固相萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛奶中9種N-亞硝胺的含量

李登昆,張 云,趙士權(quán),劉祥萍,李 磊

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京市疾病預(yù)防控制中心,南京 210003;2.南京醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院,南京 211166)

N-亞硝胺是一類含有R1N(-R2)-N＝O 結(jié)構(gòu)的胺化合物,對(duì)哺乳動(dòng)物具有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性[1-4],20世紀(jì)80年代國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)已將N-亞硝胺歸類為有強(qiáng)致癌性的食品污染物。相關(guān)研究表明食品在運(yùn)輸、貯藏、加工處理過程中,食品中的蛋白質(zhì)在內(nèi)源蛋白酶和微生物的共同作用下極易生成胺類物質(zhì),并進(jìn)一步與食品中的亞硝酸鈉等亞硝化劑反應(yīng)生成N-亞硝胺類化合物[5-6]。許多國(guó)家和地區(qū)高度重視食品中N-亞硝胺污染狀況,并制定相關(guān)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)對(duì)食品中的N-亞硝胺含量進(jìn)行控制[7],俄羅斯、烏克蘭規(guī)定肉類、海產(chǎn)品中總N-亞硝胺的安全限量分別為2,3μg·kg-1,冰島規(guī)定肉類、海產(chǎn)品中總N-亞硝胺的安全限量分別為10,7μg·kg-1,我國(guó)GB 2762-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》[8]規(guī)定肉及肉制品(肉類罐頭除外)、水產(chǎn)動(dòng)物及其制品(水產(chǎn)品罐頭除外)中N-二甲基亞硝胺(NDMA)的安全限量分別為3,4μg·kg-1。

對(duì)于富含蛋白的牛奶,國(guó)內(nèi)外鮮有研究報(bào)道N-亞硝胺的含量,也未檢索到相關(guān)牛奶中N-亞硝胺的檢驗(yàn)方法。鑒于此,本工作擬建立一種前處理簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏度高、定量準(zhǔn)確度好的固相萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛奶樣品中9種N-亞硝胺含量的方法,為開展牛奶中多種N-亞硝胺污染現(xiàn)狀調(diào)查,進(jìn)行人群健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供技術(shù)支持,為保障我國(guó)牛奶產(chǎn)品質(zhì)量安全、牛奶產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供技術(shù)支持。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

GCMS-TQ 8040型氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀;ML 203/02型電子分析天平;CNW 12位固相萃取真空裝置;Sorvall Lynx 6000 型高速冷凍落地離心機(jī);JZ-5013型多管旋渦混合儀;UP 500 H 型超聲波振蕩儀;QL-861型旋渦混合器;Milli-Q Reference水純化系統(tǒng);N-EVAP 24 位干浴氮吹儀;Captiva EMR-Lipid固相萃取小柱(300 mg/3 mL);Oasis PRIME HLB固相萃取小柱(200 mg/6 mL);EMRLipid無水硫酸鎂除水鹽包(部件號(hào)5982-0102);SCAA-113親水PTFE針式濾器(13mm×0.45μm);一次性使用無菌注射器(2 mL,帶針)。

N-亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:100 mg·L-1,于-20 ℃冰箱冷凍保存。

N-亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:1.0 mg·L-1,將100 mg·L-1N-亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液從冰箱-20 ℃冷凍層取出置于通風(fēng)櫥內(nèi)恒溫至室溫,用乙腈稀釋配制成1.0 mg·L-1的N-亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

同位素內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:10 mg·L-1,于-20 ℃冰箱冷凍保存。

同位素內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:1.0 mg·L-1,將10 mg·L-1同位素內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液從冰箱-20 ℃冷凍層取出置于通風(fēng)櫥內(nèi)恒溫至室溫,用乙腈稀釋配制成1.0 mg·L-1的同位素內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

NDMA、N-亞硝基甲基乙基胺(NMEA)、N-亞硝基二乙胺(NDEA)、N-亞硝基哌啶(NPIP)、N-亞硝基二苯胺(NDPh A)、N-亞硝基嗎啉(NMor Ph)、N-亞硝基二丙胺(NDPA)、N-亞硝基二丁胺(NDBA)、N-亞硝基吡咯烷(NPYR)、NDMA-d6和NDPA-d14的純度均大于99%;乙腈為色譜純;氯化鈉為分析純;試驗(yàn)用水均由Milli-Q 凈化系統(tǒng)制得,符合GB/T 6682-2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的一級(jí)水。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 VF-WAXms色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25μm);載氣為高純氦氣(純度大于99.999%);流量1.0 mL·min-1(恒流),隔墊吹掃流量3 mL·min-1;進(jìn)樣口溫度250 ℃;進(jìn)樣體積1.0μL,不分流進(jìn)樣。柱升溫程序:初始溫度50 ℃,保持1 min;以10 ℃·min-1速率升溫至110 ℃;再以15℃·min-1速率升溫至200℃;最后以50 ℃·min-1速率升溫至250 ℃,保持10 min。

2)質(zhì)譜條件 電子轟擊離子(EI)源;傳輸線溫度250 ℃;離子源溫度230 ℃;電離能量70 eV;溶劑延遲6 min;前四極桿溫度150 ℃;后四極桿溫度150 ℃;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;碰撞誘導(dǎo)解離(CID)氣為高純氬氣(純度99.99%),CID 氣壓力150 kPa;離子掃描時(shí)間間隔0.1 s。9種N-亞硝胺與2種同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)見表1,其中“?”為定量離子對(duì)。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品萃取

稱取牛奶樣品10.0 g(精確至0.001 g)置于50 mL離心管中,加入62.5μL 同位素內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液并充分振蕩混勻,加入10.0 mL 乙腈,以轉(zhuǎn)速2 000 r·min-1渦旋振蕩2 min,超聲波振蕩萃取10 min,在冷凍離心機(jī)中于4 ℃冷藏5 min,然后以轉(zhuǎn)速10 000 r·min-1離心5 min。轉(zhuǎn)移全部上清液于另一50 mL離心管中,加入10 g氯化鈉,以轉(zhuǎn)速2 000 r·min-1渦旋振蕩2 min,再于4 ℃以轉(zhuǎn)速10 000 r·min-1離心5 min,移取上層有機(jī)相4.0 mL至15 mL離心管中待凈化。

1.3.2 樣品凈化

用體積比4∶1的乙腈-水混合液4.0 mL 在其重力作用下淋洗Captiva EMR-Lipid 固相萃取小柱,淋洗液全部通過后減壓排凈,重復(fù)上述操作步驟2次。上述4.0 mL 萃取液中加入1.0 mL 水,充分渦旋振蕩混勻,全部上樣至淋洗后的固相萃取小柱中并同時(shí)收集凈化液,待萃取液在其自身重力作用下完全從固相萃取小柱洗脫之后,施加真空以排空凈化小柱。

1.3.3 樣品濃縮

在凈化液收集管中加入0.5 g氯化鈉,以轉(zhuǎn)速2 000 r·min-1渦旋振蕩1 min,再于4 ℃以轉(zhuǎn)速10 000 r·min-1離心5 min,轉(zhuǎn)移全部上層有機(jī)相至刻度離心管中,然后于30℃以微流量氮?dú)膺M(jìn)行氮吹濃縮。凈化液濃縮至0.5 mL左右時(shí),加入適量乙腈定容至1.0 mL,再加入適量的無水硫酸鎂除水,經(jīng)親水PTFE針式濾器過濾后按儀器工作條件測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器工作條件的選擇

氣相色譜法分析測(cè)定N-亞硝胺類化合物時(shí)常用強(qiáng)極性色譜柱,筆者在文獻(xiàn)[2]中已進(jìn)行過探討,本試驗(yàn)仍采用VF-WAXms色譜柱作為分析柱。選用質(zhì)量濃度為25μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,結(jié)合GCMS-TQ 8040 軟件的Smart MRM 功能自動(dòng)優(yōu)化目標(biāo)組分的母離子、子離子、碰撞能量及采集時(shí)間等。

9種N-亞硝胺及2種同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)見1.2節(jié),MRM 掃描的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 9種N-亞硝胺及2種同位素內(nèi)標(biāo)的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms of the 9 N-nitrosamines and 2 isotope internal standards

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

2.2.1 蛋白沉淀劑

牛奶樣品基質(zhì)成分復(fù)雜,富含蛋白質(zhì)、脂肪、磷脂及碳水化合物等,會(huì)造成儀器系統(tǒng)污染。為降低基質(zhì)干擾、提高目標(biāo)待測(cè)物的分析測(cè)定靈敏度,牛奶樣品應(yīng)進(jìn)行蛋白沉淀及凈化處理[9-10],常用的蛋白沉淀劑為亞鐵氰化鉀-乙酸鋅、3%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙酸溶液及乙腈等[11]。但文獻(xiàn)[12]認(rèn)為亞鐵氰化鉀-乙酸鋅作為蛋白沉淀劑引入了大量金屬離子,會(huì)干擾試驗(yàn)結(jié)果;文獻(xiàn)[13]通過試驗(yàn)比對(duì)發(fā)現(xiàn)3%乙酸溶液沉淀效果不理想且不利于進(jìn)一步上機(jī)測(cè)定;而文獻(xiàn)[14]采用乙腈沉淀蛋白測(cè)定乳及乳制品中硝酸鹽和亞硝酸鹽,文獻(xiàn)[15]以乙腈作為蛋白沉淀劑與提取劑測(cè)定牛奶中11種真菌毒素殘留量,均獲得良好的加標(biāo)回收率及精密度,同時(shí)文獻(xiàn)[16]發(fā)現(xiàn)牛奶樣品與乙腈體積比為1∶1 時(shí),超聲波振蕩10 min并于4 ℃低溫冷藏沉淀10 min,可以獲得最大程度沉淀效果。

本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),亞鐵氰化鉀-乙酸鋅沉淀法固形物較多,難以分離出足夠量的上清液;3%乙酸溶液沉淀法沉淀劑使用量大,高速離心后上清液過多,不利于進(jìn)一步的除脂除雜操作;乙腈沉淀法不僅能獲得較好的蛋白沉淀效果,在加入過量的氯化鈉后由于鹽析作用,還能進(jìn)一步沉淀乳清蛋白等雜質(zhì)。因此,試驗(yàn)在10.0 g牛奶樣品中加入10.0 mL 乙腈,超聲波振蕩10 min后,在冷凍離心機(jī)中于4℃冷藏5 min,再以轉(zhuǎn)速10 000 r·min-1離心5 min進(jìn)行牛奶蛋白沉淀。

2.2.2 樣品凈化小柱

牛奶樣品中磷脂、脂肪等復(fù)雜成分,不僅會(huì)污染色譜系統(tǒng)、干擾目標(biāo)物的分析測(cè)定,也會(huì)增加維護(hù)成本、降低儀器使用壽命[17]。EMR-Lipid凈化技術(shù)基于體積排阻和疏水相互作用機(jī)制,可高選擇性去除樣品中的脂質(zhì)/基質(zhì)[18],Oasis PRIME HLB可以選擇吸附去除樣品中蛋白質(zhì)、鹽、磷脂等基質(zhì)干擾物而不影響目標(biāo)物的回收率[19],兩款固相萃取柱都適合凈化磷脂/脂質(zhì)含量較高的樣品。按試驗(yàn)方法,分別用Captiva EMR-Lipid 固相萃取小柱與Oasis PRIME HLB固相萃取小柱處理同一牛奶樣品,對(duì)比兩款固相萃取小柱的凈化效果。結(jié)果顯示,采用Oasis PRIME HLB固相萃取小柱凈化,所得MRM掃描總離子流色譜圖背景響應(yīng)值高,干擾痕量N-亞硝胺的測(cè)定結(jié)果,而Captiva EMR-Lipid固相萃取小柱具有更優(yōu)的凈化效果。因此,試驗(yàn)選擇Captiva EMR-Lipid固相萃取小柱作為樣品凈化柱。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

將N-亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙腈逐級(jí)稀釋配制成9種N-亞硝胺質(zhì)量濃度均為2.0,5.0,10.0,25.0,50.0,100,150μg·L-1,同位素內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度均為25μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,按儀器條件測(cè)定。以定量離子峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為縱坐標(biāo),以9種N-亞硝質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度的比值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。9種N-亞硝胺的線性范圍均為0.5～37.5μg·kg-1,線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

取牛奶樣品10.0 g,加入10 mL 乙腈進(jìn)行提取,取上層有機(jī)相4.0 mL 進(jìn)行凈化、濃縮后測(cè)定,分別以3倍信噪比(S/N)、10 倍信噪比計(jì)算方法的檢出限(3S/N)和測(cè)定下限(10S/N),結(jié)果見表2。

表2 線性參數(shù)、檢出限和測(cè)定下限Tab.2 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.4 精密度與回收試驗(yàn)

在牛奶樣品中加入適量N-亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,充分振蕩混勻,配制成加標(biāo)濃度水平為1.0,3.0,10μg·kg-1的加標(biāo)樣品,每個(gè)濃度水平配制6個(gè)平行樣品。按試驗(yàn)方法測(cè)定,計(jì)算回收率及測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表3。

表3 精密度與回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

表3 (續(xù))

由表3 可知:所得回收率為78.7%～124%,RSD 為1.3%～5.6%。

2.5 樣品分析

采購(gòu)市售牛奶樣品10份,按試驗(yàn)方法測(cè)定樣品中9種N-亞硝胺的含量,檢測(cè)結(jié)果顯示10份牛奶樣品中NDMA、NDEA、NDPA、NDPh A 等4 種組分檢出率分別為20%,60%,10%,70%,檢出量為0.028～0.487μg·kg-1,其余N-亞硝胺化合物未檢出。

本工作利用EMR-Lipid凈化技術(shù),建立了氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛奶中9種N-亞硝胺含量的方法。該方法采用保留時(shí)間與MRM 掃描質(zhì)譜雙重定性、內(nèi)標(biāo)法定量,具有樣品前處理簡(jiǎn)便、定性靈敏度高、定量準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn),適用于牛奶中9種N-亞硝胺組分的痕量分析。