柚皮苷對(duì)Aβ25-35 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞保護(hù)作用的代謝組學(xué)研究

張 悅徐占玲孫慧峰雷 霞劉國良姚 遠(yuǎn)張 寧*劉 斌*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種與衰老密切相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾?。?]，以認(rèn)知缺陷和神經(jīng)元喪失為特征，迄今缺少有效的治療藥物。所以，研發(fā)有效防治AD 的藥物是非常必要的。

AD 發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，β 淀粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ）被認(rèn)為是誘發(fā)AD 發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素［2]。近年來，黃酮類等天然多酚類物質(zhì)的抗氧化特性在對(duì)神經(jīng)退行性疾病方面潛在、有益的作用成為科學(xué)研究的重點(diǎn)［3]。柚皮苷全稱為柚皮素-7-O-新橙皮糖苷，是一種天然的二氫黃酮類化合物，以往對(duì)柚皮苷的研究大都集中在治療骨質(zhì)疏松［4]、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化［5]等方面?，F(xiàn)在，研究人員將注意力轉(zhuǎn)向柚皮苷的神經(jīng)損傷保護(hù)等方面。Okuyama 等［6]將富含橙皮苷和柚皮苷果汁的干燥粉末給予腦缺血小鼠，發(fā)現(xiàn)口服后可以顯著抑制腦缺血誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞死亡，具有改善小膠質(zhì)細(xì)胞活化的能力。Singh 等［7]灌胃給予腦出血小鼠不同劑量的柚皮苷，再對(duì)探討動(dòng)物進(jìn)行一系列行為測(cè)試，用強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)和水迷宮試驗(yàn)評(píng)估卒中后抑郁和記憶障礙，研究表明，柚皮苷可改善腦出血誘導(dǎo)的神經(jīng)認(rèn)知缺陷，還能通過下調(diào)海馬中乙酰基膽堿酯酶活性和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）信號(hào)傳導(dǎo)途徑來消除順鉑引起的認(rèn)知缺陷和膽堿能功能障礙［8]。由此可見，柚皮苷可能會(huì)成為治療神經(jīng)退行性疾病的佼佼者，但作用機(jī)制尚不清楚。

代謝組學(xué)以代謝產(chǎn)物或代謝網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ)探究常見復(fù)雜疾病的發(fā)病機(jī)制或宿主環(huán)境發(fā)病機(jī)制的相互影響，在臨床前和臨床研究上都有廣泛的應(yīng)用［9]。代謝體是基因-環(huán)境相互作用的最終產(chǎn)物之一，它能識(shí)別并鑒別AD 的病理生理特征［10]。氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）具有高分辨率、高靈敏度、有可供參考的標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫、可對(duì)代謝產(chǎn)物定性等特點(diǎn)，已經(jīng)成為代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)室的重要組成部分。

本研究首先采用Aβ25-35誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞建立細(xì)胞損傷模型，將柚皮苷作用于損傷模型，利用GC-MS 技術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行代謝組學(xué)研究，檢測(cè)并解析給予柚皮苷后Aβ25-35誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞內(nèi)小分子代謝物及相關(guān)分子通路的變化，為AD病理機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 柚皮苷（純度98%，批號(hào)LL60O53）購自北京百靈威科技股份有限公司。PC12 細(xì)胞（北京協(xié)和細(xì)胞資源中心）；Aβ25-35（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)基、雙抗、活性炭-葡聚糖苷處理的胎牛血清（美國HyClone 公司）；二甲基亞砜（DMSO）、噻唑藍(lán)（MTT）購于美國Sigma 公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器 Agilent 6890N 型氣相色譜儀、Agilent 5975B 型質(zhì)譜儀、DB-5MS 彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）（美國安捷倫公司）；MK3 型酶標(biāo)儀（上海熱電儀器有限公司）；IX-71-21PH 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；HF90 型二氧化碳培養(yǎng)箱（上海立新儀器有限公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng) PC12 細(xì)胞（大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞）在含10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中生長，37 ℃下通入5%的CO2進(jìn)行培養(yǎng)，每2～3 d 傳代1 次，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 MTT 法測(cè)定細(xì)胞活力 將細(xì)胞分為空白組（加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液）、Aβ25-35模型組（分別用10、20、40 μmol/L 的Aβ25-35處理PC12 細(xì)胞24 h）、給藥組（分別先給予柚皮苷1.0×10-3、1.0×10-2、1.0×10-1μmol/L處理2 h 后，再加入20 μmol/L Aβ25-35孵育24 h），每組6 個(gè)平行。

取對(duì)數(shù)生長的PC12 細(xì)胞，消化離心，棄掉上清，沉淀用DMEM 完全培養(yǎng)基重懸至均勻懸液，以2×104/mL 細(xì)胞濃度接種于96 孔培養(yǎng)板，放進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約24 h，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)期后吸棄舊的培養(yǎng)液，按照分組狀況加入相應(yīng)溶液（200 μL）孵育24 h 后加入MTT 溶液，每孔20 μL，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中再孵育4 h，取出，吸棄上清，每孔加入150 μL DMSO，在37 ℃恒溫振蕩器中振蕩10 min，充分溶解藍(lán)紫色甲臜結(jié)晶，用酶標(biāo)儀在570 nm 波長下進(jìn)行吸光度檢測(cè)，每個(gè)樣本3 次，取平均值。細(xì)胞增殖率=（OD實(shí)驗(yàn)組/OD空白組）×100%。

2.1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以AIA 格式文件收集獲得的原始數(shù)據(jù)，用MZmine 2.5 軟件進(jìn)行前處理，之后導(dǎo)入SIMCA-P軟件中進(jìn)行PCA 和PLS-DA 分析統(tǒng)計(jì)，VIP 預(yù)測(cè)以及SPSS19.0 軟件做t 檢驗(yàn)，篩選出潛在的代謝標(biāo)記物。PC12細(xì)胞吸光度值及增值率結(jié)果用SPSS 19.0 軟件統(tǒng)計(jì)。數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較使用單因素方差分析，組間均數(shù)兩兩比較使用LSD 檢驗(yàn)，S-N-K 法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后校正，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 GC-MS 分析

2.2.1 GC-MS 條件 色譜條件為DB-5Ms 彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.5 μm）；進(jìn)樣時(shí)溫度270 ℃；以高純氦氣為載氣；載氣體積流量1.0 mL/min，溶劑延遲3 min；分流采樣5∶1；進(jìn)樣1 μL。質(zhì)譜條件為四級(jí)桿溫度150 ℃；電離方式EI；離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描方式全掃描，掃描間隔0.2 s；電子倍增器電壓0.90 kV。細(xì)胞樣品梯度加熱程序?yàn)槌跏紲囟?0 ℃，運(yùn)行3 min，以10 ℃/min 升至180 ℃，5 ℃/min 升至290 ℃，運(yùn)行9 min。

2.2.2 細(xì)胞提取及衍生方法 取成對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，丟棄舊DMEM 完全培養(yǎng)基，用生理鹽水洗滌3 次，棄去生理鹽水，液氮淬滅，加入1.5 mL 乙腈-水（4∶1），用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到離心管中，渦旋，細(xì)胞經(jīng)超聲細(xì)胞破碎儀破碎（功率為20%，工作2 s，間歇2 s）7 min，4 ℃、4 000 r/min 離心15 min，去除蛋白等大分子物質(zhì)。取1.2 mL 上清液置于離心管中，在40 ℃下氮吹，殘余物用50 μL 甲氧胺鹽酸鹽（15 mg/mL）復(fù)溶，渦旋，30 ℃水加熱90 min，37 ℃下加入70 μL MSTFA，持續(xù)30 min，取上清進(jìn)行GC-MS 分析。

2.2.3 分組 空白組為PC12 細(xì)胞培養(yǎng)于新鮮的DMEM 完全培養(yǎng)基，不加Aβ；模型組為20 μmol/L Aβ25-35孵育PC12細(xì)胞24 h；給藥組為1.0×10-1μmol/L 柚皮苷孵育PC12 細(xì)胞2 h 后，加入20 μmol/L Aβ25-35后再孵育24 h。

2.2.4 數(shù)據(jù)提取 GC-MS 得到的原始數(shù)據(jù)利用自動(dòng)質(zhì)譜去卷積鑒定（AMDIS）系統(tǒng)以AIA 的格式導(dǎo)出文件，將其導(dǎo)入Matlab 軟件，得到有代謝物保留時(shí)間和相應(yīng)峰面積組成信息的峰表。

2.2.5 模式識(shí)別與差異表達(dá)代謝物鑒定 將獲得的峰表導(dǎo)入SIMCA-P 12.0 軟件，進(jìn)行主成分分析（PCA）和最小二乘法判別分析（PLS-DA），找到差異表達(dá)代謝物。再利用NIST 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對(duì)空白組和模型組共有的內(nèi)源性代謝物作鑒定，以匹配度＞70% 為衡量標(biāo)準(zhǔn)，得到可信的差異代謝物的結(jié)構(gòu)和名稱。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞增殖率測(cè)定 與空白組比較，20 μmol/L Aβ25-35作用于細(xì)胞24 h 后細(xì)胞增殖率下降（P＜0.01），并且增殖率隨著Aβ25-35終濃度的增加而減小，說明造模成功。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)合文獻(xiàn)［11]，最后選用20 μmol/L Aβ25-35作用PC12 細(xì)胞24 h 來制備AD 的體外細(xì)胞模型。見表1。

表1 不同濃度的Aβ25-35處理24 h 對(duì)PC12 細(xì)胞增殖率的影響（，n=6）

表1 不同濃度的Aβ25-35處理24 h 對(duì)PC12 細(xì)胞增殖率的影響（，n=6）

注：與空白組比較，＃＃P＜0.01。

由表2 可以看出，與Aβ25-35模型組比較，柚皮苷處理后PC12 細(xì)胞增殖率增加（P＜0.01），說明柚皮苷能夠保護(hù)細(xì)胞，起到抗Aβ 損傷的作用。

表2 柚皮苷對(duì)Aβ25-35損傷PC12 細(xì)胞增殖率的影響（，n=6）

表2 柚皮苷對(duì)Aβ25-35損傷PC12 細(xì)胞增殖率的影響（，n=6）

注：與空白組比較，＃＃P＜0.01；與Aβ25-35 20 μmol/L 組比較，**P＜0.01。

3.2 GC-MS 分析 利用GC-MS 法對(duì)樣品進(jìn)行掃描，得到細(xì)胞代謝樣本的總離子流圖，見圖1。根據(jù)各個(gè)化合物的質(zhì)荷比、保留時(shí)間、保留指數(shù)等進(jìn)行鑒定，共鑒定出152個(gè)化合物，包括氨基酸類、脂肪酸類、糖類等小分子成分。

圖1 PC12 細(xì)胞代謝物的GC-MS 基峰色譜圖

4 討論

PCA 分析顯示，各組樣品之間有較好的分離度，說明模型組使細(xì)胞代謝通路發(fā)生改變，即造模成功，通過三維PLS-DA 示意圖進(jìn)一步地證明了各組之間分離度良好。選取VIP 值＞1.0 且P＜0.05 的物質(zhì)，然后對(duì)照質(zhì)譜庫信息獲得27 個(gè)潛在生物標(biāo)記物，并對(duì)化合物含量變化進(jìn)行了分析，見表3。

表3 潛在生物標(biāo)記物信息（）

表3 潛在生物標(biāo)記物信息（）

注：↓表示下降，↑表示升高。與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

表3 顯示，模型組中氨基酸代謝途徑發(fā)生了變化，包括谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸等。谷氨酸是神經(jīng)遞質(zhì)GABA 合成的前體，也是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，從突觸囊泡釋放后將結(jié)合NMDA 受體激活細(xì)胞［12]；丙氨酸由丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶胺化而成，涉及丙氨酸、丙酮酸、α-酮戊二酸的相互轉(zhuǎn)化［13]；谷氨酸和丙氨酸參與細(xì)胞生物能量學(xué)，模型組丙氨酸水平較低，表明模型組存在能量缺乏和線粒體功能障礙［14]。以絲氨酸為原料合成甘氨酸和半胱氨酸，前者是一種神經(jīng)系統(tǒng)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，本研究中其含量發(fā)生了變化。以往發(fā)現(xiàn)在AD 大鼠模型中，海馬、頂葉皮層D-絲氨酸水平升高［15]；L-絲氨酸水平也有所上升；絲氨酸消旋酶產(chǎn)生L-絲氨酸，后者水平降低；苯丙氨酸是芳香族氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)，其改變?cè)诎V呆過程中起著關(guān)鍵作用［16]，表明模型組細(xì)胞內(nèi)氨基酸代謝紊亂。

高度不飽和脂肪酸可以引起脂質(zhì)過氧化，促進(jìn)神經(jīng)毒性的產(chǎn)生。參與脂質(zhì)代謝的差異代謝物有棕櫚酸、硬脂酸、蘋果酸和膽固醇，模型組細(xì)胞內(nèi)棕櫚酸、硬脂酸及膽固醇減少，蘋果酸增加，柚皮苷可以使這些代謝物的含量恢復(fù)到空白組水平。APP/PS1 小鼠組織中磷脂含量明顯下降，這與磷脂酶活性增加有關(guān)［17]。硬脂酸是磷脂形成的最豐富的脂肪酸，脂肪代謝異常會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜的功能異常。在以往對(duì)AD 患者血液的研究中，發(fā)現(xiàn)患者的棕櫚酸明顯低于正常組［18]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。有研究表明膽固醇異常與AD 發(fā)病有關(guān)，用T0901317 激活A(yù)PP/PS1 小鼠腦內(nèi)的肝X 受體，能使額葉皮層和海馬腦區(qū)膜膽固醇明顯降低，減少老年斑的沉積，改善小鼠記憶能力［19]，除了脂質(zhì)代謝發(fā)生變化還有許多與能量相關(guān)的代謝產(chǎn)物也發(fā)生了變化。

葡萄糖代謝、磷酸肌醇代謝與碳水化合物代謝有著密切的聯(lián)系，葡萄糖代謝異常是AD 典型病理特征［20]。本研究中與糖代謝相關(guān)的代謝物有檸檬酸、α-D-吡喃葡萄糖等，模型組à-D-吡喃葡萄糖和檸檬酸的含有量發(fā)生了變化，葡萄糖代謝出現(xiàn)異常。肌醇參與多種細(xì)胞功能，如信號(hào)傳導(dǎo)過程、細(xì)胞生長和分化等［21]，還是一種重要的膜成分，其腦衍生物參與突觸轉(zhuǎn)運(yùn)和神經(jīng)遞質(zhì)分泌，并調(diào)節(jié)自噬［22]。模型組中肌醇含量發(fā)生改變，說明碳水化合物代謝異常。

綜上所述，本研究以GC-MS 代謝組學(xué)為理論依據(jù)，對(duì)空白組、模型組和給藥組代謝物進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，篩選出可能的生物標(biāo)志物。Aβ25-35損傷組有多種代謝產(chǎn)物的含量發(fā)生了改變，這些物質(zhì)主要與氨基酸代謝、碳水化合物代謝及脂質(zhì)代謝等相關(guān)聯(lián)，說明柚皮苷主要通過影響多種氨基酸和能量代謝發(fā)揮對(duì)Aβ25-35損傷的PC12 細(xì)胞的保護(hù)作用。