奧希替尼對(duì)大鼠脊髓損傷后血脊髓屏障通透性的影響

李在望 曹婷婷 王 倩 涂景梅 韓 晶

1.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院 深圳市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東深圳 518020；2.江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇鹽城 224001

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是一種嚴(yán)重的致殘性疾病，不僅給患者帶來巨大的身心損害，而且給家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)[1]。SCI 后的神經(jīng)功能缺損是由初始的機(jī)械暴力所致的組織損傷和繼發(fā)性損傷共同造成的[2]。而SCI 后繼發(fā)性損傷與血脊髓屏障的破壞密切相關(guān)[3]。血脊髓屏障（blood spinal cord barrier，BSCB）為血液與脊髓之間介導(dǎo)氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物交換的屏障結(jié)構(gòu)，與血腦屏障類似，對(duì)于維持內(nèi)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定具有重要意義[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）信號(hào)通路參與細(xì)胞屏障功能的調(diào)節(jié)，而微血管損傷與EGFR 過度活化密切相關(guān)[5]。目前有多個(gè)研究證實(shí)EGFR 抑制劑對(duì)中樞神經(jīng)損傷有保護(hù)作用[6-8]，然而相關(guān)機(jī)制尚未明確。奧希替尼是第3 代EGFR 抑制劑，具有良好的血腦屏障滲透性能有效的作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)[9]，為此，本研究應(yīng)用奧希替尼干預(yù)SCI 大鼠，觀察其對(duì)SCI 后BSCB 通透性和經(jīng)神功能缺損的影響，以探討EGFR 抑制劑對(duì)SCI 的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康8 周齡雌性SD 大鼠60 只，SPF 級(jí)，體重200～250 g，購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（蘇）2016-0010，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：201822084。動(dòng)物飼養(yǎng)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心。SPF 飼養(yǎng)環(huán)境：室溫22℃，相對(duì)濕度65%，晝夜交替時(shí)間12 h，自由攝食和飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)、造模、給藥、取材方案均取得暨南大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物管理中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與材料

奧希替尼（MedChemExpress 公司，貨號(hào)：HY-15772S）；伊文思藍(lán)（EB）染料（solarbi 公司，G5570）；BCA 蛋白定量試劑盒（北京康為世紀(jì)公司生物科技有限公司，貨號(hào)：CW0014）；鼠抗Albumin（Abcam，貨號(hào)：ab10241）；兔抗水通道蛋白-4（AQP-4）（Abcam，貨號(hào)：ab46182）；鼠抗β-actin（Abcam，貨號(hào)ab8226）；驢抗鼠熒光二抗Alexa Flour 488（Thermo Fisher Scientific，貨號(hào)：A-21202）；Hoechest 33342（Thermo Fisher Scientific，貨號(hào)：62249）。

1.3 大鼠SCI 模型的制備及分組

60 只8 周齡雌性SD 大鼠（200～250 g）按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（n=20）和SCI 模型組（n=40）。術(shù)前禁食12 h，采用1%戊巴比妥鈉40 mg/kg 腹腔注射進(jìn)行麻醉。備皮、消毒、鋪單，選取T9～11段，背部正中切口切開皮膚，分離各層皮下組織，咬除T9～11棘突及椎板，暴露T10段脊髓。假手術(shù)組大鼠不進(jìn)行打擊損傷，止血后，依次縫合豎脊肌、皮下組織及皮膚，碘伏清理局部皮膚，外用紅霉素預(yù)防感染。SCI 模型組大鼠以暴露的T10段脊髓為打擊點(diǎn)，應(yīng)用10 g 打擊棒自由落下（高度為1.25 cm）進(jìn)行打擊。打擊后立刻移開打擊棒，觀察到大鼠雙下肢痙攣抖動(dòng)、脊髓表面充血水腫（此為造模成功的特征）[10-11]，各組行肌肉和皮膚縫合。消毒、復(fù)溫，將大鼠放回籠中，按摩膀胱擠尿3 次/d。采用隨機(jī)數(shù)字表法將40 只SCI 模型大鼠分為損傷組和奧希替尼組，每組20 只。奧希替尼組給予濃度為0.4 mg/mL 奧希替尼溶液灌胃（2 mL/d），假手術(shù)組和損傷組給予生理鹽水灌胃（2 mL/d），三組均干預(yù)3 d。

1.4 脊髓組織含水量測(cè)定

大鼠SCI 后3 d 取各組大鼠（每組3 只）T10節(jié)段脊髓（以損傷灶為中心長(zhǎng)1 cm）組織，稱濕重，放入60℃恒溫干燥箱24 h，稱干重，脊髓含水量=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.5 Western blot 法檢測(cè)AQP-4 表達(dá)

各組大鼠（每組5 只）于傷后3 d 時(shí)快速剝?nèi)p傷節(jié)段脊髓組織，加人裂解液冰上孵育并徹底勻漿，離心后留取上清，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白；全濕式電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上；5%封閉液（1 g 奶粉+20 mL TBST）封閉2 h，分別加入一抗（兔抗AQP-4，1∶1000 稀釋）；內(nèi)參為β-actin（1∶500 稀 釋），4℃孵 育過夜。用TBST 溶液洗滌10 min×3 次；加入二抗（HRP 標(biāo)記羊抗鼠IgG，1∶1000稀釋），4℃過夜；TBST 洗膜10 min×3 次，加ECL 發(fā)光顯示液在暗室中攝像，凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.6 EB 染料滲漏實(shí)驗(yàn)

大鼠SCI 后3 d 將各組大鼠（每組3 只）腹腔注射2%EB 染料（溶于0.9%生理鹽水）6 h 后，采用1%戊巴比妥鈉40 mg/kg 腹腔注射進(jìn)行深度麻醉。大鼠仰臥位固定于泡沫板上，打開胸腹腔，生理鹽水心臟灌流，并采用4℃4%多聚甲醛（PFA）溶液300 mL 灌流固定脊髓組織，先快后慢，可見肢體僵硬，表示灌流成功[12]。然后取出脊髓組織，將脊髓組織依次放入4%PFA、20%、30%蔗糖溶液24 h 脫水，冰凍切片機(jī)切片，片厚20 μm，載玻片貼片，蓋玻片覆蓋，通過熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.7 免疫熒光檢測(cè)脊髓Albumin 含量

大鼠SCI 后3 d 將各組大鼠（每組5 只）麻醉、心臟灌流，冰凍切片機(jī)切片，片厚6 μm，載玻片貼片，放入切片盒中，放入-20℃冰箱儲(chǔ)存。取出載玻片，PBS清洗3 min×3 次，0.5%TritonX-100 破膜15 min，PBS清洗3 min×3 次，驢血清封閉1 h，加入鼠抗Albumin一抗，PBS 代替一抗作陰性對(duì)照，放入濕盒，4℃過夜。PBS 清洗10 min×3 次，加入驢抗鼠熒光二抗Alexa Flour 488（驢血清1∶200 稀釋）1 h，避光，PBS 清洗10 min×3 次，采用Hoechest 33342 染核，沖洗、封片，熒光顯微鏡觀察。

1.8 動(dòng)物行為學(xué)評(píng)分

在SCI 后第1 天和以后每周觀察各組剩余大鼠行為學(xué)的改變。共觀察8 周。應(yīng)用BBB 評(píng)分評(píng)定大鼠脊髓神經(jīng)功能，最小值為0 分，表示未見后肢運(yùn)動(dòng)；最大值為21 分，表示功能完全正常[13-14]。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)；重復(fù)測(cè)量采用重復(fù)測(cè)量方差分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脊髓含水量測(cè)定及AQP-4 表達(dá)

SCI 后3 d 損傷組脊髓含水量明顯高于假手術(shù)組（P ＜0.01），奧希替尼組含水量明顯低于損傷組（P ＜0.05）（圖1A）。損傷組AQP-4 蛋白表達(dá)量明顯高于假手術(shù)組（P ＜0.01），奧希替尼組AQP-4 蛋白表達(dá)量明顯低于損傷組（P ＜0.01）（圖1B～C）。

圖1 EGFR 抑制劑奧希替尼對(duì)SCI 后脊髓組織水腫及AQP-4 蛋白表達(dá)量的影響

2.2 EB 染料滲漏實(shí)驗(yàn)及熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

SCI 后3 d 脊髓組織假手術(shù)組無EB 染料聚集，損傷組EB 染料大量聚集于損傷處，奧希替尼組EB 染料聚集程度較損傷組輕（圖2A，見封三）。EB 染料在熒光顯微鏡綠色激發(fā)光下呈紅色，假手術(shù)組無明顯紅色熒光，損傷組可見大量熒光，奧希替尼組次之（圖2B見封三）。損傷組熒光強(qiáng)度明顯高于假手術(shù)組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01），奧希替尼組熒光強(qiáng)度明顯低于損傷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）（圖2C，見封三）。

圖2 EGFR 抑制劑奧希替尼對(duì)SCI 后EB 染料滲入脊髓組織的影響

2.3 免疫熒光測(cè)定白蛋白含量

SCI 后3 d 大鼠脊髓組織冰凍切片白蛋白免疫熒光染色，損傷組脊髓組織上白蛋白熒光強(qiáng)度較假手術(shù)組增強(qiáng)，而奧希替尼組熒光強(qiáng)度較損傷組減弱（圖3，見封三）。

圖3 EGFR 抑制劑奧希替尼對(duì)SCI 后白蛋白滲人脊髓組織的影響

2.4 大鼠運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分

SCI 前各組大鼠運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分完全正常，SCI 后1 d，假手術(shù)組評(píng)分完全正常，奧希替尼組與損傷組BBB 評(píng)分均為0 分，兩組大鼠損傷程度一致。重復(fù)測(cè)量方差分析顯示，損傷組總體BBB 評(píng)分明顯低于假手術(shù)組（F組間=16894.283，P組間＜0.001；F組間=413.918，P時(shí)間＜0.001；F交互=68.511，P交互＜0.001），提示造模成功。SCI 后7 d，奧希替尼組與損傷組運(yùn)動(dòng)功能BBB評(píng)分均開始逐漸上升，而奧希替尼組BBB 評(píng)分上升趨勢(shì)更加明顯，重復(fù)測(cè)量方差分析顯示：奧西替尼組與損傷組組間比較、時(shí)間點(diǎn)比較及交互作用等方面的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F組間=11.798，P組間=0.014；F時(shí)間=86.504，P組間＜0.001；F交互=0.967，P交互=0.473）。見圖4。

圖4 SCI 后各組大鼠運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分

3 討論

SCI 后的神經(jīng)功能缺損由原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷兩種機(jī)制所致，而脊髓繼發(fā)性損傷與血脊髓屏障的破壞密切相關(guān)[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)EGFR 活化與細(xì)胞屏障功能的調(diào)節(jié)密切相關(guān)[5,15]。已有研究證實(shí)，EGFR過度活化可導(dǎo)致血脊髓屏障通透性明顯增加，這是引發(fā)繼發(fā)性損傷的重要原因[16-17]。而EGFR 抑制劑奧希替尼是第三代EGFR 酪氨酸激酶抑制劑，能有效抑制EGFR 的過度活化，而且該藥能有效通過血腦屏障而作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)[18-19]，因此，本研究中應(yīng)用奧希替尼抑制BSCB 細(xì)胞EGFR 過度活化，以觀察其是否能減輕BSCB 的破壞并改善SCI 大鼠的神經(jīng)功能缺損。

脊髓含水量的測(cè)定可間接反映BSCB 破壞的程度[20]。研究證實(shí)，當(dāng)BSCB 損傷時(shí)AQP-4 蛋白表達(dá)量會(huì)明顯增高，因此通過檢測(cè)AQP-4 蛋白的表達(dá)情況也可檢測(cè)BSCB 的損傷情況[21-22]。在SCI 后檢測(cè)EB 和白蛋白的含量可以準(zhǔn)確判斷BSCB 通透性改變的程度[4]。該研究聯(lián)合應(yīng)用脊髓含水量測(cè)定、AQP-4 蛋白表達(dá)量檢測(cè)、EB 染料滲漏及脊髓中白蛋白含量測(cè)定等方法細(xì)致評(píng)估了奧希替尼對(duì)SCI 后BSCB 通透性的影響。本研究結(jié)果顯示，損傷組脊髓含水量、AQP-4蛋白表達(dá)量、EB 及白蛋白含量均明顯高于奧希替尼組，這提示奧希替尼可減輕SCI 后BSCB 的破壞。

同時(shí)，本研究還證實(shí)奧希替尼能有效促進(jìn)SCI 后大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。這與以前的EGFR 抑制劑干預(yù)SCI 的研究結(jié)果是一致的[7-8，23-25]。然而，EGFR 促進(jìn)SCI 恢復(fù)的機(jī)制一直尚未明確。本研究提示奧希替尼的治療作用與其能減輕BSCB 的破壞密切相關(guān)，因?yàn)锽SCB 的破壞在SCI 后繼發(fā)性損傷中起著關(guān)鍵性作用[3]。而BSCB 組成細(xì)胞EGFR 過度活化可導(dǎo)致血脊髓屏障通透性明顯增加[15,20]，故推測(cè)奧希替尼是通過有效抑制BSCB 組成細(xì)胞EGFR 的過度活化而減輕了BSCB 的通透性，進(jìn)而改善了由此導(dǎo)致的繼發(fā)性損傷。

綜上所述，EGFR 抑制劑奧希替尼可有效抑制大鼠SCI 后BSCB 的破壞并促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。該研究結(jié)果為臨床應(yīng)用EGFR 抑制劑治療SCI 提供了新的方法和思路。