祛喘膠囊質(zhì)量標準研究

王 婧

（江蘇省連云港市食品藥品檢驗檢測中心，江蘇 連云港 222000）

祛喘膠囊由白芷、辛夷、黃芪、炙甘草、紫河車等5 味藥材組方，有固本、祛喘、開竅之功效，臨床用于小兒哮喘緩解期的治療。白芷為方中君藥，以歐前胡素和異歐前胡素為代表的6，7－呋喃香豆素類化合物是其主要藥效成分［1－2］，具有解熱、消炎、止痛、抗驚厥、抑制腫瘤等藥理作用［3－6］。辛夷為方中臣藥，能發(fā)散風寒、通鼻竅［7］，常用于治療風寒感冒、鼻塞，其主要有效成分為揮發(fā)油、木脂素類和黃酮類化合物［8－9］，其中木蘭脂素含量較高，具有一定專屬性［10］。黃芪有提高人體免疫力、控制哮喘、降糖、抗衰老等作用［11－14］。黃芪甲苷是黃芪主要有效成分，屬皂苷類化合物，具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)、抗炎、抗病毒等藥理活性，可用于肺疾病、肝纖維化、糖尿病性腎病等的治療［15－16］。祛喘膠囊現(xiàn)行質(zhì)量標準（JSZBZ20090609Z）對制劑中5 味藥材均無定性定量評價方法，給小兒用藥帶來了安全隱患。本研究中采用薄層色譜（TLC）法對該制劑中的白芷、黃芪、炙甘草進行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測定其中歐前胡素、異歐前胡素和木蘭脂素的含量，為有效控制祛喘膠囊的質(zhì)量提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Linomat 5 型薄層點樣成像儀（瑞士Camag 公司）；HWS－28 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；SC－208A 型冰箱（河南新飛電器集團股份有限公司）；WG2003 型臺式干燥箱（中國重慶實驗設(shè)備場一廠）；Agilent 1260 型高效液相色譜儀，包括在線脫氣機、四元梯度泵、自動進樣器、G4212B 型DAD 檢測器，Agilent色譜工作站（安捷倫科技有限公司）；BT125D 型電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司，精度為十萬分之一）；SYWQ800 型超聲波清洗器（山東申儀電子科技有限公司）。

1.2 試藥

祛喘膠囊（A 醫(yī)院自制，批號分別為 20150428，20160519，20170502）；歐 前 胡 素 對 照 品 （批 號 為110826 －201616，含量為 99.6% ），異歐前胡素對照品（批號為110827－201410，含量為 99.7%），黃芪甲苷對照品（批號為 110781－201717，含量為96.9%），甘草次酸對照品（批號為 110723－201715，含量為 99.6%），木蘭脂素對照品（批號為 110882－201607，含量為98.4% ），白芷對照藥材（批號為 120945 － 200406），均購自中國食品藥品檢定研究院；硅膠G 薄層板（德國Merck 公司）；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

白芷：取樣品內(nèi)容物 1.0 g，精密稱定，加乙醚10 mL，超聲（功率為 700 W，頻率為 40 Hz，下同）處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 mL 使溶解，即得供試品溶液。取白芷對照藥材粉末1.0 g，精密稱定，同供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。取歐前胡素和異歐前胡素對照品各適量，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度均為1 mg／mL 的混合對照品溶液。按祛喘膠囊處方和工藝制備缺白芷的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。按2015 年版《中國藥典》（四部）TLC 法試驗，精密吸取對照品溶液2 μL 及對照藥材溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（30 ～60 ℃）－乙醚（3 ∶2，V ／ V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，詳見圖1 A。

黃芪：取樣品內(nèi)容物1.5 g，精密稱定，加水飽和的正丁醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，用氨試液洗滌2 次，每次10 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，即得供試品溶液。取黃芪甲苷對照品，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為1 mg／mL 的黃芪對照品溶液。按祛喘膠囊處方和工藝制備缺黃芪的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。按2015 年版《中國藥典》（四部）TLC 法試驗，精密吸取對照品溶液2 μL 及供試品溶液、陰性對照品溶液各4 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以二氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－水（2 ∶4 ∶2 ∶1，V ／ V ／ V ／ V）在 10 ℃ 以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，詳見圖1 B。

炙甘草：取樣品內(nèi)容物1.0 g，精密稱定，加鹽酸1.5 mL 及三氯甲烷 20 mL，加熱回流 50 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇1 mL 使溶解，即得供試品溶液。取甘草次酸對照品，加乙醇溶解制成質(zhì)量濃度為1 mg／mL 的甘草次酸對照品溶液。按祛喘膠囊處方和工藝制備缺炙甘草的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。按2015 年版《中國藥典》（四部）TLC 法試驗，精密吸取對照品溶液2 μL 及供試品溶液、陰性對照品溶液各4 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（30 ～60 ℃）－甲苯－乙酸乙酯－冰醋酸（10 ∶20 ∶7 ∶0.5，V ／ V ／ V ／ V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，詳見圖1 C。

2.2 歐前胡素、異歐前胡素含量測定

2.2.1 色譜條件

圖1 薄層色譜圖1.reference solution 2.reference medicinal materials solution 3 －5.test solution 6.negative reference solutionA. Angelicae Dahuricae Radix B. Astragali Radix C. Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Preparata cun MelleFig.1 TLC chromatograms

圖2 歐前胡素、異歐前胡素高效液相色譜圖1.imperatorin 2.isoimperatorinA. Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms of imperatorin and isoimperatorin

色譜柱：ShiseidoCapcellPAKC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇－水（75∶25，V／ V）；流速：1.0mL／min；檢測波長：249 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

取歐前胡素和異歐前胡素對照品各適量，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度均為20 μg／mL 的混合對照品溶液。取樣品內(nèi)容物2.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇50mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理45 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。以2.1 項下白芷陰性對照品溶液作陰性對照。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2.2 項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，色譜圖見圖2。結(jié)果陰性對照品溶液色譜中，在與歐前胡素和異歐前胡素對照品溶液色譜相同保留時間處無干擾峰，表明方法專屬性良好。

線性關(guān)系考察：取歐前胡素對照品10.52 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加甲醇溶解、定容并逐級稀釋成質(zhì)量濃度分別為 2.096，8.382，17.460，26.190，31.430，41.910 μg ／mL 的系列歐前胡素對照品溶液。稱取異歐前胡素對照品10.46 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解、定容并逐級稀釋成質(zhì)量濃度分別為 2.086，8.343，17.380，26.070，31.290，41.710μg ／mL的系列異歐前胡素對照品溶液。取 10 μL，按 2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（Y，μg／mL）為縱坐標、峰面積（X）為橫坐標進行線性回歸，得歐前胡素、異歐前胡素回歸方程分別為 Y1＝0.040 63 X1＋ 0.024 33，Y2＝ 0.050 40 X2＋ 0.057 18，r 均為 0.999 9（ n ＝ 6）。結(jié)果表明，歐前胡素、異歐前胡素質(zhì)量濃度分別在 2.096 ～ 41.910 μg ／mL 和 2.086 ～41.710 μg ／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

定量限、檢測限考察：分別精密量取質(zhì)量濃度為0.101 3 mg／mL 的歐前胡素對照品溶液和 0.106 9 mg／mL的異歐前胡素對照品溶液各適量，倍比稀釋，并按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，以信噪比（S ／ N） ＝10 ∶1，3 ∶1 時分別計算定量限、檢測限。結(jié)果歐前胡素、異歐前胡素的定量限分別為 0.040 52 μg 和 0.202 90 μg，檢測限分別為 0.014 18 μg 和 0.070 92 μg。

精密度試驗：取2.2.2 項下混合對照品溶液適量，按2.2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果歐前胡素、異歐前胡素峰面積的 RSD 均為0.2%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取 2.2.2 項下供試品溶液（批號為20170502）適量，分別于室溫下放置 0，4，8，10，12，18，24 h 時按 2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果歐前胡素、異歐前胡素峰面積的 RSD 分別為1.8%和2.0%（n ＝7），表明供試品溶液在室溫放置24h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復性試驗：稱取樣品（批號為20170502）內(nèi)容物適量，精密稱定，各 6 份，按 2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果歐前胡素、異歐前胡素含量的 RSD 分別為 1.8%和 1.9%（n ＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為20170502）內(nèi)容物適量，共9 份，分別加入高、中、低質(zhì)量濃度的對照品溶液，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率，結(jié)果見表1。

2.2.4 樣品中歐前胡素和異歐前胡素含量測定

取3 批樣品內(nèi)容物各適量，分別按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，平行測定3 次，記錄峰面積，并計算樣品含量。結(jié)果見表2。

2.3 木蘭脂素含量測定

2.3.1 色譜條件

色譜柱：ShiseidoCapcellPAKC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈 －水（40∶60，V／ V）；流速：1.0mL／min；檢測波長：278 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

2.3.2 溶液制備

取木蘭脂素對照品適量，加甲醇溶解制成質(zhì)量濃度為40 μg／mL 的木蘭脂素對照品溶液。取樣品內(nèi)容物2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入 70% 乙醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理45 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按祛喘膠囊處方和工藝制備缺辛夷的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

表1 歐前胡素和異歐前胡素加樣回收試驗結(jié)果（n ＝9）Tab.1 Results of the recovery test of imperatorin and isoimperatorin（n ＝9）

表2 樣品中歐前胡素、異歐前胡素和木蘭脂素含量測定結(jié)果（mg ／g，n ＝3）Tab.2 Content determination of imperatorin，isoimperatorin and magnolia in the samples（mg ／g，n ＝ 3）

2.3.3 方法學考察

專屬性試驗：取 2.3.2 項下 3 種溶液各適量，按2.3.1 項下色譜條件進樣測定，色譜圖見圖3。結(jié)果陰性對照品溶液色譜中，在與木蘭脂素對照品溶液色譜相同保留時間處無干擾峰，表明方法專屬性良好。

線性關(guān)系考察：取木蘭脂素對照品10.56 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加甲醇溶解、定容并逐級稀釋 成 質(zhì) 量 濃 度 為 4.156，16.630，31.170，51.960，69.270，83.130 μg ／mL 的系列木蘭脂素對照品溶液。取 10 μL，按 2.3.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（Y，μg／mL）為縱坐標、峰面積（X）為橫坐標進行線性回歸，得木蘭脂素回歸方程 Y ＝0.188 0 X ＋ 0.173 4，r ＝ 0.999 9（ n ＝ 6）。結(jié)果表明，木蘭脂素質(zhì)量濃度在 4.156 ～ 83.130 μg ／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

定量限、檢測限考察：精密量取質(zhì)量濃度為0.103 4 mg／mL 的木蘭脂素對照品溶液適量，倍比稀釋，并按 2.3.1 項下色譜條件進樣測定，以 S ／ N ＝ 10 ∶1，3 ∶1 時分別計算定量限、檢測限。結(jié)果木蘭脂素的定量限、檢測限分別為 1.037 3 μg 和 0.363 1 μg。

精密度試驗：取2.3.2 項下木蘭脂素對照品溶液適量，按2.3.1 項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果木蘭脂素峰面積的 RSD 為 0.40%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取樣品（批號為20170502）適量，依法制備供試品溶液，分別于室溫下放置 0，4，8，12，18，24，36，48 h 時按 2.3.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果木蘭脂素峰面積的 RSD 為 1.50% （n ＝ 8），表明供試品溶液在室溫放置48 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復性試驗：精密稱取樣品（批號為20170502）內(nèi)容物適量，共6 份，按2.3.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.3.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果木蘭脂素含量的 RSD 為 1.70%（n ＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為20170502）內(nèi)容物適量，共9 份，分別加入高、中、低質(zhì)量濃度的對照品溶液，按2.3.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.3.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結(jié)果見表3。

圖3 木蘭脂素高效液相色譜圖1.magnoliaA. Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.3 HPLC chromatogram of magnolia

表3 木蘭脂素加樣回收試驗結(jié)果（n ＝9）Tab.3 Results of the recovery test of magnolia（n ＝ 9）

2.3.4 樣品中木蘭脂素含量測定

取3 批樣品內(nèi)容物各適量，分別按2.3.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.3.1 項下色譜條件進樣測定，平行測定3 次，記錄峰面積，并計算樣品含量。結(jié)果見表 2。

3 討論

黃芪TLC 鑒別時根據(jù)相似相溶原理，用水飽和正丁醇萃取黃芪中皂苷類成分，白芷、炙甘草TLC 鑒別時通過超聲處理和加熱回流提取方式制備供試品，即可獲得理想潔凈的TLC 圖，操作簡便，且無多余損耗，制劑中歐前胡素、異歐前胡素、甘草次酸均得到了較好提取，最后展開的TLC 圖斑點清晰、明顯。

進行TLC 鑒別時，一般要求盡量采用對照品和對照藥材同時進行比對。本試驗中根據(jù)祛喘膠囊的處方工藝，白芷中有部分原粉入藥，因此選擇歐前胡素、異歐前胡素對照品和白芷對照藥材同時進行比對；而黃芪和炙甘草由于處方中水煎濃縮工藝，若選擇相應(yīng)對照藥材和對照品同時進行比對，則會出現(xiàn)供試品溶液TLC 圖僅顯示對照藥材中水溶性成分斑點的情況，故僅選擇黃芪甲苷、甘草次酸進行比對。

以往TLC 鑒別以手工點樣為主，個體差異較大，效果欠佳。本試驗中采用薄層點樣成像儀，可消除手工點樣的個體差異，保證點樣質(zhì)量。對供試品點樣量進行考察，主要從TLC 圖中各組分斑點分離效果、斑點清晰度方面分析，點樣量過少會導致部分組分斑點不顯現(xiàn)，而點樣量過多會引起部分組分斑點重疊，影響TLC 的分離效果。

測定歐前胡素和異歐前胡素含量的預試驗中，考察了甲醇 －水（75 ∶25，V ／ V），甲醇 －5 mmol／L 甲酸（75 ∶25，V ／ V），甲醇 － 1%冰醋酸（75 ∶25，V ／ V）流動相體系。當流動相為甲醇 －1%冰醋酸（75 ∶25，V ／ V）時，異歐前胡素峰與相鄰色譜峰未完全分離，不符合HPLC 的系統(tǒng)適用性分離度要求。當流動相為甲醇－5 mmol ／ L 甲酸（75 ∶25，V ／ V）時，HPLC 圖的基線不平，而流動相為甲醇 － 水（75 ∶25，V ／ V）時基線平穩(wěn)且歐前胡素、異歐前胡素峰與相鄰色譜峰分離度較好。測定單組分含量時，一般選擇其出現(xiàn)波峰吸收處的波長為檢測波長，本試驗中通過掃描，根據(jù)木蘭脂素光譜圖確定最佳檢測波長為278 nm。

綜上所述，本研究中所建立的標準可用于祛喘膠囊的質(zhì)量控制。