氚水對(duì)λ-dsDNA結(jié)構(gòu)影響的拉曼光譜分析和DFT模擬

鄧 冰，董 亮，全 旖，王和義

中國工程物理研究院 核物理與化學(xué)研究所，四川 綿陽 621999

隨著核技術(shù)的迅速發(fā)展以及核能的廣泛應(yīng)用，特別是以國際熱核聚變實(shí)驗(yàn)反應(yīng)堆(ITER)為代表的國內(nèi)外可控?zé)岷司圩冄芯康拇罅Πl(fā)展，大量的氚將釋放進(jìn)入環(huán)境空間并且以HTO的形式進(jìn)入生態(tài)循環(huán)[1]。此外，福島核事故所產(chǎn)生的氚廢水量逐漸增加[2]，日本政府宣布將于2022年夏天開始，分批將百萬噸含氚廢水直接排入大海，這導(dǎo)致氚可能引起的生物效應(yīng)成為公眾最關(guān)心的問題[3-6]。雖然受氚污染的水排放到環(huán)境中引起的生物效應(yīng)可能相當(dāng)小，但是由于天然水占生物物質(zhì)的70%～90%，水分子是組成所有生物大分子整體的一部分也是細(xì)胞結(jié)構(gòu)的組成部分，因此HTO一旦進(jìn)入體內(nèi)就會(huì)自由和迅速地在整個(gè)生物體中擴(kuò)散，宏觀層面上氚在全身的水池中保持平衡；更重要的是氚可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)被結(jié)合到有機(jī)分子中，氚 β射線的短距離低能作用導(dǎo)致3H能量的吸收會(huì)即刻發(fā)生在3H核的附近，從而導(dǎo)致局部能量沉積，因此，微觀層面上氚在體內(nèi)各種有機(jī)化合物中的分布和作用不均勻[7-8]，氚原子的微小位置很可能是決定其生化后果的關(guān)鍵所在。而對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞效應(yīng)的敏感靶點(diǎn)是細(xì)胞DNA，已有研究充分證明了DNA損傷會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡、突變甚至癌癥的發(fā)生[9-11]。

由于3H的β發(fā)射的平均能量和最大能量分別為5.69 keV和18.6 keV，在水(或軟組織)中的平均范圍約為0.5 μm(500 nm)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于細(xì)胞的典型直徑(10～30 μm)，甚至小于細(xì)胞核的直徑(5～10 μm)。因此，評(píng)估氚在亞細(xì)胞水平造成的損傷是研究氚內(nèi)照射效應(yīng)的一個(gè)主要問題。由于氚發(fā)射的β粒子具有極低能量的電子但其線性能量轉(zhuǎn)移(LET)值高于由高能光子(例如外部γ射線)相互作用產(chǎn)生的電子 (約400個(gè)離子對(duì)/μm)，這一較高的LET可能會(huì)導(dǎo)致更大的致癌效果[12]。因此，氚β輻射與DNA的相互作用是目前關(guān)于氚內(nèi)照射生物效應(yīng)的研究重點(diǎn)，已有的研究主要集中在DNA堿基損傷、堿基丟失、雙螺旋斷裂和雙鏈斷裂[13]等方面。拉曼光譜為研究核酸的結(jié)構(gòu)表征提供了一定的優(yōu)勢。天然DNA在拉曼光譜中的帶歸屬在文獻(xiàn)[14-16]中得到了很好的描述。在最近的應(yīng)用中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，特定拉曼標(biāo)記帶的變化能夠提供有關(guān)DNA結(jié)構(gòu)變化的詳細(xì)信息[17-18]。該方法已經(jīng)用于區(qū)分二價(jià)陽離子與DNA的特異性和非特異性結(jié)合[19]，監(jiān)測DNA和DNA/金屬-離子配合物的熱變性[20]，以及測量基因組DNA在縮合態(tài)和非凝聚態(tài)中質(zhì)子/氘交換的動(dòng)力學(xué)研究[21-24]。

本工作利用拉曼光譜和密度泛函理論(DFT)模擬研究不同活度濃度1×1011Bq/L和1×109Bq/L HTO作用下，不同劑量(50 mGy～8.0 Gy)作用后，天然λ雙鍵脫氧核糖核酸(λ-dsDNA)結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)的變化。試圖闡釋HTO-λ-dsDNA相互作用的分子機(jī)制。比較不同劑量率的HTO引起的λ-dsDNA損傷的差異，以助了解HTO生物效應(yīng)的機(jī)制，為低劑量或低劑量率的HTO輻射后的隨機(jī)性效應(yīng)評(píng)估提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品制備

λ-dsDNA，美國Sigma-Aldrich。在0.2 mol/L NaCl中制備λ-dsDNA水溶液(約20 g/L)用于HTO和γ射線輻照實(shí)驗(yàn)。將含有4 mg λ-dsDNA的0.2 mL等體積試樣與HTO(中國工程物理研究院核物理與化學(xué)研究所，放射化學(xué)純度98%)混合。輻照后，將溶液在液氮中振蕩冷凍，然后在保溫瓶中運(yùn)輸。通過將樣品凍干，來解決拉曼光譜測量中小體積和濃縮的λ-dsDNA溶液成分復(fù)雜性的問題。未經(jīng)HTO或γ射線照射的標(biāo)準(zhǔn)樣品經(jīng)過上述相同處理程序制備。

1.2 輻照程序

1.2.1HTO輻照 通過不同活度濃度(1×109Bq/L和1×1011Bq/L)HTO分別照射λ-dsDNA溶液不同劑量(50 mGy～8 Gy)，持續(xù)時(shí)間為18.24 min～2 432 h。輻照后的樣品首先在4 ℃下保存24 h，在凍干前保存于-20 ℃下。

1.2.2γ射線輻照 λ-dsDNA溶液用中國工程物理研究院核物理與化學(xué)研究所的60Co源輻照。60Co源(最大活度3.7 TBq)發(fā)出的光子能量為1.25 MeV。γ射線的傳送劑量由校準(zhǔn)的監(jiān)視器控制，其輻照劑量為50 mGy、100 mGy和500 mGy，持續(xù)時(shí)間為1～10 min。

1.3 拉曼光譜

使用配備了20倍物鏡的Leica Research顯微鏡的拉曼光譜系統(tǒng)(Renishaw公司)進(jìn)行拉曼光譜測量。一個(gè)He/Ne激光系統(tǒng)，其激發(fā)線為532 nm，在樣品空間處的激發(fā)能量約為25 mW。每個(gè)樣品在室溫(21～23 ℃)下測量6個(gè)光譜累積然后取平均值。為了避免測量期間波數(shù)標(biāo)度所有可能的漂移，在樣品光譜的累積測量后1 s收集校準(zhǔn)光譜。拉曼數(shù)據(jù)的分析使用Origin 8.0軟件(美國Microcal Origin)，從不同劑量下測得的光譜減去凍干的非輻照λ-dsDNA光譜，獲得拉曼差異光譜。在減去之前，將所有光譜按比例縮放以在λ-dsDNA主干PO2對(duì)稱拉伸振動(dòng)的1 095 cm-1波段具有相等的強(qiáng)度。當(dāng)譜帶差異反映出其父代譜帶強(qiáng)度變化至少5%時(shí)，被認(rèn)為是有效的。

1.4 模擬計(jì)算

所有計(jì)算均使用高斯09程序[24]在DFT級(jí)別上進(jìn)行。先前的研究表明，混合元交換關(guān)聯(lián)M06-2X功能[25-27]在相互作用較弱的系統(tǒng)中表現(xiàn)良好。因此，使用M06-2X方法和6-311 ++ G(d，p)基組[28-31]進(jìn)行了幾何優(yōu)化，用以定位靜止點(diǎn)和過渡狀態(tài)(TS)。零點(diǎn)振動(dòng)能量(ZPVE)校正也應(yīng)用氣相中的相對(duì)能量。計(jì)算表明，B3LYP方法可以提供高度精確的能量，并且M06-2X/6-311 ++ G(d，p)水平將適合于研究系統(tǒng)。所有優(yōu)化結(jié)構(gòu)的振動(dòng)頻率均在同一水平上獲得，并且該種類的振動(dòng)頻率表征為最小值(無虛數(shù)頻率)或過渡態(tài)(唯一虛數(shù)頻率)。

2 結(jié)果與討論

圖1顯示了λ-dsDNA在不同活度HTO作用前后的拉曼光譜圖，拉曼波段的歸屬概述列于表1。

表1 λ-dsDNA在HTO和γ射線作用后相關(guān)波段的歸屬

如圖1所示，相較于1×1011Bq/L HTO輻射作用，核堿基的特征拉曼條帶在1×109Bq/L HTO作用100～500 mGy后發(fā)生更明顯的變化。在1×109Bq/L HTO 輻照100 mGy后可以看到，一些堿基和脫氧核糖的特征峰強(qiáng)度增加：1 463 cm-1(脫氧核糖)、1 303 cm-1(dC，dA)、1 185 cm-1(dG，dA，dC)、1 047 cm-1(脫氧核糖)、914 cm-1(脫氧核糖)和756 cm-1(dT，C2′-endo/anti)[39-41]，這些標(biāo)記帶的強(qiáng)度增加可歸因于λ-dsDNA通過特殊堿基對(duì)非堆積和相應(yīng)核苷中脫氧核糖構(gòu)象的轉(zhuǎn)變而部分變性[39,42]。特征峰1 056 cm-1表示兩個(gè)主要的核酸含量比例的變化，其強(qiáng)度的增加也證明1×109Bq/L HTO作用100 mGy 會(huì)導(dǎo)致堿基對(duì)非堆積作用。此外，1 150～1 720 cm-1波段的拉曼峰歸屬于堿基的電子結(jié)構(gòu)和堿基配對(duì)，其中1 200～1 600 cm-1波段區(qū)域被劃分為嘌呤和嘧啶的環(huán)振動(dòng)，是環(huán)電子結(jié)構(gòu)的敏感指標(biāo)[43-48]。相較于1×109Bq/L HTO 輻照100 mGy，輻照500 mGy后還會(huì)引起堿基歸屬峰1 575 cm-1(dA，dG)、1 371 cm-1(dT，dA，dC)、1 335 cm-1(dA，dG)、1 260 cm-1(dG，dC(NH2))強(qiáng)度的顯著增加，提示堿基對(duì)非堆積作用進(jìn)一步加強(qiáng)。除此之外，1×109Bq/L HTO輻照500 mGy后引起750～800 cm-1和1 050～1 100 cm-1區(qū)域的拉曼標(biāo)記帶強(qiáng)度的增加，兩個(gè)標(biāo)記帶與C5′-O5′-P(O2-)-O3′-C3′鏈中的磷酸酯轉(zhuǎn)角有關(guān)，強(qiáng)度的增加可能是λ-dsDNA螺旋構(gòu)象的部分改變引起的[44-49]。提示，隨著1×109Bq/L HTO與λ-dsDNA作用劑量的增加，堿基對(duì)非堆積作用增強(qiáng)并引起λ-dsDNA構(gòu)象的變化。

(a)：1——DNA，2——100 mGy，3——500 mGy，4——2 Gy，5——4 Gy，6——8 Gy；(b)：1——DNA，2——50 mGy，3——100 mGy，4——500 mGy，5——2 Gy，6——4 Gy

(a)：1——100 mGy，2——500 mGy，3——2 Gy，4——4 Gy，5——8 Gy；(b)：1——2 Gy，2——500 mGy，3——100 mGy，4——50 mGy，5——4 Gy

鍵長單位為?

(a)——ΔE=-9.67 kJ/mol，(b)——ΔE=-145.55 kJ/mol

(a)：1——DNA，2——100 mGy，3——500 mGy，4——50 mGy；(b)：1——50 mGy，2——100 mGy，3——500 mGy

同樣，從圖2還可以看到，1×1011Bq/L HTO與λ-dsDNA作用500 mGy后1 371 cm-1歸屬于dT內(nèi)環(huán)振動(dòng)的峰強(qiáng)度降低，而在1×109Bq/L HTO作用后一直沒有出現(xiàn)此類現(xiàn)象。同樣1×1011Bq/L HTO作用于λ-dsDNA后1 575 cm-1處波段強(qiáng)度持續(xù)減弱，而在1×109Bq/L HTO輻照后，該條帶強(qiáng)度持續(xù)增加，在4 Gy輻照后峰強(qiáng)才出現(xiàn)明顯減弱；提示1×109Bq/L HTO和1×1011Bq/L HTO與λ-dsDNA作用的區(qū)別在于，1×1011Bq/L HTO主要通過β射線的直接電離作用或質(zhì)子化作用導(dǎo)致堿基結(jié)構(gòu)的破壞從而引起λ-dsDNA主鏈的斷裂，而1×109Bq/L HTO主要通過自由基分子的間接作用導(dǎo)致堿基結(jié)構(gòu)、堿基對(duì)氫鍵損傷，從而出現(xiàn)堿基對(duì)非堆積效應(yīng)引起λ-dsDNA構(gòu)象的變化。然而，在更高劑量(4 Gy)的HTO作用下，堿基和λ-dsDNA主鏈的特征峰強(qiáng)度隨1×109Bq/L HTO作用劑量的增加出現(xiàn)更明顯的減弱和展寬，拉曼譜線的減少和展寬表明λ-dsDNA結(jié)構(gòu)組分的降解和有序構(gòu)象的丟失。因此，結(jié)果提示低劑量HTO的長期作用可通過自由基分子對(duì)λ-dsDNA產(chǎn)生更顯著的破壞作用。

此外，呋喃糖在λ-dsDNA螺旋鏈的構(gòu)成中起著重要的作用，盡管脫氧核糖在λ-dsDNA中給出較弱的拉曼譜線，這些譜線的特征不像核酸堿基的特征那么明顯。但還是可以利用脫氧核糖的振動(dòng)模式來識(shí)別輻射引起的呋喃糖和λ-dsDNA主鏈的變化[34-39, 53-54]。1×109Bq/L HTO作用2 Gy后，被指定為脫氧核糖振動(dòng)的914 cm-1的條帶處分裂成若干弱條帶，在910～970 cm-1區(qū)域出現(xiàn)了一些新的特征峰，表明了呋喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)的變化，而這一現(xiàn)象可能是T-H的同位素交換引起的。同樣的現(xiàn)象可以在1×1011Bq/L HTO作用2 Gy后看見，歸屬于dG環(huán)形呼吸振動(dòng)的峰的波數(shù)從681 cm-1移動(dòng)到694 cm-1，新波段的出現(xiàn)表示dG帶發(fā)生擾動(dòng)，提示dG中糖皺褶發(fā)生了變化[34]，特征歸屬dG呋喃環(huán)平面彎曲的新峰出現(xiàn)，提示可能是H-T的同位素作用的影響。此外，1 463 cm-1是脫氧核糖的兩個(gè)CH2費(fèi)米相互作用的拉曼標(biāo)記，具有輻射敏感性。1×109Bq/L HTO作用2～8 Gy后，其強(qiáng)度隨輻射劑量增加呈現(xiàn)依賴性消失，這可能是C-O或C-C鍵斷裂導(dǎo)致脫氧核糖結(jié)構(gòu)破壞的結(jié)果，該損傷能引起λ-dsDNA骨架單鏈斷裂[36]；該特征峰在1×1011Bq/L HTO作用后峰強(qiáng)度隨劑量增加在4 Gy時(shí)分裂為新的特征峰1 457 cm-1和1 470 cm-1，顯示高劑量率的HTO輻射可能引起構(gòu)象轉(zhuǎn)移或共價(jià)鍵的斷裂，從而導(dǎo)致脫氧核糖的干擾。因此，除了HTO β 射線的直接作用和自由基的間接作用，高劑量HTO還可以通過T-H的同位素交換作用導(dǎo)致脫氧核糖結(jié)構(gòu)的變化和λ-dsDNA骨架的斷裂。

對(duì)于T-H同位素交換反應(yīng)，計(jì)算表明HTO對(duì)λ-dsDNA結(jié)構(gòu)的作用主要發(fā)生在五元環(huán)的C2位置或CH2的C5位置，計(jì)算所獲得的T-H交換TS示于圖6。如圖6所示，通過包括兩個(gè)HTO分子的六元環(huán)氫遷移TS可以容易地進(jìn)行T-H交換。先前關(guān)于HTO對(duì)受氚污染的泵油中T-H同位素交換過程的影響研究[55]提出，TS相對(duì)能量的顯著降低可歸因于從4變?yōu)?時(shí)成環(huán)狀TS環(huán)應(yīng)力的降低。經(jīng)計(jì)算，T-H交換過渡態(tài)的相對(duì)能量在C2位為-28.35 kJ/mol，在C5位為-20.01 kJ/mol。該結(jié)果表明，當(dāng)一定劑量的HTO作用于λ-dsDNA結(jié)構(gòu)時(shí)，會(huì)發(fā)生T-H交換，從而破壞了λ-dsDNA結(jié)構(gòu)。但是，獲得的該能量遠(yuǎn)高于如上所述的N2…H2氫鍵裂解的能量，這與相對(duì)較高劑量的HTO會(huì)破壞λ-dsDNA結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果一致。

(a)——C2位，ΔE=-28.35 kJ/mol；(b)——C5位，ΔE=-20.01 kJ/mol

3 結(jié) 論

研究HTO的內(nèi)照射輻射生物效應(yīng)，就必須清楚地理解HTO在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中對(duì)生物大分子的損傷，以及這個(gè)損傷在生物空間、時(shí)間上的分布。細(xì)胞內(nèi)HTO輻射能量的吸收和傳遞、分子的激發(fā)和電離、自由基的產(chǎn)生和化學(xué)鍵的斷裂所涉及的生物物理和生物化學(xué)過程中的多種中間階段均會(huì)產(chǎn)生λ-dsDNA的損傷。在此背景下，比較不同劑量率HTO引起的λ-dsDNA損傷可能有助于理解HTO的內(nèi)照射輻射損傷的機(jī)制。

(1) 1×109Bq/L HTO在輻照時(shí)主要是電離輻射的間接作用為主，即由溶劑分子介導(dǎo)的電離輻射對(duì)溶解的λ-dsDNA起主要破壞作用。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到，在1×109Bq/L HTO的低劑量(100～500 mGy)作用下出現(xiàn)的堿基和脫氧核糖的特征峰強(qiáng)度增加，可歸因于水輻解的各種初級(jí)產(chǎn)物和次級(jí)產(chǎn)物導(dǎo)致的堿基對(duì)非堆積作用，并且它們對(duì)λ-dsDNA分子結(jié)構(gòu)具有一定的選擇性，主要破壞堿基間的氫鍵造成堿基不配對(duì)以及堿基結(jié)構(gòu)的變化，從而造成堿基對(duì)較好的解疊加，最終導(dǎo)致λ-dsDNA的部分變性。而1×109Bq/L HTO的高輻射劑量(4～8 Gy)作用導(dǎo)致拉曼特征峰強(qiáng)度降低更明顯，整個(gè)光譜的拉曼標(biāo)記帶分裂和展寬，表明通過自由基分子的長期作用更容易導(dǎo)致糖-磷酸主鏈或核堿基的局部變化。

(2) 1×1011Bq/L HTO 在低劑量短時(shí)間作用于λ-dsDNA產(chǎn)生的生物效應(yīng)類似于γ射線，主要通過射線直接的電離作用或質(zhì)子化作用導(dǎo)致堿基、特別是嘌呤環(huán)結(jié)構(gòu)的破壞從而引起λ-dsDNA骨架的斷裂。隨著HTO輻照劑量的增加，輻照作用時(shí)間增長，同樣出現(xiàn)了堿基對(duì)非堆積效應(yīng)。

(3) 脫氧核糖的特征拉曼峰在2～8 Gy HTO輻照后呈現(xiàn)拉曼標(biāo)記帶的分裂、新拉曼峰的出現(xiàn)以及特征譜線的劑量依賴性消失，說明高劑量HTO的長期作用可產(chǎn)生H-T的同位素交換作用，能造成呋喃糖環(huán)構(gòu)象轉(zhuǎn)移或共價(jià)鍵的斷裂，可引起λ-dsDNA骨架單鏈的斷裂。