在線固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定尿液中芬太尼及其代謝物的含量

趙清佳,汪 蓉,徐智儒,盛振海,梁 晨,張玉榮?

(1.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院 創(chuàng)新藥物與制藥工藝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200040;2.上海市公安局物證鑒定中心,上海市現(xiàn)場(chǎng)物證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200083)

芬太尼是強(qiáng)效的μ-阿片受體激動(dòng)劑,其鎮(zhèn)痛作用是嗎啡的80倍,15 min起效,維持2 h,可產(chǎn)生欣快、呼吸抑制,大劑量產(chǎn)生肌肉僵直,用于各種原因引起的疼痛,但長(zhǎng)期使用具有成癮性。芬太尼的消除半衰期(t1/2)較短,以10μg·kg-1的劑量給藥時(shí),大鼠血液中的t1/2為3.72 h[1]。體內(nèi)吸收后,尿液中芬太尼的原體或代謝物的濃度通常高于血液中的濃度,因此通過(guò)檢測(cè)尿液中的原體或代謝物來(lái)判斷吸食者的吸毒史,具有更高的參考價(jià)值,但目前對(duì)芬太尼代謝物檢測(cè)時(shí)限的報(bào)道相對(duì)較少。

芬太尼主要在肝臟中被CYP450酶迅速代謝,去甲芬太尼為其主要的代謝物[2-3]。目前,生物檢材中芬太尼的檢測(cè)方法有均相免疫測(cè)定法[4-5]、氣相色譜-質(zhì)譜法[6-7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-10]等。由于生物檢材基質(zhì)復(fù)雜,常常存在內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾,為了延長(zhǎng)色譜柱和儀器的使用壽命,提高目標(biāo)物的檢出限,在分析樣品之前需要前處理。樣品前處理常用的方法有液液萃取法(LLE)[10]、固相萃取法(SPE)[11]和蛋白質(zhì)沉淀法(PP)[12]等。其中LLE和PP均存在耗時(shí)長(zhǎng)、溶劑需求量大、污染環(huán)境等缺點(diǎn),PP還會(huì)對(duì)色譜柱造成一定程度的損壞。而對(duì)于SPE研究顯示[13],提供同樣良好的檢出限、準(zhǔn)確度和精密度的情況下,離線SPE 需要手動(dòng)活化、緩沖和淋洗等步驟,過(guò)程復(fù)雜。

本工作旨在開(kāi)發(fā)一種在線固相萃取(on-line SPE)的前處理方法對(duì)尿液中的芬太尼和去甲芬太尼進(jìn)行富集凈化,建立一種前處理與檢測(cè)全自動(dòng)化的方法,同時(shí)將該方法用于研究芬太尼原體及其代謝物去甲芬太尼在大鼠體內(nèi)的檢測(cè)時(shí)限。該方法溶劑消耗少,人力需求低,且操作簡(jiǎn)便易行,可滿足公安及司法部門對(duì)該物質(zhì)監(jiān)控的需求。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Thermo UltiMate 3000 型雙三元超高效液相色譜系統(tǒng);TSQ Altis型三重四極桿質(zhì)譜儀,配電噴霧離子源(ESI);Eppendorf AG 型離心機(jī);Talboys型數(shù)顯型漩渦混合器;BRANSON B3500S-MT 型超聲波清洗器。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:稱取芬太尼和去甲芬太尼的對(duì)照品粉末10 mg,用甲醇溶解并稀釋,分別定容至10 mL容量瓶中,配制成質(zhì)量濃度均為1.00 g·L-1的芬太尼標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和去甲芬太尼標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:移取芬太尼和去甲芬太尼的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適量,用甲醇逐級(jí)稀釋,分別配制成質(zhì)量濃度為1 mg·L-1、10μg·L-1和100 ng·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:移取一定質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量,用甲醇逐級(jí)稀釋,配制成質(zhì)量濃度為20 ng·L-1、1,2,4,6,8μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

2-(3-甲氧基苯基)-2-(乙基氨基)環(huán)己酮鹽酸鹽-d3(MXE-d3)內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液:稱取MXE-d3對(duì)照品粉末10 mg,用甲醇溶解,轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中,用甲醇定容,配制成質(zhì)量濃度為1.00 g·L-1的MXE-d3內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液。

MXE-d3內(nèi)標(biāo)溶液:用甲醇稀釋MXE-d3內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備 溶 液,配制成 質(zhì) 量 濃度為10 μg·L-1的MXE-d3內(nèi)標(biāo)溶液。

甲酸銨溶液:2 mmol·L-1,分別以甲酸和氨水調(diào)節(jié)p H,配制pH 4.2,7.0,9.2的2 mmol·L-1的甲酸銨溶液。

所有溶液在使用前均保存在4 ℃的冰箱中。

芬太尼、去甲芬太尼對(duì)照品的純度大于99%;MXE-d3對(duì)照品的純度大于99.5%;甲醇、甲酸和甲酸銨均為色譜純;氨水為分析純;超純水由Purelab Ultra超純水機(jī)制備。

1.2 儀器工作條件

1)在線固相萃取條件 Waters Oasis HLB固相萃取小柱(20 mm×2.1 mm,25μm);柱溫20℃;進(jìn)樣量50μL;流量0.4 mL·min-1;前處理泵的流動(dòng)相A 為甲醇,B為水(甲醇和水用來(lái)活化、平衡固相萃取小柱),C 為pH 9.2的2 mmol·L-1甲酸銨溶液(作為淋洗液)。梯度淋洗程序見(jiàn)表1。

表1 前處理泵的梯度淋洗程序Tab.1 Gradient elution program for pre-process pump

2)色譜條件[14]Thermo Fisher Hypersil GOLD C18分析柱(100 mm×2.1 mm,1.9μm);柱溫50 ℃;進(jìn)樣量50μL;流量0.4 mL·min-1;分析泵的流動(dòng)相D 為含2 mmol·L-1甲酸銨和0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸的水溶液;F 為含2 mmol·L-1甲酸銨和0.1%甲酸的甲醇溶液。梯度洗脫程序:0～4.00 min時(shí),D 為90%;4.00～6.00 min時(shí),D 由90% 降 至65%,保 留4.00 min;10.00～12.00 min時(shí),D 由65% 降 至35%;12.00～12.50 min時(shí),D 由35%升至90%,保留2.50 min。

3)質(zhì)譜條件[14]ESI,正離子模式,選擇離子監(jiān)測(cè)(SRM)模式;離子傳輸管溫度325 ℃,霧化器溫度325 ℃;鞘氣流量12 L·min-1,輔助氣流量8 L·min-1。表2 列出了目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)。

表2 質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 MS parameters

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備和在線固相萃取

移取尿液樣品200μL 至2.0 mL 離心管中,添加10μg·L-1MXE-d3內(nèi)標(biāo)溶液4μL,混勻,加入pH 9.2的2 mmol·L-1甲酸銨溶液200μL稀釋,渦旋30 s后,以轉(zhuǎn)速13 000 r·min-1離心10 min。移取上清液200μL置于進(jìn)樣小瓶中,單次上樣50μL。

移取空白尿樣180μL 至2.0 mL 離心管中,分別添加20μL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,配制成加標(biāo)樣品,其余步驟同上。

將上述制備的樣品加至固相萃取小柱上,前處理泵和分析泵同時(shí)開(kāi)啟工作。0～2 min時(shí),六通閥切換至6-1,用前處理泵的流動(dòng)相洗脫固相萃取小柱,此時(shí)目標(biāo)物被選擇性地保留和純化;2～4 min時(shí),六通閥切換至2-1,此時(shí)分析泵與在線固相萃取小柱成串聯(lián)模式,以分析泵的初始流動(dòng)相將目標(biāo)物從固相萃取小柱洗脫至分析柱上;4 min開(kāi)始,再次將六通閥切換至6-1,用前處理泵清洗、再生固相萃取小柱,用分析泵分離目標(biāo)物。整個(gè)程序由Xcalibular軟件控制自動(dòng)完成。在線固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)的流路圖見(jiàn)圖1。

圖1 在線固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的流路圖Fig.1 Diagram of on-line SPE combined with UHPLC-MS/MS

1.3.2 動(dòng)物試驗(yàn)

試驗(yàn)動(dòng)物:Sprague Dawley(SD)大鼠,雄性,質(zhì)量200～230 g。

藥液配制:移取1.00 g·L-1的芬太尼標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液40μL至15 mL 的微量離心管(EP 管)中,加0.9%氯化鈉溶液至10 mL,配制成4 mg·L-1的溶液。

給藥方法:SD 大鼠3 只,分別以20μg·kg-1的給藥劑量尾靜脈注射給藥。

樣本收集:給藥后,分別于0,2,4,24,48,72,96,120,144,168,192,216,240,264,288,312,336,360,384,408,432,456,480,504,528,552,576,600,624,648,672 h收集尿液樣本,編號(hào),置于-40 ℃的冰箱冷凍保存。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理泵的淋洗液及淋洗時(shí)間的選擇

由于目標(biāo)物是堿性化合物,為了抑制離子化效應(yīng),同時(shí)減少淋洗過(guò)程中目標(biāo)物的流失,試驗(yàn)分別以pH 7.0的2,5,10 mmol·L-1的甲酸銨溶液和pH 9.2的2,5,10 mmol·L-1的甲酸銨溶液為淋洗液清洗基質(zhì)中極性較強(qiáng)的雜質(zhì)。芬太尼和去甲芬太尼在采用不同淋洗液時(shí)的響應(yīng)值見(jiàn)圖2。

圖2 目標(biāo)物在采用不同淋洗液時(shí)的響應(yīng)值Fig.2 Response values of the target compounds by using different eluants

結(jié)果表明:固相萃取小柱在6種淋洗液條件下均能很好地萃取到目標(biāo)物。但以pH 9.2 的2 mmol·L-1甲酸銨溶液為淋洗液時(shí),目標(biāo)物具有更優(yōu)的峰形和更高的響應(yīng)值,5μg·L-1的尿液加標(biāo)樣品中,芬太尼和去甲芬太尼的響應(yīng)值分別為5.88×106和5.08×106。因 此,選 擇pH 9.2 的2 mmol·L-1甲酸銨溶液作為淋洗液。

將通過(guò)在線固相萃取小柱后的廢液直接連接至質(zhì)譜檢測(cè)器,發(fā)現(xiàn)采用該淋洗液進(jìn)行淋洗,5 min內(nèi)色譜圖無(wú)目標(biāo)物出峰,說(shuō)明無(wú)目標(biāo)物的流失。設(shè)置為全掃描模式,發(fā)現(xiàn)在2 min前有雜質(zhì)出峰,2 min后無(wú)其他雜峰出現(xiàn),表明該淋洗液在2 min內(nèi)足以將基質(zhì)中的雜質(zhì)清洗干凈,因此將淋洗時(shí)間設(shè)置為2 min。

2.2 洗脫程序的選擇

為了快速將目標(biāo)物轉(zhuǎn)移至分析柱,減少譜帶的展寬,試驗(yàn)采用反沖的方式將目標(biāo)物轉(zhuǎn)移至分析柱。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),分析流路的初始流動(dòng)相即可將所有目標(biāo)物洗脫至分析柱。將流路中的分析柱拆去,用兩通替代,色譜出峰時(shí)間在3.6 min內(nèi),據(jù)此可以確定閥切換的時(shí)間應(yīng)該略晚,因此將閥切換時(shí)間設(shè)置在4 min時(shí)切換固相萃取小柱,確保目標(biāo)物全部進(jìn)入分析流路。然后以分析泵的流動(dòng)相對(duì)分析柱上的目標(biāo)物進(jìn)行梯度洗脫,同時(shí)前處理泵對(duì)在線固相萃取小柱進(jìn)行清洗再生、活化和平衡,二者互不干擾,縮短了分析時(shí)間。通過(guò)上述色譜條件與閥切換時(shí)間的優(yōu)化后,目標(biāo)物可獲得較好的分離效果。

2.3 樣品稀釋液的酸度的影響

正常新鮮尿液的pH 為4.5～7.9,而試驗(yàn)中的目標(biāo)物為堿性物質(zhì),因此有必要考察樣品稀釋液的酸度對(duì)目標(biāo)物測(cè)定的影響。試驗(yàn)分別采用pH 為4.2(酸性),7.0(中性),9.2(堿性)的2 mmol·L-1甲酸銨溶液作為樣品稀釋液,考察了其萃取效果的影響。芬太尼和去甲芬太尼在不同酸度的樣品稀釋液下的響應(yīng)值見(jiàn)圖3。

圖3 目標(biāo)物在不同酸度的樣品稀釋液下的響應(yīng)值Fig.3 Response values of the target compounds in dilute solutions at different acidity

結(jié)果表明:SPE色譜柱在不同酸度的樣品稀釋液下均能很好地萃取到芬太尼和去甲芬太尼。相比之下,使用堿性樣品稀釋液時(shí),目標(biāo)物解離減少,更多的保留在固相萃取小柱上,因而具有更高的響應(yīng)值。因此,選擇pH 9.2的2 mmol·L-1甲酸銨溶液作為樣品稀釋液。

2.4 方法的專屬性

收集6份來(lái)自不同健康志愿者的空白尿液樣本,并按試驗(yàn)方法進(jìn)行處理分析,檢測(cè)背景響應(yīng),結(jié)果顯示空白樣品中目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)物均無(wú)干擾。芬太尼、去甲芬太尼和內(nèi)標(biāo)MXE-d3的保留時(shí)間分別為9.94,7.79,8.02 min,400 ng·L-1的質(zhì)控樣品及200ng·L-1的MXE-d3內(nèi)標(biāo)溶液的色譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)物的色譜圖Fig.4 Chromatograms of the target compounds and internal standard

儀器通過(guò)高含量樣品后進(jìn)空白樣品來(lái)估計(jì)色譜柱的殘留情況。結(jié)果表明,通過(guò)高含量樣品后,芬太尼不存在殘留;去甲芬太尼有少量殘留但通過(guò)1針空白樣品清洗后可以消除。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)、標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

由于在線前處理的系統(tǒng)設(shè)計(jì)不能直接得到固相萃取后目標(biāo)物的回收率[13,15],按照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版中在線前處理樣品的基質(zhì)效應(yīng)的考察方法,本試驗(yàn)收集6批不同健康志愿者的空白尿液,分別添加低、高濃度水平的芬太尼和去甲芬太尼,制得基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按試驗(yàn)方法進(jìn)行預(yù)處理和進(jìn)樣分析,考察目標(biāo)物的響應(yīng)的總變異系數(shù)。總變異系數(shù)＝標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值×100%,若總變異系數(shù)不大于15%,說(shuō)明基質(zhì)無(wú)干擾。結(jié)果顯示:6批樣品中,芬太尼的響應(yīng)的總變異系數(shù)不大于2.5%,去甲芬太尼響應(yīng)的總變異系數(shù)不大于7.1%,均符合要求,說(shuō)明基質(zhì)對(duì)樣品測(cè)定無(wú)影響。

配制芬太尼和去甲芬太尼的質(zhì)量濃度分別為2.00,100,200,400,600,800 ng·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,按照試驗(yàn)方法進(jìn)樣分析。以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,其線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。

表3 線性參數(shù)Tab.3 Linearity parameters

檢出限定義為信噪比(S/N)不小于3的最低目標(biāo)物的質(zhì)量濃度,測(cè)定下限定義為信噪比不小于10的最低目標(biāo)物的質(zhì)量濃度。結(jié)果顯示,在優(yōu)化的色譜條件下,芬太尼和去甲芬太尼的檢出限(3S/N)均為0.200 ng·L-1,測(cè)定下限(10S/N)均為2.00 ng·L-1。該方法的檢出限高于文獻(xiàn)[16]報(bào)道的芬太尼的最高檢出限(0.003μg·L-1)。

2.6 精密度和回收試驗(yàn)

分別將測(cè)定下限、低、中、高等4個(gè)濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行預(yù)處理和進(jìn)樣分析。當(dāng)天制備樣品,每個(gè)濃度水平平行測(cè)定5次,計(jì)算得到回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),考察日內(nèi)精密度。連續(xù)3 d同一時(shí)間測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,計(jì)算得到回收率和測(cè)定值的RSD,考察日間精密度(《中華人民共和國(guó)藥典》2015 年版僅監(jiān)測(cè)2 d),所得結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知:測(cè)定值的RSD 均小于15%,說(shuō)明方法的精密度較好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)和稀釋效應(yīng)

按試驗(yàn)方法測(cè)定低、高濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)濃度水平平行測(cè)定3次來(lái)評(píng)估樣品的穩(wěn)定性。由于SD 大鼠體內(nèi)代謝后目標(biāo)物的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)線性范圍,因此分別設(shè)定稀釋因子1 為稀釋2 000倍、稀釋因子2為稀釋200倍和稀釋因子3為稀釋20倍,每組平行測(cè)定5次,來(lái)考察方法的稀釋可靠性。結(jié)果表明,芬太尼和去甲芬太尼的短期穩(wěn)定性(室溫放置4 h)、預(yù)處理后自動(dòng)進(jìn)樣盤中的穩(wěn)定性(放置24 h)、凍融穩(wěn)定性(每隔24 h,室溫解凍20 min,再放入-40 ℃冷凍保存,循環(huán)3次)、長(zhǎng)期穩(wěn)定性(-40 ℃冷凍保存10 d)的測(cè)定值的RSD 均小于14%,稀釋可靠性的測(cè)定值的RSD 均小于3%。說(shuō)明在考察的稀釋倍數(shù)范圍內(nèi),其基質(zhì)不影響結(jié)果的精密度,稀釋具有可靠性。

2.8 SD大鼠尿液中芬太尼原體和代謝物去甲芬太尼的檢測(cè)時(shí)限

芬太尼原體在SD 大鼠體內(nèi)2 h時(shí)達(dá)到最高,最高量 為112.66 μg·L-1,24h時(shí)迅速下降至2.58μg·L-1,芬太尼原體在1號(hào)和2號(hào)SD 大鼠體內(nèi)的檢測(cè)時(shí)限為5 d,第6 d陰性;在3號(hào)SD 大鼠體內(nèi)的檢測(cè)時(shí)限為7 d,第8 d陰性。代謝物去甲芬太尼在SD 大鼠體內(nèi)4 h 時(shí)達(dá)到最高,最高量為1.6 mg·L-1,之后迅速下降,緩慢消除,去甲芬太尼在1號(hào)SD 大鼠檢測(cè)時(shí)限為26 d,第27 d陰性,在2號(hào)SD 大鼠的檢測(cè)時(shí)限為25 d,第26 d陰性,在3號(hào)SD 大鼠內(nèi)的檢測(cè)時(shí)限為28 d,第29 d陰性。結(jié)果表明,去甲芬太尼在體內(nèi)的消除期緩慢且較長(zhǎng),檢測(cè)時(shí)限遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了芬太尼原體,對(duì)于吸入更大劑量芬太尼的吸食者來(lái)說(shuō),可能會(huì)需要更長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間。

相對(duì)于已報(bào)道的文獻(xiàn)[16-17],本方法具有更高的靈敏度,因此芬太尼原體的檢測(cè)時(shí)限由3 d延長(zhǎng)至7 d,去甲芬太尼28 d的檢測(cè)時(shí)限也尚未見(jiàn)過(guò)報(bào)道。SD 大鼠尿液中芬太尼原體和代謝物去甲芬太尼的濃度-時(shí)間曲線如圖5所示。

圖5 大鼠尿液中芬太尼原體和代謝物的濃度-時(shí)間曲線Fig.5 Concentration-time curves of fentanyl prototype and its metabolite in rat urine

本工作通過(guò)建立在線固相萃取的前處理方法,優(yōu)化了程序設(shè)計(jì)、淋洗液、樣品稀釋液的酸度等條件,建立了完整的在線固相萃取技術(shù)結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的分析方法,進(jìn)行了動(dòng)物試驗(yàn)并發(fā)現(xiàn)去甲芬太尼長(zhǎng)達(dá)28 d的檢測(cè)時(shí)限。該方法操作簡(jiǎn)單,自動(dòng)化程度高,分析結(jié)果良好,可為公安及司法部門判斷當(dāng)事人是否吸食芬太尼提供參考。