人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)宮腔粘連大鼠子宮內(nèi)膜增殖與分化

汪沙，郭正晨，湯一群，段華

宮腔粘連（intrauterine adhesions，IUA）是指經(jīng)由反復(fù)機(jī)械創(chuàng)傷或感染破壞子宮內(nèi)膜基底層后內(nèi)膜修復(fù)障礙，引起宮腔內(nèi)纖維組織增生，導(dǎo)致宮腔部分或全部粘連閉塞的常見婦科疾病，主要引起月經(jīng)異常、周期性腹痛、不孕及反復(fù)流產(chǎn)等，是導(dǎo)致子宮性不孕癥的最常見原因，約25%～30%的不孕癥婦女患有IUA[1]。經(jīng)宮腔鏡宮腔粘連分離術(shù)（transcervical resection of adhesion，TCRA）是目前IUA 的經(jīng)典治療方法，雖然術(shù)后輔以人工周期、放置宮內(nèi)節(jié)育器、羊膜及球囊等措施預(yù)防再次粘連[2-5]，但未能有效恢復(fù)子宮內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)和生理功能，無法重建不孕女性生育能力。干細(xì)胞是一類能夠自我更新并具有多向分化潛能的細(xì)胞，尤其是存在于多種器官組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC），可在體外培養(yǎng)增殖，能夠在特定條件下分化成各類細(xì)胞。其中人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell，hUCMSC）存在于新生兒臍帶華通膠，與其他MSC 相比，具有獲取簡(jiǎn)便，來源豐富，易于分離培養(yǎng)，病毒感染風(fēng)險(xiǎn)低，免疫原性低，含有較長(zhǎng)的端粒酶，無因外界因素引起的DNA 損傷等諸多優(yōu)勢(shì)[6]，多向增殖分化潛能、組織損傷修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)性能優(yōu)越[7]，是細(xì)胞移植治療領(lǐng)域最具前景的MSC 之一。目前，已有大量研究將其應(yīng)用于治療肝腎纖維化、心腦血管疾病、器官缺血再灌注損傷等諸多領(lǐng)域[8-11]。然而，目前尚無hUCMSC 應(yīng)用于子宮內(nèi)膜再生障礙性疾病如宮腔粘連等領(lǐng)域的相關(guān)研究報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)通過建立IUA 大鼠模型，將hUCMSC移植至IUA 大鼠子宮中，觀察hUCMSC 能否在體內(nèi)存活并發(fā)揮作用，初步探索其對(duì)損傷子宮內(nèi)膜增殖分化的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 人臍帶標(biāo)本 健康足月剖宮產(chǎn)新生兒臍帶組織，產(chǎn)婦無傳染病等其他合并癥。于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院產(chǎn)科手術(shù)室收取長(zhǎng)約10 cm 臍帶組織。將新鮮標(biāo)本置于含青-鏈霉素及滅菌生理鹽水的標(biāo)本盒中，干冰降溫保存，2 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室處理。標(biāo)本取材經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，供者及家屬知情同意。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雌性SD 大鼠20 只（由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供），SPF 級(jí)，年齡9～11 周，體質(zhì)量200～250 g。飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，4～5 只大鼠為一籠，空氣流通，無噪音，12 h 明暗光交替照射，室溫（22±2）℃，相對(duì)濕度（55±2）%，自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCKK（京）2012-0001，相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作及手術(shù)方案經(jīng)由首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.1.3 主要試劑和儀器 Anti-Ki-67 antibody[SP6]:ab16667（英國(guó)Abcam 公司），Pan-Cytokeratin(H-240):sc-15367（美國(guó)Santa Cruz 公司）FITC，標(biāo)記山羊抗兔熒光二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、羅丹明標(biāo)記山羊抗小鼠熒光二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），流式抗體（CD29、CD34、CD90、CD73、CD105、HLA-DR，BD 公司美國(guó)），ABI 7500 熒光定量PCR 儀（美國(guó)ABI 公司），流式細(xì)胞分析儀（美國(guó)Beckman公司），倒置顯微鏡（日本Olympus 公司），正置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立 大鼠麻醉成功后，取下腹正中恥骨聯(lián)合上沿腹白線做2～3 cm 切口，逐層分離進(jìn)入腹腔，充分暴露子宮。沿左側(cè)（造模側(cè)）子宮上端作3 mm 橫切口，使用直徑2 mm 的眼科刮匙全面搔刮整個(gè)宮腔，直至出現(xiàn)宮壁粗糙感，并伴有刮匙進(jìn)入子宮凹凸感消失則可停止刮宮，生理鹽水沖洗宮腔，防止內(nèi)膜殘存，6-0 可吸收線縫合子宮切口；右側(cè)（未造模側(cè)）子宮作為自身對(duì)照，不作造模處理。關(guān)腹后放入籠內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.2.2 hUCMSC 分離、培養(yǎng)和鑒定 將采集的臍帶標(biāo)本剪成1 cm 左右的臍帶段后，仔細(xì)剔除臍帶外膜及臍動(dòng)靜脈，獲取華通膠組織,將其充分剪碎至1 mm×1 mm×1 mm 大小。采用組織貼壁法[12]進(jìn)行hUCMSC 原代培養(yǎng)后傳代培養(yǎng)。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)hUCMSC P3 細(xì)胞表面CD73、HLA-DR、CD29、CD90、CD34 和CD105 的表達(dá)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及干預(yù) 造模后14 d，將20 只造模大鼠隨機(jī)分為干細(xì)胞組和對(duì)照組2 組，每組10 只。大鼠麻醉后同造模方法作腹部切口充分暴露子宮。干細(xì)胞組于造模側(cè)子宮肌壁間多點(diǎn)注射hUCMSC 懸液0.5 mL（1×107/mL），對(duì)照組于造模側(cè)子宮肌壁間注射磷酸鹽緩沖液（PBS）0.5 mL，關(guān)腹后放入籠內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng)。干預(yù)后7 d 處死，收集2 組造模側(cè)子宮組織，肉眼觀察子宮大體形態(tài)，沿縱軸切開子宮并觀察宮腔形態(tài)，隨后平均分為2 份，分別置于4%中性甲醛固定液中用于切片染色，或凍存于-80 ℃冰箱，以備提取組織RNA。

1.2.4 hUCMSC 在大鼠子宮中的定植和分化檢測(cè) 采用hUCMSC 標(biāo)記物人核（Human Nuclei，HuNu）抗體對(duì)干細(xì)胞組和對(duì)照組造模側(cè)新鮮子宮組織進(jìn)行免疫熒光染色，觀察HuNu 的定性表達(dá)及分布情況。熒光顯微鏡下觀察到紅色熒光（HuNu），即為hUCMSC 在大鼠子宮組織中定植。采用HuNu抗體與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞標(biāo)記物角蛋白（CK）抗體或子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物波形蛋白（VIM）抗體共同行免疫熒光染色，觀察共表達(dá)情況。

熒光顯微鏡下觀察CK 及VIM 均呈現(xiàn)綠色熒光。若在HuNu 與CK 共染切片中，觀察到紅色熒光與綠色熒光共同表達(dá)于同一細(xì)胞，表明hUCMSC 分化為子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞；若在HuNu 與VIM 共染切片中，觀察到紅色熒光與綠色熒光共同表達(dá)于同一細(xì)胞，表明hUCMSC 分化為子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞。

1.2.5 增殖相關(guān)細(xì)胞因子在大鼠子宮中的表達(dá)檢測(cè) 對(duì)增殖細(xì)胞核抗原Ki-67 和CK 的單克隆抗體進(jìn)行免疫組化染色，CK 的陽性表達(dá)位于上皮細(xì)胞胞質(zhì)中，呈現(xiàn)棕黃色顆粒，Ki-67 陽性表達(dá)為細(xì)胞核呈深棕色。每張免疫組化染色切片隨機(jī)選取4 個(gè)200 倍視野，通過Image pro plus 軟件進(jìn)行圖像分析計(jì)算，取平均值作為平均光密度，觀察Ki-67 及CK 的蛋白表達(dá)情況。

采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)子宮組織中Ki-67 和CK 的mRNA 的表達(dá)水平（逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和引物見表1、2）。采用2-ΔΔCT相對(duì)定量法，計(jì)算目的基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量，ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct管家基因）實(shí)驗(yàn)組-（Ct目的基因-Ct管家基因）對(duì)照組。每個(gè)樣品重復(fù)3 次，取三者平均值。

表1 20 μL 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

表2 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用GraphPad Prism 7.0 軟件以及SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)；不服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IUA 大鼠模型的子宮內(nèi)膜組織學(xué)表現(xiàn)及宮腔剖視圖子宮內(nèi)膜組織在IUA 大鼠造模側(cè)子宮及未造模側(cè)子宮內(nèi)膜組織有明顯的表現(xiàn)差異：未造模側(cè)子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)清晰，可見腺上皮及腔上皮細(xì)胞呈單層柱狀排列，緊密連續(xù)，腺體數(shù)量多，分布均勻，間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量正常，排列有序（圖1A、C）；而對(duì)照組造模側(cè)子宮腔縮窄，內(nèi)膜腺體稀疏，結(jié)構(gòu)紊亂，皺褶減少，腔上皮缺失，間質(zhì)細(xì)胞減少，排列紊亂，間質(zhì)內(nèi)無細(xì)胞結(jié)構(gòu)區(qū)域增多（圖1B、D）；此外、IUA 大鼠未造模側(cè)子宮宮腔剖視圖可見形態(tài)規(guī)則，粗細(xì)均勻，顏色淡紅，光滑有彈性，血供豐富，剖視宮腔，見宮腔通暢，內(nèi)膜較厚，平整光滑，顏色淡紅（圖1E）；而造模側(cè)子宮宮腔剖視圖明顯表現(xiàn)為子宮形態(tài)欠規(guī)則，粗細(xì)不等，顏色蒼白，僵直彈性差，質(zhì)地較硬，沿縱軸剖開宮腔，見粘連帶形成，宮腔欠通暢，部分閉塞，內(nèi)膜變薄缺失，僵硬色白，表面凹凸不平（圖1F）。

圖1 IUA 大鼠模型的宮腔剖視圖及子宮內(nèi)膜組織學(xué)表現(xiàn)

2.2 hUCMSC 體外培養(yǎng)形態(tài)和鑒定采用組織貼壁法體外培養(yǎng)hUCMSC，第7 天可見組織塊周圍有細(xì)胞爬出，第14 天細(xì)胞已成片聚集。細(xì)胞形態(tài)呈典型長(zhǎng)梭形，成纖維細(xì)胞樣貼壁生長(zhǎng)，平行排列或漩渦狀生長(zhǎng)，形態(tài)相對(duì)均一，核仁清晰（圖2A）。傳代后的細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，貼壁較快，3～5 d 左右可再次傳代。凍存后復(fù)蘇的細(xì)胞形態(tài)與生長(zhǎng)狀態(tài)與未凍存無明顯差異。通過傳代培養(yǎng)，P3 細(xì)胞CD73、CD90、CD105 和CD29 的表達(dá)陽性率均＞95%，而HLA-DR 以及造血干細(xì)胞表面標(biāo)記CD34 表達(dá)陽性率＜5%（圖2B～H）。

圖2 hUCMSC 體外培養(yǎng)形態(tài)和鑒定結(jié)果

2.3 hUCMSC 在大鼠子宮中的定植移植后1 周，干細(xì)胞組可見少量紅色熒光（圖3A），對(duì)照組未見紅色熒光表達(dá)（圖3B）。干細(xì)胞組中，紅色熒光主要分布在靠近宮腔的子宮內(nèi)膜組織中，子宮肌層內(nèi)未見紅色熒光。

2.4 hUCMSC 在大鼠子宮中的分化干細(xì)胞組中，在HuNu 與VIM 共同染色切片中，發(fā)現(xiàn)紅色熒光與綠色熒光共同顯影于同一細(xì)胞（圖3C），而在HuNu 與CK 共同染色切片中，發(fā)現(xiàn)紅色熒光與綠色熒光不存在共顯于同一細(xì)胞的現(xiàn)象（圖3D）。

圖3 大鼠子宮組織免疫熒光染色

2.5 增殖相關(guān)細(xì)胞因子在大鼠子宮中的表達(dá)情況干細(xì)胞組的Ki-67 和CK 平均光密度和mRNA 表達(dá)均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表3。

3 討論

IUA 是婦科常見病，其引起的月經(jīng)異常、周期性下腹痛及繼發(fā)不孕等嚴(yán)重影響育齡期女性的健康，其中中重度IUA 即使行TCRA 恢復(fù)宮腔形態(tài)后，術(shù)后妊娠率仍不滿意，特別是IUA 復(fù)發(fā)的患者妊娠率更低，僅為7.1%[13]。有學(xué)者通過臨床病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，子宮動(dòng)脈栓塞術(shù)后IUA 患者行IUA 分離術(shù)后生殖預(yù)后差，其原因可能與子宮動(dòng)脈栓塞術(shù)后子宮血管灌注不良影響術(shù)后內(nèi)膜再生有關(guān)[14]。因此，促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生，修復(fù)受損子宮內(nèi)膜是改善IUA 患者癥狀，尤其是重建IUA 患者生育功能的基礎(chǔ)，是提高IUA 療效的重中之重。

3.1 IUA 大鼠模型的建立受倫理學(xué)的限制，對(duì)IUA 的研究需要建立穩(wěn)定的動(dòng)物模型。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于成功建立IUA 動(dòng)物模型的文獻(xiàn)相對(duì)較少，造模方法主要以物理性、化學(xué)性或雙重?fù)p傷為主，而通過理化損傷建立的模型并不適合模擬人類IUA 的研究。本研究表明，采用機(jī)械損傷法可成功建立大鼠IUA 模型，此模型可用于IUA 發(fā)病機(jī)制的不同研究，并為本研究進(jìn)一步探索hUCMSCs 在有機(jī)體中的移植途徑和對(duì)受損子宮內(nèi)膜的影響奠定基礎(chǔ)。

3.2 hUCMSC 的培養(yǎng)和鑒定本研究應(yīng)用組織貼壁法成功建立了hUCMSC 細(xì)胞系，并總結(jié)出以下經(jīng)驗(yàn)：臍帶組織要充分剪碎，均勻平鋪于皿底，培養(yǎng)最初的12 h，可將皿倒扣于培養(yǎng)箱，以減少細(xì)胞與皿底的黏附性，有利于細(xì)胞爬出，12 h 后應(yīng)少量加入培養(yǎng)液，以免使組織塊漂浮，放置培養(yǎng)箱后盡量減少翻動(dòng)。培養(yǎng)7 d 可見細(xì)胞爬出，14 d 細(xì)胞大量貼壁，倒置光鏡下可觀察到從初始貼壁到傳代后的典型MSC，細(xì)胞形態(tài)均一，呈紡錘梭形、成纖維細(xì)胞樣貼壁生長(zhǎng)。組織貼壁法簡(jiǎn)單可靠，分離出的細(xì)胞純度較高，傳代后細(xì)胞形態(tài)及增殖活性穩(wěn)定。流式細(xì)胞儀檢測(cè)傳代至第三代的細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞高表達(dá)MSC標(biāo)志物CD29、CD73、CD90 和CD105，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記物CD34 以及HLA-DR。培養(yǎng)的細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)及免疫表型方面均符合hUCMSC 特征[15]。

3.3 hUCMSCs 的示蹤及定植本研究將人來源的UCMSCs 移植入大鼠體內(nèi)，屬于異種異體移植，移植后直接采用HuNu 抗體染色，既可省去干細(xì)胞標(biāo)記過程，亦可簡(jiǎn)單、高效地追蹤到大鼠體內(nèi)的移植細(xì)胞。本研究觀察到紅色熒光染色的hUCMSC 可在大鼠受損子宮內(nèi)膜存活并主要分布在靠近宮腔的子宮內(nèi)膜組織中，并且在實(shí)驗(yàn)期間經(jīng)干細(xì)胞移植治療的大鼠均無明顯的急慢性的免疫排斥反應(yīng)發(fā)生。這可能得益于hUCMSC 低免疫原性的特點(diǎn)[16]。本研究雖采用人鼠異種移植方式，但由于hUCMSC 缺失能夠啟動(dòng)并誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的HLA-DR 表面標(biāo)記，因此異種移植存在天然免疫耐受。hUCMSC 這種天然免疫耐受的特性也為臨床干細(xì)胞異體移植提供了可能性。

3.4 hUCMSC 的移植途徑干細(xì)胞移植方式多種多樣，靜脈移植最常見，然而干細(xì)胞經(jīng)血液循環(huán)必將損失一部分，尤其是經(jīng)肺循環(huán)的首過效應(yīng)，將損失一大部分細(xì)胞。有研究顯示炎癥趨化因子CXCL12 可趨化干細(xì)胞遷移并定植于損傷部位[17]。此外，接受手術(shù)的大鼠正處于急性炎癥期，腹部切口及子宮內(nèi)膜損傷部位大量的炎癥介質(zhì)釋放入血，若此時(shí)將干細(xì)胞注射至血液循環(huán)中，干細(xì)胞受到促炎因子的趨化，一部分遷移至腹部創(chuàng)口，則遷移至子宮內(nèi)膜損傷部位的干細(xì)胞數(shù)量便會(huì)減少。因此本研究采用原位移植的方法，以期在損傷部位維持一定的細(xì)胞濃度，盡可能多地將hUCMSC 保留在子宮內(nèi)膜損傷部位。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)大鼠腹部創(chuàng)口基本愈合后，移植側(cè)子宮通過免疫熒光染色仍可檢測(cè)到hUCMSC 定植并存活于子宮內(nèi)膜中，并發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖能力較對(duì)照組顯著提升，表明hUCMSC 在IUA 大鼠體內(nèi)原位移植發(fā)揮了一定作用。

3.5 hUCMSC 對(duì)受損子宮內(nèi)膜的影響本研究通過檢測(cè)上皮細(xì)胞標(biāo)記物CK，發(fā)現(xiàn)無論在蛋白或基因水平，干細(xì)胞組的表達(dá)明顯升高。Ki-67 作為反應(yīng)細(xì)胞增殖活躍程度的指標(biāo)，在干細(xì)胞組的表達(dá)顯著上升。然而這種通過補(bǔ)充外源性的干細(xì)胞促進(jìn)受損內(nèi)膜再生修復(fù)的機(jī)制目前仍不清楚，可能有三種機(jī)制：①外源性干細(xì)胞分化為具有相應(yīng)功能的內(nèi)膜細(xì)胞，從而替代了原本的內(nèi)膜干細(xì)胞；②外源性干細(xì)胞通過分泌有益于組織修復(fù)的細(xì)胞因子促進(jìn)了殘留子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖分化；③外源性干細(xì)胞趨化自身骨髓MSC，進(jìn)而促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)。本研究通過觀察hUCMSC標(biāo)記物HuNu 與CK 的共染色情況，發(fā)現(xiàn)二者并不存在共表達(dá)于同一細(xì)胞的現(xiàn)象，說明hUCMSC 并未分化為子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。在HuNu 與間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物VIM 的共染色切片中，本研究發(fā)現(xiàn)HuNu 陽性的細(xì)胞VIM 均呈陽性表達(dá)，提示hUCMSC 有分化為內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的可能。然而，由于子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞缺乏特異性標(biāo)記物，hUCMSC 作為一種MSC 本身就可表達(dá)VIM，無法確切證明hUCMSC 是否分化為子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞。目前尚無研究表明hUCMSC 可在體內(nèi)分化為子宮內(nèi)膜細(xì)胞的相關(guān)文獻(xiàn)。本研究對(duì)干細(xì)胞的在體分化機(jī)制進(jìn)行了初步探索，未得到hUCMSC分化為子宮內(nèi)膜細(xì)胞的證據(jù)，分析原因可能是由于定植于損傷處的干細(xì)胞數(shù)量有限，觀察時(shí)間較短；體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜多變，影響因素眾多，能發(fā)揮替代功能的干細(xì)胞分化效率低下；不同組織或器官中干細(xì)胞的分化機(jī)制有差異。總之，hUCMSC 在體分化機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。因此，本研究認(rèn)為hUCMSC 很可能是通過旁分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)了自身內(nèi)膜組織的增殖修復(fù)，具體機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，hUCMSC 不僅具有MSC 的一般特征，還具有獨(dú)特的自身優(yōu)勢(shì)，使其在細(xì)胞治療異體移植領(lǐng)域前景廣闊，本實(shí)驗(yàn)將hUCMSC 應(yīng)用于修復(fù)IUA大鼠受損子宮內(nèi)膜，觀察到hUCMSC 可在損傷部位存活并定植，并初步探索了hUCMSC 對(duì)子宮內(nèi)膜增殖分化的影響，發(fā)現(xiàn)hUCMSC 可能并非經(jīng)分化為子宮內(nèi)膜細(xì)胞起作用，而是通過上調(diào)Ki-67 和CK 的表達(dá)改善組織修復(fù)微環(huán)境。