表面構(gòu)建了用于檢測H2O2的電化學生物傳感器.PAFHCNTs NCs在電極表面形成納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，較大的比表面積和PAFH中對糖蛋白有強親和性的苯硼酸基團均利于HRP的固定.PAFH與CNTs之間共價結(jié)合的方式較為穩(wěn)定，因此納米材料自身的結(jié)構(gòu)與形成的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定.由此制備的生物傳感器對H2O2具有優(yōu)良的檢測性能.