固相萃取-原子熒光光譜法測(cè)定大米中無機(jī)硒的含量

張 穎,黃文耀,唐 琳,孔 芳,華俊輝

(湖北省疾病預(yù)防控制中心,應(yīng)用毒理湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430079)

硒是機(jī)體必需的微量元素,但適宜劑量范圍很窄,其生物效應(yīng)和毒性與硒的形態(tài)密切相關(guān)[1-4]。在硒的各種形態(tài)中,無機(jī)硒的毒性較大,吸收和利用不理想,過量會(huì)對(duì)人體造成傷害[5-7]。無機(jī)硒的存在形態(tài)主要為可溶于水的硒酸根和亞硒酸根,有機(jī)硒的存在形態(tài)主要為硒蛋白和硒代氨基酸,普遍認(rèn)為,谷物中硒主要以硒代蛋氨酸形式(包括游離的和結(jié)合蛋白的)存在[8-10],其中部分小分子硒代氨基酸也溶于水,因此測(cè)定無機(jī)硒的含量時(shí)需要排除水溶性有機(jī)硒的干擾。

目前硒形態(tài)的測(cè)定方法主要為原子熒光光譜法和儀器聯(lián)用法(包括高效液相色譜-原子熒光聯(lián)用法[11-12]和高效液相色譜-電感耦合等離子體聯(lián)用法[13-16])。儀器聯(lián)用法可測(cè)得硒的各種形態(tài)的含量,但儀器價(jià)格昂貴,對(duì)操作技術(shù)要求較高,不適宜普遍推廣應(yīng)用。原子熒光光譜法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、成本低廉、通用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),但需要一種有效的無機(jī)硒的提取分離方式。現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道中,多采用較高濃度的鹽酸溶液直接提取無機(jī)硒[17-20]或水溶液提取后用有機(jī)溶劑萃取有機(jī)硒而得到無機(jī)硒的提取方式[21-23],上述方式均可能造成有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化或不能完全分離有機(jī)硒,使無機(jī)硒的測(cè)定結(jié)果偏高。本工作采用固相萃取的前處理方式,特異性吸附硒酸根和亞硒酸根,去除大米中有機(jī)硒和樣品基底的干擾,以達(dá)到分離富集無機(jī)硒的目的,再采用原子熒光光譜法測(cè)定無機(jī)硒的含量。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

AFS-9700型雙道原子熒光光度計(jì);DB-2EFS型智能石墨電熱板;DTC-33 型超聲波清洗器;Z383K 型低溫高速離心機(jī);THZ-82型恒溫振蕩器;Milli-Q Advantage A10 型超純水儀;SAX 強(qiáng)陰離子交換柱(1 000 mg/6 mL)。

硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:1 000 mg·L-1。

硒標(biāo)準(zhǔn)溶液:1 mg·L-1,移取適量硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,用5%(體積分?jǐn)?shù),下同)鹽酸溶液稀釋。

硒標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:分別移取1 mg·L-1的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL,加入100 g·L-1鐵氰化鉀溶液10 mL,用5%鹽酸溶液定容至100 mL,配制成0,2.00,4.00,6.00,8.00,10.0μg·L-1的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

富硒大米樣品購(gòu)自湖北省恩施地區(qū),標(biāo)注有“富硒”字樣;普通大米樣品購(gòu)自武漢某超市。

硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸的純度均為98%;硝酸、鹽酸、高氯酸、氫氧化鈉、硼氫化鉀均為優(yōu)級(jí)純;鐵氰化鉀為分析純;試驗(yàn)用水由Milli-Q Advantage A10型超純水儀制得(電阻率大于18.2 MΩ·cm)。

1.2 儀器工作條件

光電倍增管負(fù)高壓300 V;硒空心陰極燈,燈電流80 m A;爐高8 mm;載氣為氬氣,流量400 mL·min-1;屏蔽氣為氬氣,流量1 000 mL·min-1;延遲時(shí)間1 s;讀數(shù)方式峰面積,讀數(shù)時(shí)間15 s;進(jìn)樣體積2 mL。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取經(jīng)烘干粉粹過篩的大米粉0.5 g,置于50 mL塑料離心管中,加入20 mL 水,超聲10 min后,于90 ℃水浴振蕩提取60 min,其間每隔10 min取出,上下顛倒,使樣品充分混勻,水浴結(jié)束后,再超聲提取20 min[10,19]。冷卻,以轉(zhuǎn)速8 000 r·min-1離心15 min,取上層清液,用5 g·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)至pH 4～7,過濾,移取濾液10 mL 作為提取液。SAX 強(qiáng)陰離子交換柱經(jīng)3 mol·L-1鹽酸溶液10 mL 活化、水20 mL 平衡。將提取液移入交換柱,流出速率小于3 mL·min-1,再用3 mol·L-1鹽酸溶液10 mL洗脫吸附在柱上的無機(jī)硒(洗脫速率1 mL·min-1),收集洗脫液。將洗脫液轉(zhuǎn)移至錐形瓶,按GB 5009.93-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中硒的測(cè)定》[24]第一法中前處理方法進(jìn)行濕法消解,再采用第一法氫化物原子熒光光譜法測(cè)定樣品中總硒含量,按1.2節(jié)儀器工作條件測(cè)定樣品中無機(jī)硒的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取劑的選擇

硒形態(tài)的提取方式通常有水提取法、酸提取法、堿提取法和酶提取法[10-11],酶提取法將硒蛋白酶解為硒代氨基酸[25],主要目標(biāo)化合物為硒蛋白。無機(jī)硒的提取劑通常為水、酸或堿試劑,本試驗(yàn)在前期研究工作的基礎(chǔ)上[10,25],采用水提取大米中的無機(jī)硒。

2.2 提取液酸度的選擇

固相萃取柱選用SAX 強(qiáng)陰離子交換柱,需經(jīng)3 mol·L-1鹽酸溶液10 mL 活化、水20 mL 平衡。試驗(yàn)考察了提取液的不同酸度(pH 3～10)對(duì)無機(jī)硒(硒酸根和亞硒酸根)加標(biāo)水溶液和有機(jī)硒(小分子硒代氨基酸,包括硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸)在SAX強(qiáng)陰離子交換柱上的保留情況,按試驗(yàn)方法測(cè)定相應(yīng)的洗脫液中硒含量并計(jì)算回收率,結(jié)果見圖1。

圖1 提取液的不同酸度對(duì)固相萃取柱吸附無機(jī)硒和硒代氨基酸的影響Fig.1 Effect of different acidity of extract solution on adsorption of inorganic selenium and selenium amino acids by solid phase extraction column

由圖1可知:當(dāng)提取液的pH 為4～10時(shí),無機(jī)硒的回收率基本保持不變;當(dāng)pH 大于7時(shí),硒代氨基酸的回收率逐漸增大。表明pH 為4～7時(shí),無機(jī)硒的分離效果較好。為排除硒代氨基酸的影響,試驗(yàn)選擇提取液的pH 為4～7。

2.3 洗脫液體積的選擇

試驗(yàn)分別收集10,20,30,40,50 mL 的洗脫液,按試驗(yàn)方法測(cè)定硒含量并計(jì)算回收率。結(jié)果表明:不同體積洗脫液的回收率分別為93.7%,94.1%,94.1%,94.0%,93.9%,說明洗脫液體 積 為10 mL時(shí)即可獲得良好的回收率,無需進(jìn)一步增大洗脫液體積。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

按儀器工作條件對(duì)0,2.00,4.00,6.00,8.00,10.0μg·L-1的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定,以硒的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示:標(biāo)準(zhǔn)曲線在10.0μg·L-1以內(nèi)呈線性關(guān)系,線性回歸方程為y＝138.9x＋90.07,相關(guān)系數(shù)為0.999 9。

按試驗(yàn)方法連續(xù)測(cè)定空白樣品11次,測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差(s)為0.021μg·L-1,以樣品稱樣量為0.5 g,定容體積為10 mL 計(jì),換算為0.84μg·kg-1。以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算方法的檢出限(3s),所得結(jié)果為2.52μg·kg-1,以10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算方法的測(cè)定下限(10s),所得結(jié)果為8.40μg·kg-1。

2.5 精密度和回收試驗(yàn)

取普通大米(無機(jī)硒含量較低)樣品,按1.3節(jié)試驗(yàn)方法測(cè)定其總硒和無機(jī)硒的含量。然后根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》附錄F[26]的規(guī)定,在上述樣品中加入3個(gè)濃度水平的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液,將大米粉充分振蕩混勻,放置24 h后,按試驗(yàn)方法測(cè)定,每個(gè)樣品平行測(cè)定6次,計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表1。

由表1 可知:無機(jī)硒的回收率為90.3%～98.2%,測(cè)定值的RSD 為9.9%～19%,符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404-2008[26]規(guī)定的不同水平的實(shí)驗(yàn)室精密度要求。

表1 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.1 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.6 樣品分析

按照1.3節(jié)試驗(yàn)方法測(cè)定富硒大米和普通大米樣品中的總硒和無機(jī)硒含量,有機(jī)硒含量采用總硒含量與無機(jī)硒含量的差值計(jì)算可得,并計(jì)算無機(jī)硒和有機(jī)硒分別在總硒中的占比,結(jié)果見表2。

表2 樣品分析結(jié)果Tab.2 Analytical results of samples

由表2可知:大米樣品中無機(jī)硒占比為1.3%～9.7%,說明在沒有人工非法添加無機(jī)硒的情況下,天然大米中無機(jī)硒的含量較低,主要存在形式為有機(jī)硒。

本工作采用固相萃取的前處理方式,在弱酸性范圍內(nèi),采用SAX 強(qiáng)陰離子交換柱吸附硒酸根和亞硒酸根,去除有機(jī)硒小分子和樣品基體的干擾,避免前處理過程中因有機(jī)硒小分子轉(zhuǎn)化而造成的無機(jī)硒測(cè)定結(jié)果偏高。為防止固相萃取柱的過載,建議選用容量較大的固相萃取柱。該方法的檢出限為2.52μg·kg-1,與GB 5009.93-2017 第一法氫化物原子熒光光譜法測(cè)定食品中的總硒的方法檢出限(2μg·kg-1)相當(dāng)[24],靈敏度高,不僅可以測(cè)定富硒大米中的無機(jī)硒,對(duì)普通大米中無機(jī)硒的測(cè)定同樣適用,方法的適用范圍廣。