伴生菌誘導(dǎo)的云南松揮發(fā)性化合物對云南切梢小蠹嗅覺行為影響研究*

馮丹，王藝璇，管國偉，袁瑞玲，陳鵬

(1.云南省林業(yè)和草原科學(xué)院，云南 昆明 650201；2.西南林業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650224)

小蠹蟲(Tomicus)危害是小蠹的蛀害及其伴生菌的協(xié)同侵染，共同打破寄主樹木對病蟲害抗御的結(jié)果[1]。小蠹蟲伴生菌(Fungi associated with bark beetle)，也叫藍(lán)污真菌(Blue stain fungi)是小蠹蟲在蛀干過程中攜帶的病原微生物。云南松(Pinusyunnanensis)受到這些病原微生物侵染后木質(zhì)部會留下藍(lán)變菌斑、失水斑和松脂斑[2]；韌皮部會形成一個(gè)長橢圓形的、棕褐色、濕潤的壞死斑塊，能夠幫助小蠹蟲成功蛀害[3]。

植物受到昆蟲或病原微生物的危害后，自身會產(chǎn)生一些次生代謝產(chǎn)物以抵抗外界為害[4-5]。植物揮發(fā)性化合物是其中一類重要的次生代謝產(chǎn)物，其對昆蟲正常的生長發(fā)育、內(nèi)分泌、神經(jīng)和消化等系統(tǒng)有影響[6]。目前國內(nèi)外普遍認(rèn)為小蠹蟲的寄主選擇行為與森林生態(tài)系統(tǒng)中植物揮發(fā)性化合物的種類、濃度和組分等存在密切的關(guān)系[7-9]。近幾年來，研究人員主要關(guān)注伴生菌與寄主植物的相互關(guān)系，一些研究也初步證明了小蠹蟲伴生菌能改變寄主的揮發(fā)性化合物的種類和含量。潘悅等[10]接種一種小蠹蟲伴生菌(Ophiostomacanum)后分3個(gè)采樣時(shí)間觀察云南松萜烯類化合物的變化情況，結(jié)果表明接種30 d后云南松韌皮部中α-蒎烯、莰烯和β-月桂烯的絕對含量顯著高于對照，然而，接種時(shí)間的長短對云南松單萜化合物的影響不明顯。Pan Yue等[11]接種3種小蠹蟲伴生菌(Leptographiumwushanense,L.sinense和Ophiostomacanum)發(fā)現(xiàn)，伴生菌均能誘導(dǎo)寄主的6種單萜類化合物濃度增加，但只有接種L.wushanense10 d和20 d后能顯著提高云南松中α-蒎烯、莰烯、β-月桂烯、β-水芹烯和α-松油烯的濃度。

多臂嗅覺儀是一個(gè)8通道的實(shí)驗(yàn)裝置(圖1)，本項(xiàng)目組改進(jìn)了以往“Y”形嗅覺儀一次只能提供兩種氣味源供昆蟲選擇的缺陷，可以一次研究多種氣味源對小蠹蟲的影響，不僅排出野外其他人為干擾因素的同時(shí)還可以在室內(nèi)模擬野外復(fù)雜氣味環(huán)境進(jìn)行昆蟲寄主選擇試驗(yàn)。為了明確伴生菌誘導(dǎo)云南松揮發(fā)性成分種類或組分的改變對小蠹蟲寄主選擇是否有影響，本研究運(yùn)用多臂嗅覺儀提供多種伴生菌誘導(dǎo)云南松改變的氣味源對云南松小蠹嗅覺行為進(jìn)行研究。在過去總是聚焦伴生菌與寄主植物相互關(guān)系的基礎(chǔ)上引入小蠹蟲。小蠹蟲既是攜帶和傳播伴生菌的宿主，也是造成云南松死亡的主要害蟲之一，是研究云南松與伴生菌相互關(guān)系中的另一個(gè)重要環(huán)節(jié)。因此，本研究從伴生菌-云南松-小蠹蟲入手，全面研究5種伴生菌對云南松揮發(fā)性化合物的影響，以及伴生菌誘導(dǎo)的云南松揮發(fā)性化合物對云南松小蠹嗅覺行為的影響，分析云南松、伴生菌、小蠹蟲三者間的相互關(guān)系，探索云南切梢小蠹(T.yunnanensis)的化學(xué)生態(tài)學(xué)防治方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

5個(gè)供試菌株YSL40317(O.canum)、SNE40724(O.ips)、YML50409(O.abietinum)、HLH40315(L.conjunctum)、HPA40513(L.yunnanensis)由云南省林業(yè)和草原科學(xué)院森林保護(hù)研究所提供。

1.1.2 供試成蟲

本試驗(yàn)供試?yán)ハx采自云南省陸良縣云南松純林，野外采集的云南松木段通過室內(nèi)飼養(yǎng)后獲得供試成蟲。嗅覺試驗(yàn)完成后，回收所有供試成蟲在體視鏡下鑒定，結(jié)果均為云南切梢小蠹。

1.1.3 供試植物

試驗(yàn)林分設(shè)在云南省林業(yè)和草原科學(xué)院的昆明樹木園內(nèi)(102.74°E、25.15°N,海拔1 955.80 m)。選擇一塊坡度20°，坡向西南向，郁閉度80%的云南松林樣地，在該樣地中選擇胸徑18～20 cm，樹齡20 a的健康的云南松18株。

1.2 儀器設(shè)備

Carboxen-PDMS萃取頭(黑色，Supelco，美國)；7890A/5975氣質(zhì)聯(lián)用儀(Agilent，美國)；多臂嗅覺儀(實(shí)用新型專利)。

1.3 揮發(fā)性成分測定

采用HS-SPME-GC-MS聯(lián)用儀(AGILENT，美國)測定小蠹蟲伴生菌誘導(dǎo)的云南松揮發(fā)性成分。樣品制備：取接種了伴生菌的云南松韌皮部組織(CK為未接種伴生菌的云南松韌皮部組織)1.0 g于20 mL頂空瓶中。將頂空瓶放置于80 ℃水浴中，用固相微萃取頭置于頂空瓶中進(jìn)行萃取，萃取時(shí)間為30 min。之后將固相微萃取頭插入氣相色譜進(jìn)樣口進(jìn)樣，時(shí)間為2 min，經(jīng)氣相色譜分離后用質(zhì)譜鑒定。

色譜條件 HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 um)，載氣為氦氣(純度為99.999%)，流速為1.0 mL/min，分流比為20︰1。升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0 ℃，保持2 min；以5 ℃/min的速率升溫至140 ℃；保持1 min。進(jìn)樣口溫度為280 ℃，進(jìn)樣量為2.0 μL，溶劑延遲1 min。

質(zhì)譜條件 電轟擊電離(EI)源，電離能量70 eV，傳輸線溫度280 ℃；掃描范圍為29～350 amu，質(zhì)譜檢索圖庫為Nist 11標(biāo)準(zhǔn)譜庫。

1.4 選擇行為測定

選擇行為測試裝置為自制的實(shí)用新型專利多臂嗅覺儀(ZL201721699322.5)，多臂嗅覺儀采用無色透明的玻璃制作，內(nèi)徑為2 cm，各氣味源通道和接蟲通道長20 cm,氣味源通道以20°的夾角等角分布。氣泵通過空氣過濾裝置(活性炭和蒸餾水)后連接多臂嗅覺儀，各裝置間用醫(yī)用硅膠管連接(圖1)。將不同的化合物用無水乙醇稀釋成濃度1 mg/mL備用，分別在2 cm×4 cm的滅菌濾紙上加入200 uL化合物，對照為等計(jì)量的無水乙醇，然后將濾紙放到多臂嗅覺儀的各個(gè)氣味瓶中，進(jìn)氣流量控制在250 mL/min，室內(nèi)溫度控制在25 ℃左右，測試期間用黑布遮光。采集饑餓成蟲300頭備用。每次將30頭成蟲放入多臂嗅覺儀的接蟲室后計(jì)時(shí)，10 min后記錄各氣味瓶中小蠹蟲的數(shù)量。重復(fù)10次，每次測試后順時(shí)針更換各氣味瓶的位置，并更換濾紙。試驗(yàn)結(jié)束后用95%乙醇沖洗整個(gè)裝置待用。

圖1 昆蟲嗅覺行為選擇的裝置示意Fig.1 olfactory behavior installation

1.5 云南切梢小蠹對氣味組合的行為反應(yīng)

運(yùn)用對云南切梢小蠹有較強(qiáng)引誘力的4種化合物(α-蒎烯、金合歡烯、4-烯丙基苯甲醚和長葉烯)，設(shè)置3種濃度梯度(0.5、1.0、2 mg/mL)進(jìn)行不同氣味組合對云南切梢小蠹引誘力的測定。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS軟件處理。云南切梢小蠹對揮發(fā)物的嗅覺選擇采用Dunnett-t法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。氣味源組合的正交表由SPSS軟件生成，云南切梢小蠹對氣味源組合的選擇的數(shù)據(jù)用Dunnett T3法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 伴生菌誘導(dǎo)的云南松揮發(fā)性成分

云南松接種小蠹蟲伴生菌后改變了云南松韌皮部中揮發(fā)性成分的相對含量和組成(表1)。與對照相比，接種5種不同的小蠹蟲伴生菌后，云南松韌皮部中α-蒎烯、β-蒎烯、4烯丙基苯甲醚、金合歡烯和β-月桂烯的相對含量發(fā)生了改變，其中α-蒎烯和β-月桂烯的相對含量增高，β-蒎烯、4烯丙基苯甲醚、金合歡烯的相對含量減少。云南松接種O.canum后韌皮部能產(chǎn)生3-蒈稀(40.03%±0.69%)和β-石竹稀(2.92%±0.05%)。L.conjunctum、O.ips和O.abietinum能誘導(dǎo)云南松韌皮部產(chǎn)生莰烯分別為(1.36%±0.19%、1.62%±0.11%、1.47%±0.05%)。除接種L.conjunctum以外，其他4種小蠹蟲伴生菌均誘導(dǎo)云南松不產(chǎn)生長葉烯。

表1 5種伴生菌誘導(dǎo)云南松韌皮部產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)成分及其含量Tab.1 Effects of 5 blue stain fungi on Pinus yunnanensis %

2.2 云南切梢小蠹對揮發(fā)物的嗅覺選擇

云南切梢小蠹對揮發(fā)物的嗅覺選擇結(jié)果見圖2。8種化合物與對照相比，4-烯丙基苯甲醚、金合歡烯、α-蒎烯和長葉烯對云南切梢小蠹的引誘力最強(qiáng)(P<0.01)，云南切梢小蠹的選擇率分別是19.5%、19%、17%和17%。3-蒈烯、莰烯和β-月桂烯對云南切梢小蠹的引誘能力與對照相比沒有顯著差異。云南切梢小蠹對β-蒎烯的沒有選擇性(0%)。

圖2 云南松次生代謝對小蠹蟲行為的影響注：選擇率為平均選擇率±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)； *表示P<0.05；**表示P<0.01。Fig.2 Effects of metabolism of P.yunnanensison bark beetles

2.3 云南切梢小蠹對氣味源組合的選擇

試驗(yàn)結(jié)果見圖3，與其他氣味源組合相比較，氣味源組合2123和3132對云南切梢小蠹的引誘能力最強(qiáng)(P<0.01)，分別為23.67%和24%；其次是氣味源組合3213(P<0.01)，云南切梢小蠹的選擇率為13.67%；氣味源組合1222、1333和2312對云南切梢小蠹有一定的引誘能力，云南切梢小蠹選擇氣味源組合1222的比率為10%，選擇氣源味組合1333的比率為10.67%，選擇氣味源組合2312的比率為8.33%，均高于不做選擇的小蠹蟲的比率2%。

圖3 4種化合物氣味源組合對小蠹蟲的影響Fig.3 Effects of 4 odor combinations on bark beetles

3 討論與結(jié)論

切梢小蠹伴生菌侵染致病機(jī)理是一個(gè)較為復(fù)雜的過程，本研究運(yùn)用固相微萃取和GC-MS聯(lián)用技術(shù)測定小蠹蟲伴生菌對云南松韌皮部揮發(fā)性次生代謝產(chǎn)物的影響。結(jié)果表明，不同的小蠹蟲伴生菌均能誘導(dǎo)云南松韌皮部的α-蒎烯和β-月桂烯的相對含量增高，β-蒎烯、4烯丙基苯甲醚、金合歡烯的相對含量減少，此外，不同的小蠹蟲伴生菌還能誘導(dǎo)云南松韌皮部的揮發(fā)性成分產(chǎn)生特殊的改變，如O.canum能誘導(dǎo)云南松產(chǎn)生3-蒈烯、β-石竹烯和莰烯等。本研究運(yùn)用上述試驗(yàn)結(jié)果的物質(zhì)作為氣味源，研究云南切梢小蠹對這些氣味源的嗅覺行為反應(yīng)。云南切梢小蠹對8種化合物有不同程度的響應(yīng)，4-烯丙基苯甲醚、金合歡烯、α-蒎烯和長葉烯對云南切梢小蠹具有較強(qiáng)的引誘能力，3-蒈烯、莰烯和β-月桂烯對云南切梢小蠹的引誘能力較弱，云南切梢小蠹對β-蒎烯的選擇率為0%。以不同濃度的4-烯丙基苯甲醚、金合歡烯、α-蒎烯和長葉烯作為氣味源組合，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)檢測云南切梢小蠹對以上4種化合物組合的嗅覺選擇,結(jié)果顯示：α-蒎烯2 mg/mL、金合歡烯1 mg/mL、4-烯丙基苯甲醚0.5 mg/mL和長葉烯2 mg/mL對云南切梢小蠹有較好的引誘作用。

小蠹-真菌共生關(guān)系的經(jīng)典理論認(rèn)為小蠹蟲伴生菌是導(dǎo)致寄主樹木死亡的關(guān)鍵[12]。一些研究認(rèn)為昆蟲尋找適宜的棲息地的信息信號來源于微生物，O.novoulmi釋放的揮發(fā)物對榆樹小蠹(Hyrurgopinusrufipes)有吸引力[13]；Xyleborusglabratus能被其共生菌的揮發(fā)性成分吸引[14]；ZhaoTao[15]發(fā)現(xiàn)小蠹蟲伴生菌通過自身合成雙環(huán)縮酮類(bicyclic ketals)信息素幫助云杉小蠹(Ipstypographus)成功地在健康寄主上定植，證實(shí)了小蠹-真菌趨同進(jìn)化的復(fù)合系統(tǒng)。本研究從小蠹、真菌、寄主三者相互關(guān)系的角度出發(fā)，通過接種小蠹蟲伴生菌后檢測寄主的揮發(fā)性成分，發(fā)現(xiàn)5種伴生菌均能改變寄主的揮發(fā)性成分，這些揮發(fā)性物質(zhì)可能影響云南切梢小蠹對寄主選擇。

云南切梢小蠹對寄主云南松的侵害分為兩個(gè)階段，在蛀梢期攻擊云南松的枝梢進(jìn)行補(bǔ)充營養(yǎng)，待性成熟后進(jìn)入交尾產(chǎn)卵期則攻擊云南松的樹干[16]。已有研究表明：在蛀梢期，云南切梢小蠹對云南松枝梢揮發(fā)物表現(xiàn)出較強(qiáng)的趨向反應(yīng)，而對云南松樹干的揮發(fā)物則表現(xiàn)出一定的驅(qū)避反應(yīng)，說明蛀梢期切梢小蠹屬昆蟲不僅對不同松屬樹種具有不同的選擇性，不同性成熟程度的切梢小蠹也對同一寄主不同部位的揮發(fā)物組合具有不同的嗅覺和行為反應(yīng)[17-19]。本試驗(yàn)在2020年6月開展，屬于云南切梢小蠹的新成蟲的蛀梢期，研究結(jié)果提示：α-蒎烯、4-烯丙基苯甲醚、金合歡烯和長葉烯對蛀梢期的云南切梢小蠹有較強(qiáng)的引誘力， 3-蒈烯、β-月桂烯的引誘力不強(qiáng)，β-蒎烯甚至對這個(gè)時(shí)期的云南切梢小蠹有一定的驅(qū)避作用。

不同的小蠹蟲攜帶伴生菌的方式和比率不同，有的小蠹蟲有專門的貯菌器可以攜帶真菌的孢子和菌絲，有的小蠹蟲則通過小蠹蟲體表攜帶伴生菌[20-22]；有的小蠹攜帶一種真菌；有的小蠹攜帶幾種真菌。而不同的伴生菌誘導(dǎo)寄主揮發(fā)性化合物組成和含量產(chǎn)生差異，從而影響小蠹蟲的嗅覺和行為選擇。本研究利用多臂嗅覺儀初步證實(shí)了一定比例的寄主揮發(fā)性氣味組成對云南切梢小蠹有較好的引誘力。但是，云南切梢小蠹帶菌比率與蠹害程度間存在一定的隨機(jī)性[23]，因此誘導(dǎo)云南松揮發(fā)性化合物的變化也是相對較復(fù)雜和隨機(jī)的。

綜上所述，伴生菌依靠小蠹蟲傳播，而小蠹蟲則通過伴生菌提高攻擊寄主的效果，并受到環(huán)境的影響，小蠹-真菌-寄主可能經(jīng)過長時(shí)間的進(jìn)化形成一個(gè)動態(tài)的可變的結(jié)構(gòu)關(guān)系，今后研究伴生菌-云南松的關(guān)系對小蠹蟲行為的影響，可以為小蠹蟲防治開發(fā)系列引誘劑提供科學(xué)依據(jù)。