2-(2-羥基-3-甲氧基苯基)-C60的合成及在花椰菜花葉病毒啟動子DNA傳感檢測中的應(yīng)用

吳楊儀，陳建平，艾益靜，汪慶祥，高 飛，高 鳳

（閩南師范大學(xué)化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院,福建省現(xiàn)代分離分析科學(xué)與技術(shù)重點實驗室,漳州 363000）

DNA生物傳感器是一類基于堿基配對原則特異性識別目標序列，并通過換能器將該配對雜交反應(yīng)轉(zhuǎn)化為可讀信號，從而實現(xiàn)對目標序列定性和定量分析的裝置［1，2］.由于電化學(xué)方法具有儀器簡單、響應(yīng)速度快、操作簡便和易于微型化等優(yōu)點，電化學(xué)DNA傳感器在環(huán)境檢測、疾病診斷和食品安全等領(lǐng)域廣受關(guān)注［3～5］.在該類傳感器的構(gòu)建過程中，DNA探針序列在基底電極表面的固定是決定該傳感器分析性能的關(guān)鍵步驟［6，7］.隨著納米科學(xué)和技術(shù)的發(fā)展，越來越多的納米材料被作為傳感支撐材料應(yīng)用于高性能電化學(xué)DNA傳感器的構(gòu)建［8～10］，這主要是因為納米材料的高比表面特征有利于提高核酸探針的固定量，從而提高對目標序列的捕捉能力和識別有效性；而且高活性位點有助于電極表面的功能化，用于核酸探針的穩(wěn)定固定.

富勒烯C60作為一種特殊結(jié)構(gòu)的碳同素異形體，因具有穩(wěn)定性高、易于化學(xué)修飾及獨特的光電性能而備受關(guān)注［11～13］.但該材料的實際應(yīng)用受到其固有的疏水性及表面無可利用的化學(xué)活性官能團的限制.為了解決這一問題，研究人員合成了一系列C60衍生物和復(fù)合物，并作為新型功能材料用于構(gòu)建電化學(xué)傳感器.如，Wei 等［14］在乙醇氣泡輔助下采用高溫重沉淀法合成了厚度為20 nm 的C60空心微球膜，并通過電化學(xué)活化促進其導(dǎo)電性能.電化學(xué)傳感實驗表明，由于合成的C60空心微球膜具有獨特的結(jié)構(gòu)和大的比表面積，其修飾電極作為傳感器可用于多巴胺和尿酸的高靈敏度檢測.另外，You等［15］合成了聚酰胺（PAMAM）功能化的C60和二硫化鉬（MoS2）雜化納米材料，并將其作為傳感平臺應(yīng)用于鼠傷寒沙門氏菌特異性sul1基因的檢測.分析結(jié)果表明，基于C60/MoS2雜化材料的高導(dǎo)電能力和級聯(lián)放大策略，該生物傳感器對靶基因的檢測限達到29.57 fmol/L.上述研究進一步拓寬了C60及其衍生物在電分析化學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景.然而，迄今通過化學(xué)合成法對C60進行衍生化修飾，并利用衍生基團的功能性構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器的研究報道還較少.

本文通過1，3-偶極［3＋2］環(huán)加成反應(yīng)合成了新型2-（2-羥基-3-甲氧基苯基）-C60吡咯烷化合物（HMP-C60），并對其結(jié)構(gòu)進行了表征.通過滴涂法將其吸附在玻碳電極（GCE）表面，得到HMP-C60修飾電極；再以Zr4+為橋聯(lián)劑，利用其與HMP-C60上—OH，—NH—以及與探針DNA 5′-的強配位作用，將DNA 探針固定到了HMP-C60修飾電極表面，制備了一種電化學(xué)DNA 傳感界面.同時，以［Fe（CN）6］3-/4-為電活性探針，采用循環(huán)伏安法對不同修飾電極進行表征，利用電化學(xué)交流阻抗法考察了傳感器對轉(zhuǎn)基因CaMV35S啟動子特征DNA 片段的雜交性能.實驗結(jié)果表明，該生物傳感器的檢出限達到4.0×10-14mol/L，并顯示出良好的堿基錯配識別性能.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

C60購于河南省濮陽市永新富勒烯科技有限公司；六氰合鐵酸鉀（K3［Fe（CN）6］）、六氰合亞鐵酸鉀（K4［Fe（CN）6］）、氯化鉀（KCl）、濃鹽酸（HCl）和乙醇均購自西隴化工試劑有限公司；甘氨酸（Gly）購于國家集團化學(xué)試劑有限公司；鄰香蘭素（HMB）和ZrO（NO3）2均為分析純，購自上海晶純試劑有限公司；花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子片段及相關(guān)互補和錯配片段購自生工生物工程（上海）股份有限公司，其堿基序列構(gòu)成如下：5′-TCTTTGGGACCACTGTCG-3′（探針序列，S1），5′-CGACAGTGGTCCCAAAGA-3′（互補序列，S2），5′-CGACAGTGGACCCAAAGA-3′（單堿基錯配序列，S3）以及5′-GCATCGAGCGAGCACGTA-3′（非互補序列，S4）.實驗用水為二次蒸餾水.

采用CHI 650C型電化學(xué)分析儀（上海辰華儀器公司）進行循環(huán)伏安和電化學(xué)阻抗測試.工作站連接三電極體系：基底工作電極為玻碳電極（GCE，φ=3 mm），對電極為鉑絲（Pt）電極，參比電極為Ag/AgCl 電極.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測試在Agilent LC-MSD-Trap-6320 型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS，美國Agilent 公司）上進行.采用360型傅里葉變換紅外光譜儀（美國Nicolet 儀器公司）和UV-2550型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）對產(chǎn)物HMP-C60的紅外光譜（FTIR）和紫外-可見光譜（UV-Vis）進行測試.

1.2 實驗方法

1.2.1 HMP-C60的合成及表征 HMP-C60的合成路線見Scheme 1.具體實驗步驟如下：向80 mL甲苯中加入0.0501 g（0.070 mmol）C60，經(jīng)超聲振蕩溶解，得到均勻溶液.分別稱取0.0214 g（0.14 mmol）HMB和0.0259 g（0.34 mmol）Gly 加入上述C60溶液中，并在N2氣保護下于100 ℃油浴中回流反應(yīng)24 h，得到暗紅色溶液.對上述溶液進行減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，溶液變?yōu)樽丶t色；再依次以環(huán)己烷、甲苯和甲苯/乙腈混合液為洗脫劑將反應(yīng)液用100～200目和200～300目硅膠柱進行分離純化.黃色色帶溶液經(jīng)減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、真空干燥得到棕黃色固體產(chǎn)物HMP-C60.通過消耗的C60質(zhì)量計算出17.2 mg產(chǎn)物HMP-C60的反應(yīng)產(chǎn)率為69.9%.

Scheme 1 Synthetic route of HMP-C60

1.2.2 傳感器的制備 先采用機械打磨法用α-Al2O3拋光粉將裸GCE打磨至鏡面，再用水淋洗，并依次在水、乙醇和水中分別超聲約2 min后，用N2氣吹干，備用.

配制1.0×10-4mol/L HMP-C60的苯腈溶液，取10 μL 滴于拋光后的裸GCE 表面，自然晾干，得到HMP-C60修飾電極.配制1.0 g/L ZrO（NO3）2水溶液，取10 μL 滴于HMP-C60/GCE 表面，于室溫下晾干，得到Zr4+修飾電極（Zr/HMP-C60/GCE）.進一步，將10 μL 1.0×10-8mol/L 探針DNA（S1）溶液滴于Zr/HMP-C60/GCE 表面，使S1與Zr4+在電極表面發(fā)生配位反應(yīng).待電極晾干后，用水淋洗電極表面以去除未牢固吸附的DNA，制得DNA修飾電極（S1/Zr/HMP-C60/GCE）.

1.2.3 雜交反應(yīng)及檢測 將制備的傳感器（S1/Zr/HMP-C60/GCE）浸入含有目標DNA（S2）或?qū)φ誅NA（S3或S4）的雜交液中，于42 ℃水浴中孵化反應(yīng)40 min，然后用水淋洗去除未雜交的DNA片段，得到雜交電極（Scheme 2）.以1.0 mmol/L［Fe（CN）6］3-/1.0 mmol/L［Fe（CN）6］4-（0.1 mol/L KCl）為電化學(xué)探針，采用循環(huán)伏安（CV）和電化學(xué)交流阻抗（EIS）法對傳感器制備過程進行表征；同時，采用EIS考察傳感器的雜交性能.

Scheme 2 Illustration for the preparation of the HMP-C60 based DNA biosensor

2 結(jié)果與討論

2.1 HMP-C60的結(jié)構(gòu)表征

采用KBr 壓片法制備樣品，對產(chǎn)物進行FTIR 測定，結(jié)果顯示在774.34 cm-1處出現(xiàn)中等強度吸收峰，可歸屬為2-羥基-3-甲氧基苯基團苯環(huán)上面外的彎曲振動；3445.68和1368.28 cm-1處的強吸收峰對應(yīng)于羥基（─OH）的伸縮振動.C60母體的特征吸收峰出現(xiàn)在532.78，1251.77 和1382.94 cm-1處.1069.89 cm-1處出現(xiàn)對應(yīng)于C—O—C醚鍵的伸縮振動吸收峰；1601.32 cm-1處為苯環(huán)的骨架伸縮振動吸收峰；在1632.58 cm-1處出現(xiàn)吡咯環(huán)的伸縮振動峰.

HMP-C60的UV-Vis吸收光譜［圖1（A）］顯示，產(chǎn)物在257和322 nm有2個吸收峰，對應(yīng)于C60母體的特征吸收［16］；另外，在431 nm處出現(xiàn)1個小吸收峰，表明在C60上發(fā)生了［6，6］閉環(huán)結(jié)構(gòu)單加成反應(yīng)［17］.此結(jié)果也表明產(chǎn)物為新的化合物，而不是C60與其它反應(yīng)試劑的簡單物理摻雜.

Fig.1 UV-Vis absorption spectrum(A)and mass spectrum(B)of synthesized HMP-C60

圖1（B）為產(chǎn)物在負離子模式下的LC-MS 分析結(jié)果.可見，在m/z884.1 處有1 個強質(zhì)譜基峰，與HMP-C60分子離子峰相符，同時在m/z720.0處可觀察到產(chǎn)物的碎片離子峰［C60］-.

綜合上述分析可知，通過1，3-偶極［3＋2］環(huán)加成反應(yīng)，已合成C60吡咯烷衍生物—2-（2-羥基-3-甲氧基苯基）-C60吡咯烷.

2.2 HMP-C60基DNA電化學(xué)傳感器的制備與表征

通過化學(xué)修飾，HMP-C60表面衍生了具有功能性的含氮和含氧基團；同時基于該功能基團的配位能力，以Zr4+為橋聯(lián)試劑構(gòu)建了一種新型的電化學(xué)傳感器.首先，采用CV法和EIS法對HMP-C60基DNA電化學(xué)傳感器的制備進行了表征.圖2（A）為各修飾電極在1.0 mmol/L［Fe（CN）6］3-/4-表征液中的CV曲線.可見，［Fe（CN）6］3-/4-在未修飾的裸GCE 上有1對對稱的氧化還原峰，其氧化峰電位（Epa）和還原峰電位（Epc）分別為182和109 mV（譜線a）.當HMP-C60修飾在GCE表面后，由于HMP-C60表面的─NH─，─OH 及─OCH3等基團的阻礙作用，抑制了［Fe（CN）6］3-/4-的分子擴散和電子轉(zhuǎn)移動力學(xué)，氧化還原反應(yīng)峰電流出現(xiàn)明顯降低，同時，峰電位差出現(xiàn)增大（譜線b）.而當HMP-C60修飾電極表面吸附Zr4+后，［Fe（CN）6］3-/4-的氧化還原峰較HMP-C60修飾電極明顯增大（譜線c），這可歸因于Zr4+在電極表面的吸附增強了導(dǎo)電性，同時其正電荷屬性有利于在電極表面吸附更多的電活性［Fe（CN）6］3-/4-.基于Zr4+對磷酸基團具有很強的配位作用［18］，以Zr4+為交聯(lián)試劑實現(xiàn)了HMP-C60修飾電極對探針DNA 的固定.表征結(jié)果證實，當探針DNA（S1）通過磷酸基團與Zr4+的配位作用組裝到Zr/HMP-C60/GCE 表面后，由于負電荷DNA 磷酸骨架對［Fe（CN）6］3-/4-的靜電排斥作用［19］，峰電流進一步降低（譜線d）.該結(jié)果也證實，Zr/HMP-C60復(fù)合材料能有效用于DNA的固定，實現(xiàn)電化學(xué)DNA傳感界面的制備.需要指出的是，DNA作為一種含有磷酸根和磷酸二酯鍵骨架的生物分子，其鏈末端的磷酸根和磷酸骨架都有與Zr4+結(jié)合的可能.Wang等［20］的實驗結(jié)果表明，因為鏈末端的磷酸基團較磷酸骨架磷酸二酯鍵具有更好的自由度，且在鍵合過程中具有更小的空間位阻，因此會優(yōu)先與配位不飽和的Zr4+發(fā)生配位鍵合作用.因此，我們推測本實驗中探針DNA通過鏈末端的磷酸基團與橋聯(lián)Zr4+發(fā)生結(jié)合，從而實現(xiàn)探針鏈的固定.該結(jié)合模式保證了探針鏈的柔韌性，能顯著提高目標鏈檢測過程中的雜交有效性.

Fig.2 CV(A)and EIS(B)responses of different modified electrodes in 1.0 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-

EIS 法是一種有效的電化學(xué)界面性能表征手段.為進一步考察傳感器的逐步構(gòu)建過程，以1.0 mmol/L［Fe（CN）6］3-/4（-含有0.1 mol/L KCl）為探針采用EIS 法對傳感器的制備進行了表征，結(jié)果如圖2（B）所示.可見，裸電極在高頻區(qū)只有很小的半徑，對應(yīng)的電阻值僅為265 Ω，表明打磨后的裸電極具有良好的導(dǎo)電性.而HMP-C60修飾電極表面的Nyquist曲線在高頻區(qū)出現(xiàn)1個明顯的半圓，對應(yīng)的阻抗值為12 kΩ，說明HMP-C60修飾層增大了［Fe（CN）6］3-/4-在電極表面的電子轉(zhuǎn)移阻力.當HM-C60修飾電極吸附Zr4+后，阻抗值減小至4.9 kΩ，進一步表明Zr4+對［Fe（CN）6］3-/4-的電子轉(zhuǎn)移促進作用.而當電極表面組裝上探針DNA，高頻區(qū)半徑再次增大，阻抗值變?yōu)?7.9 kΩ，表明探針DNA 在電極表面發(fā)生了有效吸附.

2.3 傳感器的雜交性能

將制備的傳感器S1/Zr/HMP-C60/GCE與不同濃度的目標序列和不同序列DNA片段雜交，并進行阻抗測試，考察了傳感器的雜交特異性和靈敏度.圖3（A）為HMP-C60基傳感器與不同濃度的CaMV35S特征序列（S2）雜交后在［Fe（CN）6］3-/4-溶液中測試所得EIS 曲線.可見，隨著S2濃度不斷增大，電極表面形成的雙鏈DNA量也相應(yīng)增加，因此對負電荷［Fe（CN）6］3-/4-探針分子的排斥作用逐漸增強，從而使電極表面的電子轉(zhuǎn)移電阻值Ret逐漸變大.將雜交前后Ret的差值（ΔRet）與互補鏈S2 濃度對數(shù)值（lgcS2）作圖，發(fā)現(xiàn)ΔRet與lgcS2在1.0×10-13～1.0×10-9mol/L 濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為ΔRet/104Ω=0.7958lgcS2＋12.546，相關(guān)系數(shù)r=0.9988.按照3倍信噪比原則（S/N=3），計算得出該傳感器的檢出限為4.0×10-14mol/L.表1列出了該傳感器與文獻［21～24］報道的其它碳納米材料基DNA電化學(xué)傳感器性能數(shù)據(jù)，通過對比發(fā)現(xiàn)，本文制備的傳感器顯示出更寬的靈敏度和更低的檢出限，這可歸因于高比表面積的HMP-C60納米簇材料負載了更多的DNA探針及Zr4+作為橋聯(lián)離子對探針DNA的強吸附作用.

Fig.3 Nyquist plots of S1/Zr/HMP-C60/GCE hybridized with different concentrations of S2(A)and the linear relationship between ΔRetand lgcS2(B)

Table 1 Comparison of analytical performance of carbon materials-based nuclei acid biosensors

為考察該傳感器的選擇性，將傳感器分別與1.0×10-12mol/L的不同DNA序列進行雜交反應(yīng)后，在［Fe（CN）6］3-/4-溶液中進行阻抗檢測.結(jié)果表明，當探針電極與完全非互補序列S4雜交后，所得Nyquist曲線上的高頻區(qū)半圓直徑（圖4譜線b）與探針電極（圖4譜線a）接近，表明非互補序列S4與探針DNA沒有發(fā)生雜交反應(yīng)，也未在電極表面發(fā)生非特異性吸附.而當傳感器與互補序列S2雜交后，形成剛性雙螺旋結(jié)構(gòu)，傳感器表面形成負電荷雙鏈DNA膜，最大程度抑制了［Fe（CN）6］3-/4-的電化學(xué)行為，導(dǎo)致電化學(xué)阻抗顯著增大（圖4 譜線c）.另外，當S1/Zr/HMP-C60/GCE 與單堿基錯配序列S3 和三堿基錯配序列S4 雜交后，所得阻抗值介于完全錯配序列和互補序列之間，表明S1 與錯配序列雜交時，無法形成完整的雙螺旋結(jié)構(gòu)；同時，隨著錯配堿基數(shù)目增加，阻抗增大.由此可見，該DNA 傳感器可以有效地區(qū)別不同的序列，表現(xiàn)出良好的雜交特異性.

Fig.4 EIS responses of S1/Zr/HMP-C60/GCE hybridized with different DNA sequences

2.4 再生性和穩(wěn)定性

采用水浴熱解法對傳感器S1/Zr/HMP-C60/GCE的再生性能進行了研究.實驗結(jié)果表明，將與互補鏈雜交后的傳感器在80 ℃水浴中熱解10 min，然后迅速置于0 ℃冰水浴中5 min，如此重復(fù)熱解-冷卻2次后，即可實現(xiàn)傳感器再生.對再生前后的電極進行電化學(xué)阻抗測試，結(jié)果顯示再生后探針電極的Ret值及其與目標序列雜交后的ΔRet值與初始電極測得的數(shù)據(jù)（Ret和ΔRet值）相比，未發(fā)生明顯變化［圖5（A）］，表明本文構(gòu)建的DNA傳感器有較好的再生性能.在穩(wěn)定性實驗中，將制備的DNA電化學(xué)傳感器置于4 °C 環(huán)境下保存，每隔48 h 進行阻抗測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)14 d 后其阻抗值未出現(xiàn)顯著變化［圖5（B）］，說明該DNA傳感器具有良好的穩(wěn)定性.

Fig.5 Reproducibility(A)and stability(B)of the biosensor

3 結(jié) 論

通過1，3-偶極［3＋2］環(huán)加成反應(yīng)，合成了2-（2-羥基-3-甲氧基苯基）-C60吡咯烷衍生物.在Zr4+與HMP-C60上的—OH，—NH—及與探針DNA 5′-的配位作用下，制備了一種新型的基于C60吡咯烷衍生物（HMP-C60）的電化學(xué)DNA 傳感器.實驗結(jié)果表明，該電化學(xué)生物傳感器具有良好的選擇性、穩(wěn)定性及再生性.將該傳感器應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品特異性片段（CaMV35S）的檢測，線性范圍為1.0×10-13～1.0×10-9mol/L，檢出限達到4.0×10-14mol/L.實驗結(jié)果表明，合成的HMP-C60為構(gòu)建新一代高性能電化學(xué)傳感器用于CaMV35S檢測提供了新的途徑.